溫培楠，林明恕，金 冕，徐賢綢，陳龍云

1.浙江省平陽人民醫(yī)院普外科，浙江 溫州 325400；

2.湖北中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，湖北 武漢 430065

胃癌作為全球范圍內(nèi)主要的公共衛(wèi)生問題之一，2017年胃癌在中國癌癥發(fā)病率中排名第二，在癌癥相關死亡的原因中位列第四。早期胃癌缺乏典型臨床癥狀，同時胃癌的血供極為豐富，早期就可能發(fā)生腹腔轉移或遠處轉移，從而導致胃癌患者的預后較差［1-2］。盡管在早期診斷和治療方面做出了巨大努力，但應用于臨床胃癌的傳統(tǒng)化療藥物效果不甚理想，目前抑制腫瘤新生血管形成已成為研發(fā)抗癌藥物的新方向，已有諸多抗血管生成靶向藥物如多靶點酪氨酸激酶抑制劑-索拉非尼和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）/血管內(nèi)皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）單抗-阿西替尼等應用于臨床胃癌化療，取得顯著療效，但大多靶向藥物均存在一定程度的不良反應，同時很多患者對靶向藥物存在不同程度的耐藥，提高總體生存率的進展相對緩慢［3-4］。尋找低毒、高效的抗胃癌藥物以改善胃癌患者預后具有十分重要的臨床意義。

二氫楊梅素（dihydromyricetin，DHM）是從延胡索屬的葉中分離的一種氫化黃酮醇類有機物，藥理研究表明，DHM具有對抗炎癥因子、抑制細菌生長和舒張小動脈等多種功效［5-6］。此外，DHM還可抑制肺癌、肝癌和結腸癌等多種惡性腫瘤生長，并促進細胞凋亡，同時對正常人體細胞幾乎沒有細胞毒效應［7-8］，從而為天然產(chǎn)物應用于臨床抗腫瘤藥物提供了更多的選擇。然而，DHM對惡性腫瘤血管生長的影響尚未可知，本研究將圍繞DHM對體外人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）侵襲和小管形成、體內(nèi)胃癌生長和血管生成、蛋白水平的機制進行系統(tǒng)性研究。

1 材料和方法

1.1 細胞系和主要試劑

HUVEC和人胃癌細胞系MKN28購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）；DHM、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）和Drabkin 525試劑盒購自美國Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；含EDTA胰蛋白酶購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司；Matrix基質膠和Transwell小室購自美國BD公司；細胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）購自上海碧云天生物技術有限公司；BCA蛋白質濃度測定試劑盒和RIPA裂解物購自北京中山生物工程有限公司；VEGFA、phospho-VEGFR2、Total-VEGFR2、phospho-細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、Total-ERK、phospho-c-Jun氨基端激酶（c-Jun NH2-terminal kinase，JNK）和Total-JNK抗體購自美國Epitomics公司；phospho-p38、Total-p38和β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

采用DMEM培養(yǎng)基對細胞進行培育，同時在DMEM培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清，細胞放置于細胞培養(yǎng)箱環(huán)境中，使用含EDTA胰蛋白酶消化，按照1∶3的比例進行傳代。

1.3 配制藥液

把100 mg的DHM添加至10 mL的DMSO內(nèi)，制作得到10 mg/mL的液體成分，隨后妥善放置4 ℃環(huán)境中，臨使用時將母液置于37 ℃水浴箱內(nèi)溶解后再添加DMEM培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，0.1%為DMSO在DHM溶液中濃度的上限，0.1%DMSO對細胞活力無顯著抑制作用。使DHM濃度梯度為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0和100.0 mmol/L，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 CCK-8法檢測細胞活力

HUVEC或MKN28細胞加入96孔板中，每孔中分配2×104個細胞，藥物初步處理后放在37 ℃環(huán)境中4 h，隨后將10 μL的CCK-8試劑添加至每個96孔板中，借助酶標儀對吸光度值進行檢測和記錄。

1.5 細胞體外侵襲實驗

每個Transwell上室鋪有一層Matrix基質膠模擬體內(nèi)環(huán)境，收集對數(shù)生長期的HUVEC或MKN28細胞懸液，經(jīng)冰PBS緩沖液洗滌3次，并將細胞懸液的密度調(diào)節(jié)至2×105/mL，將20 μL細胞懸液加至Transwell上室，再將500 μL的DMEM完全培養(yǎng)基加入Transwell下室，Transwell小室置于37 ℃中溫育過夜后加入1～2滴結晶紫試劑，反應15 min后在光學顯微鏡下觀察轉移至Transwell小室背側的細胞，在×200視野下隨機計數(shù)5個視野下的藍染細胞，實驗重復3次，取平均值。

1.6 小管形成實驗

將不含胎牛血清的培養(yǎng)基和Matrigel基質膠放置冰箱冷藏柜內(nèi)12 h，待其變成膠凍狀，以1∶2的比例混合培養(yǎng)基和Matrigel基質膠，將250 μL稀釋后的Matrigel基質膠加入24孔板中，再放入37 ℃細胞培養(yǎng)箱中溫育1 h，觀察到Matrigel基質膠凝結成塊。將HUVEC懸液的密度調(diào)節(jié)至3×106/mL，將0.1 mL細胞液滴加至預先鋪好基質膠的24孔細胞培養(yǎng)板中，最后放入37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，在光學顯微鏡下對小管形成狀況進行觀察和拍照。

1.7 蛋白質印跡法（Western blot）檢測

HUVEC或MKN28細胞在細胞裂解液的作用下提取蛋白，總蛋白經(jīng)勻漿、離心和變性等操作后，使用凝膠電泳分離后轉移至硝酸纖維素膜上后通過脫脂奶粉進行封閉操作，整體實驗環(huán)境為4℃，維持12 h，硝酸纖維素膜分別經(jīng)過一抗和二抗的溫育后，利用顯影定影試劑盒完成最后的顯色和曝光操作。

1.8 基質膠塞實驗

3～7周的BALB/c雌小鼠從中國科學院上海生命科學研究院購得，裸小鼠放置在層流凈化屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)。將Matrigel基質膠放置4 ℃下12 h，待其變成液態(tài)，實驗分對照組、VEGFA組和VEGFA+DHM組，每組5只裸鼠，對照組裸鼠經(jīng)皮下注射Matrigel基質膠0.5 mL，VEGFA組裸鼠經(jīng)皮下注射添加VEGFA（20 μg/L）的Matrigel基質膠0.5 mL，VEGFA+DHM組裸鼠皮下注射物為混勻VEGFA（20 μg/L）和DHM（5 mmol/L）的Matrigel基質膠0.5 mL，皮下注射部位為裸小鼠的腹中線附近。Matrigel基質膠注射入皮下組織后迅速形成一個膠塞，1周后處死裸鼠取出基質膠塞，嚴格根據(jù)Drabkin 525試劑盒的說明書的步驟和說明進行血紅蛋白濃度測定。

1.9 建立裸鼠MKN28移植瘤模型

在DMEM培養(yǎng)基中重懸MKN28細胞，并將細胞懸液的密度調(diào)節(jié)至3×107/mL。將0.2 mL懸浮腫瘤細胞液皮下注射到裸小鼠的右下肢，接受注射2周后，皮下異種移植物的體積在裸小鼠可長達100 mm3或更大，將10只注射腫瘤細胞成功的荷瘤裸小鼠按隨機數(shù)表法分為對照組和DHM組，對照組5只裸小鼠經(jīng)灌胃給予0.1%DMSO（0.2 mL/只），DHM組5只裸小鼠經(jīng)食管插管給予DHM（30 mg/kg），調(diào)整每次給藥劑量為0.2 mL，每天1次，共2周。在第4周結束時，終止體內(nèi)實驗，取皮下腫瘤組織稱重并進行H-E染色。

1.10 免疫組織化學法檢測Ki-67增殖指數(shù)及CD34、VEGFA的表達

所有樣品用5%甲醛溶液固定過夜，用梯度乙醇脫水法將腫瘤組織進行脫水處理，包埋在石蠟中，并切片。根據(jù)SP染色法進行免疫組織化學染色，Ki-67陽性染色少數(shù)位于細胞質中，大都在細胞核中，CD34少數(shù)表達于細胞質中，絕大部分表達于細胞膜中，VEGFA陽性表達大都在細胞質中，隨機選擇20個視野并在低倍鏡下拍照，使用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件分析Ki-67和VEGFA在樣本中的積分光密度（IOD）值，在×200光學顯微鏡下選取10個視野，計數(shù)每個視野下CD34陽性細胞，取平均值。

1.11 統(tǒng)計學處理

在該實驗中獲得的所有測量數(shù)據(jù)表示為，并且通過ANOVA方差SNK-q方法分析兩個樣品之間的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DHM對體外MKN28細胞或HUVEC生長的影響

將依次濃度升高的DHM（0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0和100.0 mmol/L）分別作用MKN28細胞或HUVEC，24 h后經(jīng)CCK-8法測定細胞活力情況，結果表明低濃度DHM（0.5～10.0 mmol/L）對體外MKN28細胞的生長無明顯抑制作用，最高濃度（100.0 mmol/L）的DHM作用MKN28細胞后僅使細胞存活率從100.00%（對照組）降低到（59.21±12.34）%。而HUVEC對DHM的敏感性明顯高于MKN28細胞，低濃度（0.5～2.5 mmol/L）的DHM對HUVEC活力無明顯影響，但較高濃度（5～100 mmol/L）的DHM可有效抑制HUVEC活力，呈濃度依賴關系（圖1），2.5 mmol/L的DHM對約90%的HUVEC沒有明顯的毒性，表明濃度不超過2.5 mmol/L的DHM對細胞生長沒有影響，因此本研究選擇0.5～2.5 mmol/L的DHM進行后續(xù)實驗。

圖1 不同濃度DHM對體外MKN28細胞或HUVEC活力的影響Fig.1 The viability of MKN28 cells and HUVEC after DHM treatment was detected by performing CCK-8 assay

2.2 DHM對HUVEC侵襲和小管形成的抑制作用

首先，采用細胞體外侵襲實驗對DHM處理后的MKN28細胞侵襲行為進行分析。如圖2A所示，依次濃度升高的DHM（0.5、1.0、2.5 mmol/L）作用于MKN28細胞后對MKN28細胞侵襲行為無明顯影響，與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而VEGFA（20 mg/L）處理明顯增強了MKN28細胞侵襲行為，與DHM（2.5 mmol/L）組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

如圖2B所示，相同濃度的DHM對HUVEC侵襲行為的抑制作用明顯強于MKN28細胞，（0.5、1.0、2.5 mmol/L）的DHM作用HUVEC后，侵襲細胞數(shù)分別為31.6±5.6、27.2±3.9和25.6±4.3，DHM可以明顯抑制HUVEC的侵襲行為，與對照組（57.8±8.9）比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

其次，利用小管形成實驗檢驗DHM對體外HUVEC的體外血管生成能力，如圖2C所示，HUVEC在體外鋪滿Matrigel基質膠的培養(yǎng)板中生長12 h后，細胞逐漸向兩端延長呈梭形，同時細胞延長端開始在Matrigel基質膠中伸展，相鄰細胞開始出現(xiàn)聯(lián)接并出現(xiàn)管腔樣結構，0.5、1.0、2.5 mmol/L的DHM作用于HUVEC后，體外小管形成數(shù)分別為24.3±4.8、21.4±3.9、20.6±3.2，均顯著低于對照組（52.6±7.2），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），表明DHM可有效地抑制HUVEC體外小管形成能力。而VEGFA（20 mg/L）處理可一定程度上逆轉DHM對HUVEC侵襲和小管形成能力的抑制作用，與DHM（2.5 mmol/L）組相比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。綜上所述，以上結果表明低濃度DHM無明顯細胞毒作用，但可有效地抑制HUVEC體外血管生成能力。

圖2 不同濃度DHM對體外MKN28細胞和HUVEC侵襲能力及小管形成作用的影響Fig.2 Effects of DHM on the invasive abilities of MKN28 and HUVEC cells in vitro and tube formation

2.3 DHM對MKN28細胞和HUVEC中ERK/VEGFA/VEGFR2通路相關蛋白水平的影響

為探討DHM對HUVEC發(fā)揮血管生成抑制作用的分子機制，應用Western blot法測定ERK/VEGFA通路蛋白在MKN28細胞中的含量。如圖3A所示，用（0.5、1.0、2.5 mmol/L）的DHM作用于MKN28細胞后，可導致VEGFA和phospho-ERK的表達隨DHM濃度升高而下降，而DHM對MKN28細胞中phospho-p38和phospho-JNK的表達無明顯影響。另外，相同濃度DHM作用HUVEC后可呈濃度依賴性抑制HUVEC中phospho-VEGFR2的表達（圖3B）。

圖3 DMY對體外MKN28細胞和HUVEC中ERK/VEGFA/VEGFR2信號通路蛋白水平的影響Fig.3 Effects of DMY on the protein expression levels of ERK/VEGFA/VEGFR2 pathway factors in MKN28 cells and HUVEC detected by Western blot

2.4 DHM對體內(nèi)血管生成的影響

為進一步明確DHM對血管生長的調(diào)控作用，應用基質膠塞實驗檢測DHM對體內(nèi)血管生成的作用。實驗結果后留取3組膠塞如圖4A所示，對照組基質膠塞色灰白，散在血管分布；加入VEGFA（20 μg/L）的基質膠塞在裸鼠皮下組織血管化明顯，色澤暗紅，在顯微鏡下可見血管內(nèi)大量紅細胞，表明新生血管在基質膠塞中形成，對照組和VEGFA組血紅蛋白濃度分別為（3.62±0.59）g/L和（32.70±6.80）g/L，兩組之間的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；而VEGFA+DHM組基質膠塞在巨觀下可見新生血管數(shù)量較VEGFA組明顯減少，其血紅蛋白濃度為（9.10±1.50）g/L，較VEGFA組之間的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

2.5 DHM對MKN28裸鼠移植瘤生長和血管生成的影響

隨后通過建立MKN28裸鼠皮下移植瘤研究DHM對體內(nèi)胃癌生長及血管新生的影響。首先通過在DHM（30 mg/Kg）用藥的2周內(nèi)每日監(jiān)測裸鼠體質量變化（圖4B），對照組裸鼠體質量從給藥前的（20.71±0.32）g升至實驗結束時的（21.53±0.23）g，而DHM組裸鼠體質量在給藥前和實驗結束時分別為（20.86±0.36）g和（20.65±0.32）g，兩組裸鼠體質量在給藥前和實驗結束后差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），從而表明本次實驗所選用的DHM劑量（30 mg/Kg）對實驗動物無明顯不良反應。

在4周處死裸鼠后，將皮下腫瘤仔細剝離并稱重，兩組裸鼠尸檢結果如圖4C所示，對照組平均腫瘤質量為（0.45±0.09）g，DHM組平均腫瘤質量為（0.14±0.03）g，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

H-E染色后在鏡下可見對照組腫瘤細胞為低分化胃癌，增殖活躍，腫瘤中血供豐富，DHM組腫瘤細胞增生相對較慢，血供較為貧乏，可見大量組織壞死（圖4D）；免疫組織化學法測定Ki-67、CD34和VEGFA在裸鼠皮下異種移植物中的陽性染色情況如圖4D所示，對照組和DHM組腫瘤組織中Ki-67的IOD值分別為156.63±30.35和138.67±22.54，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；對照組和DHM組腫瘤組織中CD34陽性表達分別是32.1±6.43和11.7±3.49，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；VEGFA在對照組和DHM組腫瘤組織中的IOD值分別為284.91±53.86和104.64±24.32，VEGFA在DHM組中的陽性表達較對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

圖4 DHM對小鼠體內(nèi)腫瘤生長的影響Fig.4 The effect of DHM on tumor cell growth in vivo

3 討 論

DHM作為一種近年來藥理學研究非常深入的活性氫化黃酮醇類有機物，在多種疾病模型中具有良好效果［5-6］。同時DHM具有優(yōu)秀的抑癌效應，但既往將DHM用于體外抗癌研究的濃度范圍大多為50～100 μmol/L［7-8］，在其發(fā)揮抗癌效應的同時不可避免地會產(chǎn)生一定的不良反應。為此，本研究首先使用依次增高濃度的DHM分別作用體外胃癌MKN28細胞和HUVEC，發(fā)現(xiàn)低濃度（0.5～10.0 μmol/L）的DHM對體外胃癌細胞生長和侵襲行為無明顯抑制作用，但HUVEC對DHM的生長抑制效應更加敏感，5.0 μmol/L的DHM即可有效抑制體外HUVEC生長，同時更低濃度范圍（0.5～2.5 μmol/L）的DHM對體外HUVEC的侵襲和小管形成具有明顯抑制作用。另外在體內(nèi)實驗中，較低劑量（30 mg/Kg）的DHM對實驗動物無明顯的不良反應，但低劑量的DHM對胃癌皮下移植瘤生長和血管新生具有明顯抑制效應。這是首次全面報道DHM在低劑量下對體內(nèi)外細胞無明顯的不良反應，但可通過阻斷腫瘤血管生成，從而抑制惡性腫瘤生長，本研究表明DHM可望作為一種低毒高效的血管生成抑制劑用于臨床胃癌治療。

血管內(nèi)皮細胞在細胞炎性信號、切應力和激素水平等信號的作用下，可分泌多種血管活性物質，從而調(diào)節(jié)血液穩(wěn)態(tài)、新生血管形成和組織再生。腫瘤組織中的血管內(nèi)皮細胞在組織形態(tài)、增生方式和免疫學特征等方面和正常組織血管內(nèi)皮細胞存在較大差異，腫瘤組織內(nèi)血管內(nèi)皮細胞增生為順應腫瘤生長的需要，在腫瘤細胞分泌的多種促血管生長因子的作用下，腫瘤血管內(nèi)皮細胞的活力、侵襲能力及新生血管能力均得到不同程度增強，以適應腫瘤發(fā)展和轉移的需要。一般而言，腫瘤生長至1 mm3時就需要新生血管生成以維系惡性腫瘤不斷增殖所需要的養(yǎng)分。為此，根據(jù)腫瘤內(nèi)皮細胞的特點，靶向腫瘤血管內(nèi)皮細胞的治療應運而生，有效抑制包括胃癌在內(nèi)的惡性腫瘤血管新生，可有效抑制惡性腫瘤的發(fā)展和轉移，從而改善惡性腫瘤患者預后［9-10］。本研究中，低劑量的DHM不僅對體外血管生成具有顯著抑制效應，還可以抑制體內(nèi)血管生成；雖然DHM對體內(nèi)胃癌生長具有顯著延緩作用，但DHM并不能有效地降低Ki-67增殖指數(shù)，而DHM給藥后可明顯抑制體內(nèi)胃癌新生血管形成，因此，本研究顯示低劑量的DHM不能干擾腫瘤細胞惡性增殖，但能通過抑制新生血管形成從而造成腫瘤處于“饑餓”狀態(tài)，進而達到延緩腫瘤生長的作用，通過H-E染色觀察到DHM組腫瘤組織中出現(xiàn)大片細胞壞死的痕跡可以說明這一點，表明抑制新生血管形成在低劑量DHM發(fā)揮抑制體內(nèi)胃癌生長過程中發(fā)揮主導作用。

ERK作為一種脯氨酸導向的絲氨酸/蘇氨酸激酶，主要位于細胞質中，在諸如生長因子、激素、細胞因子、高糖和缺氧等刺激后發(fā)生磷酸化，磷酸化的ERK可進入細胞核中，進一步活化NF-κB及P70核蛋白體S6激酶，使得相鄰脯氨酸的絲氨酸/蘇氨酸發(fā)生磷酸化。磷酸化ERK在介導信號從細胞膜表面受體轉導至細胞核過程中發(fā)揮關鍵調(diào)控作用，p-ERK可激活STATs、c-Myc、Jun、EIk-1、ATF2和Max等轉錄因子，進而對這些轉錄因子各自靶基因的轉錄和翻譯過程產(chǎn)生影響，最終對內(nèi)皮細胞的遷移、分化和增殖等多種生理功能發(fā)揮調(diào)控作用［11-13］。VEGF作為一種在可由正常細胞和腫瘤細胞合成分泌的細胞因子，在正常組織細胞中呈低水平表達，且表達水平較為恒定，但其在許多腫瘤細胞中表達上調(diào)，是促進腫瘤細胞新生的最重要調(diào)節(jié)因子。VEGFA作為VEGF家族中與血管新生關系最密切的一員，有研究表明，VEGFA在惡性腫瘤細胞中的異常表達與腫瘤肝轉移存在正相關性，同時與惡性腫瘤患者的預后呈明顯負相關。VEGFA在腫瘤細胞中的表達與ERK磷酸化水平關系密切，另外人肝細胞生長因子可通過ERK信號通路上調(diào)腫瘤細胞中VEGFA的表達，從而促進腫瘤組織中血管生成［14-15］。在本研究中，DHM可抑制體外胃癌細胞中ERK的磷酸化水平，同時下調(diào)VEGFA在體內(nèi)外胃癌中的表達，同時在體外實驗中，DHM對血管內(nèi)皮細胞功能的影響能被額外添加的VEGFA所逆轉，證實DHM主要通過下調(diào)VEGFA的表達從而發(fā)揮抑制血管新生抑制作用；而在體內(nèi)實驗中，DHM可在VEGFA存在的情況下有效抑制體內(nèi)血管生長，這可能是因為體內(nèi)外環(huán)境的差異從而導致DHM作用效果的不同；除了ERK，還有諸如JNK和p38等多種信號通路可調(diào)控血管生成［16］，但在本研究條件下，低濃度DHM不能影響JNK和p38的磷酸化水平。因此，DHM可能通過抑制ERK/VEGFA信號通路抑制腫瘤血管生成，從而干擾腫瘤的惡性增殖。

新生血管生成需要大量血管生成因子參與調(diào)控，包括VEGFR，VEGF自腫瘤細胞分泌后與位于內(nèi)皮細胞表面的VEGFR結合，有助于內(nèi)皮細胞募集和血管通透，并通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的降解、分化、增殖和遷移等過程，在調(diào)節(jié)血管生成過程中發(fā)揮非常關鍵的效應，最終促進新血管的形成［17-18］，而VEGFA/VEGFR2是其中最重要的血管生成信號軸。本實驗也觀察到DHM可有效抑制VEGFR2在HUVEC中的磷酸化水平，結合之前的實驗結果，從而表明DHM可能通過調(diào)控胃癌細胞中ERK信號通路，影響胃癌細胞VEGFA的表達，同時抑制VEGFR2在血管內(nèi)皮細胞中的表達從而抑制內(nèi)皮細胞功能。

綜上所述，DHM在發(fā)揮抑制腫瘤血管新生過程中伴有ERK/VEGFA/VEGFR2通路的失活，但鑒于體外實驗中額外添加的VEGFA可一定程度下逆轉DHM對HUVEC的影響，從而表明VEGFA可以通過其他信號通路促進血管內(nèi)皮細胞的功能，所以還需要進一步研究DHM發(fā)揮抗血管新生的作用機制，同時本次體內(nèi)實驗中DHM作用時間較短（2周），可能使實驗結果產(chǎn)生偏倚，還需進一步實驗明確。但本次研究仍然為開發(fā)低毒高效的抗癌藥物提供了新的思路，有望將DHM作為臨床胃癌化療的“補充選擇”。