趙金云，金法祥，許文芳，許 鵬，童 丹

（紹興文理學(xué)院附屬醫(yī)院 紹興市立醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 紹興 312000）

非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculousMycobacterium，NTM）在自然界中廣泛存在，近年來，NTM感染率呈上升趨勢。NTM主要可引起人類肺部感染，尤其是在伴有慢性阻塞性肺疾病、既往結(jié)核、囊性纖維化、支氣管擴(kuò)張、獲得性免疫缺陷綜合癥和移植等相關(guān)危險(xiǎn)因素的情況下，其感染風(fēng)險(xiǎn)更大。NTM還可引起淋巴結(jié)、皮膚軟組織和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等其他部位感染[1-2]。由于NTM肺部感染的臨床癥狀及影像學(xué)特征與肺結(jié)核相似，很多情況下會(huì)因漏診而延誤治療，臨床上通常借助病原學(xué)檢測來進(jìn)行區(qū)分[3]。不同種類NTM耐藥譜不同，治療方案也存在差異，因此NTM的準(zhǔn)確鑒定對(duì)臨床治療具有重要意義。為了解紹興地區(qū)NTM肺部感染的流行情況，本研究對(duì)2017年7月—2018年7月臨床分離的NTM進(jìn)行分析。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集2017年7月—2018年7月紹興文理學(xué)院附屬醫(yī)院及各縣區(qū)醫(yī)院臨床樣本2 768例（排除重復(fù)及沒有完整結(jié)果記錄的樣本）。質(zhì)控菌株結(jié)核分枝桿菌H37RV敏感株（ATCC 27294）由浙江省疾病預(yù)防控制中心提供。

1.2 主要儀器與試劑

BioMixerⅡ芯片雜交儀、LuxScan10k-B微陣列芯片掃描儀（北京博奧生物有限公司）。羅氏培養(yǎng)基、藥物敏感性試驗(yàn)培養(yǎng)基、對(duì)硝基苯甲酸培養(yǎng)基、噻吩-2-羧酸肼培養(yǎng)基購自珠海貝索生物技術(shù)公司；分枝桿菌菌種鑒定試劑盒（DNA 微陣列芯片法）購自北京博奧生物有限公司，可鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及17種臨床常見的NTM。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng) 在臨床樣本中加入1～2倍體積的4% NaOH溶液，振蕩后靜置15 min，采用無菌吸管吸取100 μL分別接種于羅氏培養(yǎng)基、對(duì)硝基苯甲酸培養(yǎng)基和噻吩-2-羧酸肼培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3.2 菌種鑒定 按照分枝桿菌菌種鑒定試劑盒（DNA微陣列芯片法）操作說明書，通過核酸提取、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增和芯片雜交、洗滌干燥等步驟制備樣本芯片，最終通過芯片掃描儀及相應(yīng)軟件進(jìn)行結(jié)果的判讀。

1.3.3 比例法體外藥物敏感性試驗(yàn) 制備1 mg/mL菌懸液，分別稀釋成1×10-2與1×10-4mg/mL的菌液，再分別接種至含藥異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇、對(duì)氨基水楊酸、卷曲霉素、卡那霉素、丙硫異煙胺、氧氟沙星培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)4周后觀察結(jié)果。以耐藥率≥1%判為耐藥。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 樣本類型及患者臨床特征

2 768例臨床樣本中，痰液樣本1 761例、肺泡灌洗液樣本696例、纖維支氣管鏡刷檢物樣本299例、肺組織樣本12例。共分離出NTM 243株（8.77%）。243例NTM感染患者中，男性占77.37%，＜60歲的患者占65.43%；超過85.00%的患者同時(shí)患有其他疾病，患有慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴(kuò)張和肺炎的患者超過60.00%，見表1。有9例患者為結(jié)核分枝桿菌和NTM混合感染，其中1例為泛耐藥結(jié)核分枝桿菌合并NTM肺部感染。6例肺癌患者中，僅1例NTM肺部感染得到控制，3例病情惡化，2例死亡；3例獲得性免疫缺陷綜合癥患者均未能堅(jiān)持治療。

表1 243例NTM感染患者臨床特征

2.2 NTM菌種鑒定

采用基因芯片法將分離所得的243株NTM進(jìn)行菌種鑒定。居前3位的分別為胞內(nèi)分枝桿菌（62.14%）、鳥分枝桿菌（19.75%）、龜或膿腫分枝桿菌（8.64%）。見表2。

表2 243株NTM菌種分布

2.3 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

243株NTM對(duì)一線抗菌藥物的耐藥率均較高，除胞內(nèi)分枝桿菌和鳥分枝桿菌對(duì)乙胺丁醇的耐藥率分別為66.89%和62.50%外，NTM對(duì)其他一線抗菌藥物的耐藥率均高于80.00%，尤其是對(duì)異煙肼和鏈霉素，幾乎均為100.00%；而NTM對(duì)二線抗菌藥物的耐藥率要低于一線藥物，卡那霉素和卷曲霉素具有一定的抗菌作用，尤其是卡那霉素，常見NTM對(duì)其的耐藥率均低于75.00%。

表3 243株NTM的耐藥率

3 討論

NTM是一種條件致病菌，廣泛存在于水、土壤和氣溶膠中，可致免疫力低下者廣泛感染，輕者可致皮膚感染，重者會(huì)危及生命[1]。近年來，隨著糖尿病、肺結(jié)核、獲得性免疫缺陷綜合癥及免疫抑制治療患者的增多，NTM感染病例顯著增多。隨著臨床診斷技術(shù)的提高，NTM的檢出率也明顯增高[3]。NTM的種類和感染率存在著一定的地區(qū)差異性，且與氣候、環(huán)境有關(guān)，呈現(xiàn)出南方高于北方、沿海高于內(nèi)地、氣候溫和地區(qū)高于寒冷地區(qū)的流行特點(diǎn)[4]。NTM菌種鑒定的方法較多，傳統(tǒng)的表型鑒定分析和生理生化方法步驟較繁鎖、耗時(shí)長，且鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確。目前，對(duì)NTM進(jìn)行菌種鑒定的方法主要是基于PCR技術(shù)的分子生物學(xué)方法，其他方法還包括噬菌體生物擴(kuò)增法、高效液相色譜法、探針法及基因芯片法等，其中基因芯片法具有快速、簡便、準(zhǔn)確、敏感等優(yōu)點(diǎn)[5]。

本研究共分離出243株NTM，檢出率為8.77%，低于2010年全國平均水平（22.9%）和2015年廣州地區(qū)水平（19.1%），但高于2015年江蘇地區(qū)（2.35%）和2012年沈陽地區(qū)（1.87%）水平[6]。納入的病例中，以男性患者居多，占77.37%，且以年齡＜60歲的中青年為主；只有13.17%的患者僅為NTM肺部感染，而其他絕大多數(shù)患者同時(shí)患有其他疾病，約70.00%的患者患有其他肺部疾病，包括慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴(kuò)張、肺炎、肺結(jié)核和肺癌等。通過基因芯片技術(shù)對(duì)分離的NTM進(jìn)行菌種鑒定，胞內(nèi)分枝桿菌和鳥分枝桿菌是臨床感染最常見的NTM，超過80.00%；其次為龜或膿腫分枝桿菌，與ZHENG等[7]的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明，紹興地區(qū)堪薩斯分枝桿菌的檢出率要稍高于其他地區(qū)[8]，這也說明NTM感染存在一定的地區(qū)差異性。有研究報(bào)道堪薩斯分枝桿菌最易侵犯的部位是肺，常侵犯晚期獲得性免疫缺陷綜合癥患者[9]，與本研究分離自3例獲得性免疫缺陷綜合癥患者NTM均為堪薩斯分枝桿菌的結(jié)果一致。本研究還分離出偶然分枝桿菌、戈登分枝桿菌等不常見的分枝桿菌，一般認(rèn)為其很少引起肺部感染，常作為一類非致病性環(huán)境分枝桿菌污染水源及醫(yī)療器械等[10]。NTM由于種類不同，對(duì)抗菌藥物的耐藥性差異較大，從體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果來看，NTM對(duì)一線抗菌藥物均有著較高的耐藥率，尤其是對(duì)鏈霉素和異煙肼，幾乎達(dá)到了100.00%；而對(duì)二線抗菌藥物的耐藥率稍低，尤其是卡那霉素，分離率較高的4種分枝桿菌對(duì)其耐藥率均低于75.00%，而堪薩斯分枝桿菌對(duì)卡那霉素的耐藥率僅為31.25%。

綜上所述，NTM肺部感染已成為不可忽視的疾病，尤其是患有肺部基礎(chǔ)疾病的患者，更應(yīng)警惕其發(fā)生。NTM肺感染疾病與肺結(jié)核臨床癥狀相似，給臨床診斷帶來很大困難，并且NTM種類繁多，耐藥率高，不同種類的NTM耐藥譜有差異，這些情況加大了臨床確定治療方案的難度。因此，快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行菌種鑒定有助于臨床對(duì)患者進(jìn)行早期診斷及治療。