季天皓，陳軍毅，孟亞?wèn)|

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院皮膚科，上海 202150；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院檢驗(yàn)科，上海 202150）

銀屑病是常見的慢性炎癥性皮膚病，病理改變主要為角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖伴角化不全。目前認(rèn)為，銀屑病發(fā)生、發(fā)展的主要機(jī)制是免疫細(xì)胞輔助性T細(xì)胞（helper T cell，Th）1和Th2的比例失調(diào)，并且Th1過(guò)表達(dá)促炎細(xì)胞因子如干擾素-γ（interferon-gamma，IFN-γ）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-12和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α等[1-2]。

甲氨喋呤（methotrexate，MTX）是銀屑病的一線治療藥物，其機(jī)制主要是抑制免疫細(xì)胞活性，調(diào)節(jié)Th1和Th2細(xì)胞比例，但長(zhǎng)期使用存在一定副作用。中成藥復(fù)方青黛丸主要成分有青黛、土獲、丹參、白術(shù)、建曲等，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、止癢等作用。近年來(lái)，隨著臨床使用的增多，該藥已漸漸成為基層皮膚科治療銀屑病的首選藥物之一[3-4]，但對(duì)于中度以上銀屑病患者，往往需要聯(lián)合其他藥物一并使用，如MTX。銀屑病發(fā)生、發(fā)展的主要機(jī)制是Th1和Th2的失衡，目前尚不清楚復(fù)方青黛丸聯(lián)合MTX是否會(huì)通過(guò)降低IFN-γ、IL-12和增加IL-4等的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)銀屑病中Th1占優(yōu)勢(shì)的免疫狀態(tài)。因此，在本研究中，我們擬通過(guò)定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)復(fù)方青黛丸聯(lián)合MTX和單用MTX治療銀屑病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中GATA-3、T-bet、IL-4、IL-12和IFN-γ的表達(dá)，明確復(fù)方青黛丸聯(lián)合MTX對(duì)銀屑病患者PBMC中Th1和Th2相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響，開展銀屑病患者Th1/Th2失衡狀態(tài)的臨床研究，評(píng)估臨床表型與Th1、Th2細(xì)胞因子表達(dá)之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

根據(jù)銀屑病患者皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)評(píng)分（psoriasis area and severity index，PASI），選取評(píng)分＞10的尋常型銀屑病患者。排除有以下情況的患者：1型糖尿病；肥胖[體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）＞25]；心血管疾??；妊娠狀態(tài)；有肝病史或研究期間飲酒；外用過(guò)MTX；2個(gè)月內(nèi)接受過(guò)光療；2個(gè)月內(nèi)服用過(guò)復(fù)方青黛丸或非處方銀屑病治療藥物；因任何原因放棄參與本研究[5]。最終納入50例斑塊型銀屑病患者，其中男32例、女18例，年齡為21～59歲。

1.2 方法

以單用MTX治療者為對(duì)照組，復(fù)方青黛丸聯(lián)合MTX治療者為治療組。2個(gè)組受試者都經(jīng)MTX治療，持續(xù)8周。在8周內(nèi)，治療組的受試者同時(shí)服用復(fù)方青黛丸（3次/d，6 g/次）。在研究開始（基線）和結(jié)束時(shí)均通過(guò)PASI評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估銀屑病嚴(yán)重程度。本研究將PASI-75設(shè)為閾值和臨床有效性指標(biāo)[6]。此外，收集和統(tǒng)計(jì)受試者年齡、發(fā)病年齡、體質(zhì)量、BMI和皮膚生活質(zhì)量指數(shù)（dermatology life quality index，DLQI），DLQI主要通過(guò)皮膚病生活質(zhì)量表評(píng)價(jià)2個(gè)組患者日?；顒?dòng)、癥狀、人際關(guān)系、工作和學(xué)習(xí)、感受情況等5項(xiàng)生活質(zhì)量評(píng)分，分?jǐn)?shù)越低說(shuō)明患者生活質(zhì)量越優(yōu)。

1.3 分離PBMC

收集每例受試者4mL血液至乙二胺四乙酸采血管中。將血液樣品在室溫下放置60 min，然后以978×g離心20 min。使用Ficoll（比重：1.077）從血液樣品中分離PBMC。將分離的細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液洗滌2次。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定T-bet、GATA3、IFN-γ、IL-12和IL-4的mRNA表達(dá)。使用Trizol（瑞士羅氏公司）從PBMC中分離總RNA。采用Prime-Script TM、RT試劑盒（日本TaKaRa公司）合成cDNA。在ABI 7000熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）上進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR，引物及探針序列見表1。將甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為樣品標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)源性對(duì)照。目標(biāo)基因的表達(dá)對(duì)照GAPDH的表達(dá)以計(jì)算相對(duì)定量2-ΔΔCt，并將結(jié)果表示為倍數(shù)變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件及GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以±s的形式表達(dá)。采用Mann-Whitney檢驗(yàn)或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)來(lái)比較2個(gè)組之間轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子的表達(dá)。Pearson相關(guān)檢驗(yàn)用于評(píng)估PASI評(píng)分與Th1和Th2標(biāo)記之間的相關(guān)性。用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)以評(píng)估年齡、發(fā)病年齡、體質(zhì)量、BMI、DLQI、T-bet、GATA3、IFN-γ、IL-12、IL-4表達(dá)之間的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物及探針序列

2 結(jié)果

2.1 治療組和對(duì)照組患者臨床特征

本研究將50例銀屑病患者分為2個(gè)組，對(duì)照組男17例、女8例，治療組男15例、女10例。2個(gè)組患者的性別、年齡、體質(zhì)量和BMI差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對(duì)照組和治療組研究前PASI評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.70），治療8周后，治療組的PASI評(píng)分顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。對(duì)照組的8例受試者及治療組的12例受試者在第8周達(dá)到PASI-75（P＜0.05）。對(duì)照組與治療組在基線時(shí)及治療8周后DLQI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 2個(gè)組患者臨床特征比較

2.2 Th1、Th2細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子變化

對(duì)照組中Th1細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12和T-bet的mRNA表達(dá)均高于治療組（P＜0.01、P＜0.05和P＜0.05），見圖1。以PASI-75為閾值對(duì)照組和治療組之間的各Th1細(xì)胞因子表達(dá)差異進(jìn)行研究。治療組中PASI評(píng)分變化＞75%的受試者IFN-γ的表達(dá)低于對(duì)照組（P＜0.05），同時(shí)也有更好的臨床改善。但治療組和對(duì)照組受試者之間IL-12和T-bet的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療組中IL-4和GATA3的表達(dá)高于對(duì)照組（P＜0.05），見圖2。PASI評(píng)分變化＞75%的治療組受試者GATA3及IL-4的mRNA表達(dá)高于同條件對(duì)照組受試者。Th2的GATA3及IL-4的表達(dá)與PASI評(píng)分變化之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。此外，臨床表現(xiàn)的改善與IL-4及GATA3的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

圖1 對(duì)照組和治療組IFN-γ、IL-12和T-bet的相對(duì)基因表達(dá)

圖2 對(duì)照組和治療組IL-4和GATA3的相對(duì)基因表達(dá)

表3 對(duì)照組和治療組受試者之間IL-12和T-bet表達(dá) ±s

表3 對(duì)照組和治療組受試者之間IL-12和T-bet表達(dá) ±s

2.3 Th1、Th2細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子變化與臨床特征的相關(guān)性

IFN-γ、IL-12、T-bet、IL-4及GATA3 mRNA的表達(dá)與年齡、發(fā)病年齡、體質(zhì)量、BMI及DLQI之間均無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。見表4。

表4 對(duì)照組和治療組其他變量與細(xì)胞因子之間的相關(guān)性

3 討論

T-bet和GATA-3已被發(fā)現(xiàn)能影響Th細(xì)胞的分化。T-bet是T-box基因中Tbr1亞家族的成員，在Th1分化中起重要作用。T-bet控制Th1IFN-γ的表達(dá)，并抑制Th2 IL-4的產(chǎn)生，使平衡從Th2向Th1偏移。另外，Th2途徑GATA-3能促進(jìn)Th2的分化及Th2相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。T-bet和GATA-3之間的相對(duì)表達(dá)會(huì)影響Th1/Th2途徑，目前已在數(shù)種免疫性疾病中發(fā)現(xiàn)了這個(gè)現(xiàn)象，包括特應(yīng)性皮炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和銀屑病[7-8]。有報(bào)道提示，口服復(fù)方青黛丸會(huì)影響Th1和Th2細(xì)胞因子的表達(dá)，患者臨床表現(xiàn)與免疫通路的特異性調(diào)節(jié)有關(guān)[9]，當(dāng)平衡傾向Th2時(shí)伴隨GATA3和IL-4表達(dá)的增加以及IFN-γ、IL-12和T-bet表達(dá)的減少。本研究結(jié)果與關(guān)于復(fù)方青黛丸作用的研究結(jié)果（促炎細(xì)胞因子表達(dá)降低，使平衡從Th1向Th2細(xì)胞途徑偏移）[10-12]一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，PASI評(píng)分變化＞75%的患者的GATA3和IL-4的表達(dá)水平高于IFN-γ、IL-12和T-bet的表達(dá)水平。因此，我們認(rèn)為臨床表現(xiàn)改善的患者常伴隨Th1因子下調(diào)和Th2因子上調(diào)。相較于健康人，銀屑病患者血清中IFN-γ表達(dá)更高，而IL-4表達(dá)更少，且IFN-γ水平與PASI評(píng)分相關(guān)。此外，使用復(fù)方青黛丸進(jìn)行治療后，銀屑病患者血清IFN-γ水平降低的同時(shí)PASI評(píng)分也會(huì)減小。調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡可能是通過(guò)T-bet和GATA-3介導(dǎo)的。有研究發(fā)現(xiàn)銀屑病患者的PBMC中Th1細(xì)胞因子表達(dá)更顯著，其中T-bet的mRNA表達(dá)高于健康人，而GATA-3的mRNA表達(dá)則低于健康人[11-13]。

綜上所述，復(fù)方青黛丸可能通過(guò)加強(qiáng)T淋巴細(xì)胞功能、參與先天性免疫應(yīng)答的一種或多種組分，或通過(guò)阻斷銀屑病患者炎性細(xì)胞因子的活性來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答。復(fù)方青黛丸通過(guò)抑制銀屑病患者促炎細(xì)胞因子IL-1、IFN-γ和TNF-α，同時(shí)增強(qiáng)Th2因子IL-4、IL-5的分泌來(lái)調(diào)節(jié)一部分免疫應(yīng)答，本研究將復(fù)方青黛丸治療銀屑病的臨床表現(xiàn)及Th1/Th2免疫模式聯(lián)系起來(lái)，我們認(rèn)為，復(fù)方青黛丸治療銀屑病是符合衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)發(fā)展的療法。然而，樣本量較少是本研究的不足之處，相關(guān)結(jié)果需要更多樣本并進(jìn)行更大規(guī)模的研究數(shù)據(jù)來(lái)證實(shí)。建議進(jìn)行更敏感的分析，如流式細(xì)胞術(shù)，以確定治療后銀屑病患者PBMC的相關(guān)亞群，或有助于進(jìn)一步了解銀屑病的免疫機(jī)制。