劉福平　王茜　陳東奎　陳香玲　廖惠紅　汪妮娜　黃宏明　黃其椿

摘要：【目的】探究沃柑感染黃龍病的田間癥狀表現(xiàn)及各癥狀與感染黃龍病的相關(guān)性，為種植者盡早鑒別黃龍病樹(shù)和及時(shí)做好黃龍病防控工作提供參考依據(jù)。【方法】從廣西不同地區(qū)沃柑果園采集沃柑黃龍病疑似樣品，對(duì)樣品按癥狀分類(lèi)并記錄，用試劑盒法提取葉脈和果柱基因組DNA，采用黃龍病亞洲種的16S rDNA特異引物fD1/fD2和OI1/OI2進(jìn)行巢式PCR（Nested-PCR）擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)不同癥狀樣品的陽(yáng)性率?！窘Y(jié)果】收集的214份黃龍病疑似樣品中，不同癥狀樣品均檢出黃龍病亞洲種病原菌，檢出陽(yáng)性率表現(xiàn)為典型紅鼻子果=斑駁黃化葉>果蒂稍紅果>均勻黃化葉>葉脈黃化葉>僵果>缺鋅黃化葉>其他黃化葉>正常葉。各癥狀類(lèi)型與感染黃龍病均存在相關(guān)性，但存在差異，其中，典型紅鼻子果和斑駁黃化葉陽(yáng)性率均為100.0%，與感染黃龍病相關(guān)性最大;其次果蒂稍紅果陽(yáng)性率為90.9%，與感染黃龍病相關(guān)性很大;夏、秋梢均勻黃化葉陽(yáng)性率為46.5%，與感染黃龍病相關(guān)性大。沃柑感染黃龍病后癥狀復(fù)雜，大多出現(xiàn)兩種以上復(fù)合癥狀，結(jié)果樹(shù)最初癥狀為出現(xiàn)果蒂稍紅果，落果較多，未結(jié)果樹(shù)以夏、秋梢黃化居多，根系容易受損;正常葉陽(yáng)性率達(dá)16.7%，說(shuō)明沃柑感染黃龍病早期不易顯癥。【結(jié)論】沃柑出現(xiàn)典型紅鼻子果和斑駁黃化葉，可田間診斷為黃龍病樹(shù);出現(xiàn)果蒂稍紅果，并嚴(yán)重落果，基本可田間診斷為黃龍病樹(shù);夏、秋梢均勻黃化黃龍病檢出率高，但確診還需與其他疑似癥狀（葉脈黃化葉、僵果、缺鋅黃化葉、其他黃化葉和正常葉）一樣通過(guò)PCR進(jìn)一步檢測(cè)。Nested-PCR檢測(cè)技術(shù)靈敏性高，可作為沃柑感染黃龍病的早期鑒定技術(shù)。

關(guān)鍵詞： 沃柑;黃龍病病原;Nested-PCR檢測(cè);調(diào)查分析

中圖分類(lèi)號(hào)： S685.99? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）01-0101-07

Abstract：【Objective】The symptoms of Orah infected with Huanglongbing（HLB）and the correlation between the symptoms with HLB were studied in order to provide reference for growers to identify HLB from Orah as early as possible， and to prevent in time. 【Method】The leaf samples of suspected HLB in Orah orchards in different places in Guangxi were collected， then classified and recorded by symptoms. Genomic DNA of leaf vein and fruit column was extracted by kit and Nested-PCR amplification was conducted by special primers of 16S rDNA gene of Candidatus Liberibacter asiaticus（fD1/fD2 and OI1/OI2）. The results of PCR amplification were detected by 1% agarose gel electrophoresis and the positive rate of samples with different symptoms was calculated. 【Result】Among the 214 suspected samples of HLB collected， the samples of different symptoms were detected Candidatus Liberibacter asiaticus， and the positive rate presen-ted as typical red nose fruits=mottled yellow leaves>fruit stalkslightly red fruit>uniform yellow leaves>leaves with yellow central vein>stone fruits>zinc deficiency yellow leaves>other yellow leaves>normal leaves. All the symptoms were correlated with HLB，but the correlations were different. Red nose fruits and mottled yellow leaves had the positive rate of 100.0% and had maximal correlation with HLB. Fruit stalks lightly red fruit had positive rate of 90.9%， which was highly correlated with HLB. Uniform yellow leaves in summer and autumn had positive rate of 46.5% and had strong correlation with HLB. After infection of HLB， the symptoms were complex， most of trees presented two or more complex symptoms. The initial symptoms of trees with fruits were fruit stalks lightly red fruits with a large number of fruit dropping. Most of the unfruited trees were yellowing in summer and autumn， and their roots were easily damaged. The positive rate of normal leaf was 16.7%， indicating that it was not easy to show symptomsin the early period of infection of HLB. 【Conclusion】When there are typical “red nose” fruits and mottled yellow leaves on Orah， it can be diagnosed as HLB. When the fruit stalk appears slightly red， and the fruits drop seriously， it can be basically diagnosed as HLB. The detection rate of yellowing summer and autumn shoots is high， but to be diagnosed， it needs to be detected by PCR with other symptoms（leaves with yellow central vein，stone fruits， zinc deficiency yellow leaves，other yellow leaves andnormal leaves. Nes-ted-PCR is a method with high sensitivity， which can be an early identification for Orah infected with HLB.

Key words： Orah; Huanglongbing pathogen; Nested-PCR detection; investigation

Foundation item： Guangxi Science and Technology Key Project（Guike AA18118046-2，GuikeAA17204097-8）;Nanning Science Research and Technology Development Project（20182198-2）;Guangxi Academy of Agricultural Sciences Basic Research Special Project（Guinongke 2015YT51）

0 引言

【研究意義】沃柑由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所于2004年從韓國(guó)引進(jìn)，該品種來(lái)源于以色列的Orah，是坦普爾桔橙與丹西紅桔的雜種，屬寬皮柑橘類(lèi)型（江東和曹立，2011），于2012年引進(jìn)廣西種植，表現(xiàn)性狀好，具有晚熟、樹(shù)勢(shì)強(qiáng)旺、耐寒、耐旱、產(chǎn)量高、果實(shí)品質(zhì)優(yōu)和耐貯運(yùn)等優(yōu)點(diǎn)（黃其椿等，2014;趙洪濤等，2016）。近幾年來(lái)，由于沃柑種植效益高，產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，截至2017年廣西沃柑種植面積達(dá)5.3萬(wàn)ha，其中主產(chǎn)區(qū)南寧市武鳴區(qū)有2.1萬(wàn)ha，2018年廣西沃柑種植面積持續(xù)高速增長(zhǎng)，據(jù)有關(guān)專(zhuān)家估算約達(dá)10.0萬(wàn)ha，廣西已成為全國(guó)最大的沃柑產(chǎn)區(qū)和輸出地。隨著沃柑產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，良種苗木供不應(yīng)求，但苗木市場(chǎng)亂象叢生，加上其他行業(yè)從業(yè)人員轉(zhuǎn)行種果，缺乏對(duì)黃龍病的認(rèn)識(shí)和辨別能力，給沃柑產(chǎn)業(yè)發(fā)展埋下了隱患。柑橘黃龍?。–itrus Huanglongbing，HLB）是世界柑橘生產(chǎn)上最具毀滅性的病害之一（柏自琴和周常勇，2012），其病原是一種限制于韌皮部的革蘭氏陰性細(xì)菌，還未能人工培養(yǎng)（馬瑞豐等，2016）。目前柑橘黃龍病尚無(wú)有效的防治藥劑，屬可防可控不可治病害，其綜合防控措施主要是種植無(wú)病苗、嚴(yán)防柑橘木虱、砍伐病樹(shù)和種植隔離帶等。因此，鑒別黃龍病樹(shù)是做好沃柑產(chǎn)業(yè)黃龍病防控工作的前提，而調(diào)查并了解沃柑感染黃龍病的表現(xiàn)癥狀，分析各癥狀與感染黃龍病的相關(guān)性，可提高黃龍病田間診斷準(zhǔn)確率，盡早鑒別黃龍病樹(shù)，對(duì)沃柑生產(chǎn)中防控黃龍病具有較大的指導(dǎo)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】柑橘黃龍病會(huì)引起柑橘葉片變厚、變小且黃化，包括均勻黃化、斑駁黃化、缺素黃化等，果實(shí)變小、畸形、著色不均，?，F(xiàn)紅鼻子果，種子敗育，根系須根少，新根生長(zhǎng)受到抑制，支根腐爛等（肖翠等，2017）。感染黃龍病后，植株并不立即顯癥，存在潛伏期，潛伏期的長(zhǎng)短因品種、樹(shù)齡、健康狀況、種植環(huán)境等而異（馬瑞豐等，2016），且不同品種田間表現(xiàn)癥狀不盡相同。金柑黃龍病癥狀既有斑駁葉和紅鼻果，也有缺鋅、缺錳狀葉片，但斑駁葉較少，而且多為分散碎斑駁，一般不會(huì)形成一大塊完整的黃斑和一塊完整綠斑相間的斑駁狀，紅鼻果則非常典型，表現(xiàn)為果實(shí)果蒂部位、果肩周?chē)燃t色，其余青綠色，果小、變軟，嚴(yán)重時(shí)果實(shí)表皮失水皺縮（鄧光宙等，2007）。臍橙黃龍病初期在植株樹(shù)冠的個(gè)別或少數(shù)夏秋梢出現(xiàn)黃化，以后逐步全株黃化，葉片癥狀有斑駁型黃化和缺素狀黃化，偶見(jiàn)均勻黃化，發(fā)病初期根部基本正常不會(huì)腐爛，隨著病情的發(fā)展，地上部出現(xiàn)干枯，根系也開(kāi)始腐爛、變黑，繼而地上部全部枯死（王道平和江映錦，2009）?，g溪蜜柚黃龍病的葉片癥狀有葉片斑駁黃化、均勻黃化、類(lèi)似缺素黃化等多種黃化癥狀，但典型癥狀“葉片斑駁黃化”表現(xiàn)比其他柑橘品種更明顯，病果前期癥狀不明顯，采收期明顯偏小、油胞增粗，外觀不顯現(xiàn)紅鼻果癥狀（李美桂，2010）。沙田柚主要病狀為初期病樹(shù)黃梢和葉片斑駁型黃化，病葉容易脫落，病果變小、畸形、著色不均勻（李小軒，2011）。砂糖橘黃龍病癥狀有黃梢、斑駁黃化葉、缺素狀黃化葉、紅鼻子果，均勻黃化葉在初期發(fā)病樹(shù)春、夏、秋梢上發(fā)生，病果為紅鼻子果，小而畸形，略呈長(zhǎng)圓形，病樹(shù)根部初期正常，后期出現(xiàn)爛根（黃海，2018）。長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)柑橘黃龍病主要是根據(jù)田間癥狀進(jìn)行診斷，其典型癥狀有黃梢、斑駁黃化葉、紅鼻子果（王愛(ài)民和鄧曉玲，2008），但不同品種表現(xiàn)癥狀與感染黃龍病的相關(guān)性存在差異，分析黃龍病癥狀與PCR檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性有助于提高黃龍病的田間診斷準(zhǔn)確率。張培（2009）利用TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)砂糖橘疑似樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)砂糖橘紅鼻子果樣品韌皮部桿菌（Candidatus Liberibaeter asiaticus）陽(yáng)性檢出率高達(dá)100.0%，病樹(shù)上無(wú)癥狀果實(shí)、斑駁葉片及黃化葉片樣品陽(yáng)性檢出率分別為27.3%、91.8%和52.0%。王茜等（2013a）利用巢式PCR（Nested-PCR）技術(shù)對(duì)南豐蜜桔不同癥狀黃龍病疑似樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明斑駁型黃化葉、缺鋅狀黃化葉、其他黃化葉和正常葉疑似樣品陽(yáng)性率分別為82.0%、31.6%、22.9%和8.6%。許美容等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，斑駁型黃化、均勻黃化和綠島3種葉部癥狀及紅鼻子果和畸形果2種果實(shí)癥狀的PCR病原檢出率高，陽(yáng)性率分別為85.62%、85.00%、84.20%、93.10%和78.57%?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】沃柑是新引進(jìn)品種，其感染黃龍病后表現(xiàn)癥狀、各癥狀與感染黃龍病的相關(guān)性研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，均是參照其他柑橘品種感染黃龍病的癥狀來(lái)鑒別，然而柑橘黃龍病癥狀較復(fù)雜，其表現(xiàn)隨季節(jié)、樹(shù)齡、品種等不同存在差異（許美容等，2016）。2017年冬季，廣西多地沃柑果園出現(xiàn)果蒂稍紅果，僅果蒂處一點(diǎn)紅，并落果嚴(yán)重，不同于以往常見(jiàn)的典型紅鼻子果，其果型、大小正常，且果枝上葉片大小、顏色均正常;2018年夏季，沃柑果園出現(xiàn)夏梢全部黃化、根系腐爛等現(xiàn)象，冬季出現(xiàn)僵果，但斑駁葉片較少，與其他柑橘品種感染黃龍病的表現(xiàn)癥狀差異較明顯，一時(shí)無(wú)法診斷，需要通過(guò)PCR檢測(cè)來(lái)確診?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采集廣西不同地區(qū)沃柑果園黃龍病疑似樣品，對(duì)樣品按癥狀分類(lèi)并記錄，利用Nested-PCR檢測(cè)技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)不同癥狀樣品的陽(yáng)性率，分析不同表現(xiàn)癥狀與感染黃龍病的相關(guān)性，旨在了解沃柑感染黃龍病的黃龍病田間表現(xiàn)癥狀，以及各表現(xiàn)癥狀與感染黃龍病的相關(guān)性，從而提高黃龍病田間診斷準(zhǔn)確率，為種植者盡早鑒別黃龍病樹(shù)，及時(shí)做好黃龍病防控工作提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 樣品采集 沃柑黃龍病疑似葉樣和果樣分別于2017年10月—2019年4月采自廣西南寧市武鳴區(qū)、邕寧區(qū)、江南區(qū)、西鄉(xiāng)塘區(qū)、上林縣和賓陽(yáng)縣，以及北海市、玉林市和河池市的沃柑果園。

1. 1. 2 引物 采用黃龍病亞洲種的16S rDNA特異引物fD1/fD2和OI1/OI2（Chen et al.，2009），引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1. 1. 3 基因組DNA提取試劑盒 采用快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)，DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 樣品處理與保存 對(duì)所采集樣品按照癥狀進(jìn)行分類(lèi)、拍照、整理。葉樣取葉片主葉脈，果樣取果實(shí)中柱，每份100 mg，用液氮研磨至粉末狀，于 -20 ℃保存待用。

1. 2. 2 DNA提取 葉片主脈和果柱DNA提取均參考王茜等（2013b）的方法。

1. 2. 3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及條件 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系與條件參考黃宏明等（2016）專(zhuān)利方法。

1. 2. 4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) 取1.5 μL 6×Loa-ding Buffer與4.5 μL第二輪PCR產(chǎn)物混合均勻后上樣，在1%瓊脂糖凝膠電泳，電壓110 V，1×TAE電泳緩沖液，電泳20 min后，在FIRE READER XS D-56-26M凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2. 1 疑似樣品癥狀分類(lèi)結(jié)果

共收集214份黃龍病疑似樣品，其中典型紅鼻子果7份、斑駁黃化葉16份、果蒂稍紅果11份、均勻黃化葉54份、葉脈黃化葉11份、僵果6份、缺鋅黃化葉20份、其他黃化葉53份和正常葉36份。疑似樣品癥狀類(lèi)型見(jiàn)圖1。

2. 2 DNA提取和Nested-PCR檢測(cè)結(jié)果

用天根生化科技（北京）有限公司快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)提取的DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，條帶清晰明亮，符合黃龍病病原Nested-PCR檢測(cè)要求。Nested-PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（圖3）顯示，感染黃龍病病原樣品的Nested-PCR產(chǎn)物條帶明亮，能清楚地鑒別疑似樣品是否感染黃龍病亞洲種病原菌。

2. 3 沃柑感染黃龍病的田間癥狀表現(xiàn)

調(diào)查發(fā)現(xiàn)沃柑感染黃龍病后癥狀復(fù)雜，大多出現(xiàn)兩種以上復(fù)合癥狀。結(jié)果樹(shù)感染黃龍病的最初表現(xiàn)癥狀為出現(xiàn)果蒂稍紅果，落果較多，但果實(shí)大小、果型正常，果枝上葉片不表現(xiàn)癥狀，看似正常葉，且近幾年來(lái)此種現(xiàn)象較多。感染黃龍病較嚴(yán)重的結(jié)果樹(shù)果實(shí)生長(zhǎng)緩慢，嚴(yán)重落果，并出現(xiàn)典型紅鼻子果和畸型果（果形不正和斜肩癥狀）等，病果汁少味淡而酸，新梢缺素（缺鋅較多），葉片變小、枝條變短，老葉出現(xiàn)斑駁黃化葉。未結(jié)果樹(shù)以枝梢黃化為主，其中夏、秋梢黃化較多，主要癥狀是新梢不轉(zhuǎn)綠，出現(xiàn)全部均勻黃化，其次是全部缺素黃化、部分枝梢黃化或單支黃化等，癥狀較輕的老葉正常，根系受損，嚴(yán)重的上一級(jí)枝梢葉片出現(xiàn)退綠斑，呈現(xiàn)“綠島”癥狀，根系壞死，葉脈黃化，樹(shù)勢(shì)衰退，相對(duì)其他品種，斑駁葉片較少（表1）。

2. 4 沃柑黃龍病疑似樣品癥狀類(lèi)型與感染黃龍病的相關(guān)性

根據(jù)Nested-PCR檢測(cè)結(jié)果（表2），典型紅鼻子果、斑駁黃化葉、果蒂稍紅果、均勻黃化葉、葉脈黃化葉、僵果、缺鋅黃化葉、其他黃化葉和正常葉等不同癥狀黃龍病疑似樣品均檢出黃龍病亞洲種病原菌，說(shuō)明沃柑感染黃龍病后其表現(xiàn)癥狀多樣化。由表2可知，不同癥狀黃龍病疑似樣品陽(yáng)性率存在差異，陽(yáng)性率表現(xiàn)為典型紅鼻子果=斑駁黃化葉>果蒂稍紅果>均勻黃化葉>葉脈黃化葉>僵果>缺鋅黃化葉>其他黃化葉>正常葉，其中典型紅鼻子果和斑駁黃化葉黃龍病亞洲種病原菌檢測(cè)陽(yáng)性率為100.0%，田間基本可以診斷為黃龍病樹(shù)（王愛(ài)民和鄧曉玲，2008）;其次果蒂稍紅果的黃龍病亞洲種病原菌陽(yáng)性率高達(dá)90.9%，說(shuō)明該癥狀與感染黃龍病的相關(guān)性很大，可作為田間診斷沃柑感染黃龍病的重要參考依據(jù);均勻黃化葉、葉脈黃化葉、缺鋅黃化葉和其他黃化葉也檢出黃龍病亞洲種病原菌，說(shuō)明這幾種癥狀均與感染黃龍病存在一定的相關(guān)性，其中均勻黃化葉樣品中有43份為夏梢和秋梢均勻黃化，其陽(yáng)性樣品20份，陽(yáng)性率為46.5%，與感染黃龍病相關(guān)性大;正常葉陽(yáng)性率為16.7%，與感染黃龍病也存在相關(guān)性;有部分沃柑僵果中檢測(cè)到黃龍病亞洲種病原菌，分析原因是沃柑樹(shù)感染黃龍病的同時(shí)感染了其他病害。

2. 5 不同季節(jié)沃柑新梢黃化葉與感染黃龍病的關(guān)系

2018年夏季分別從武鳴寧武鎮(zhèn)、城廂鎮(zhèn)、羅波鎮(zhèn)、里建鎮(zhèn)和仙湖鎮(zhèn)采集沃柑夏梢全部黃化的黃龍病疑似樣品，檢出的陽(yáng)性率分別為80.0%、50.0%、50.0%、36.4%和0，合計(jì)樣品31份，陽(yáng)性樣品15份，檢測(cè)陽(yáng)性率為48.4%。2017和2018年秋梢黃化黃龍病疑似樣品檢測(cè)陽(yáng)性率為22.7%，2019年春梢黃化黃龍病疑似樣品檢出陽(yáng)性率為0（表3）。夏、秋梢黃化均與感染黃龍病相關(guān)，其中，夏梢黃化葉檢測(cè)陽(yáng)性率較高，秋梢黃化葉檢測(cè)陽(yáng)性率較低，分析原因是秋梢黃化葉樣品中包含了因缺素不轉(zhuǎn)綠枝梢的缺素黃化葉。2019年春梢黃化葉檢測(cè)陽(yáng)性率為0，其癥狀為春梢不轉(zhuǎn)綠，均勻黃化，枝梢變短，葉片變小，上一級(jí)枝梢出現(xiàn)退綠現(xiàn)象，原因有待進(jìn)一步檢測(cè)鑒定。

2. 6 不同地區(qū)沃柑黃龍病發(fā)生情況

從檢測(cè)結(jié)果（表4）看，除南寧市賓陽(yáng)縣、貴港市和梧州市幾個(gè)采樣較少的點(diǎn)外，其他采樣點(diǎn)的黃龍病疑似樣品均檢出黃龍病病原菌，其中南寧市江南區(qū)黃龍病疑似樣品陽(yáng)性率高達(dá)88.9%，其次是南寧市武鳴區(qū)、西鄉(xiāng)塘區(qū)和上林縣，北海市和玉林市的黃龍病疑似樣品陽(yáng)性率較高，在39.7%以上，說(shuō)明沃柑感染黃龍病的普遍性和嚴(yán)重性，黃龍病依然是沃柑的主要病害之一，需加強(qiáng)黃龍病的綜合防控工作，確保沃柑產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展。

3 討論

本研究采用Nested-PCR技術(shù)對(duì)沃柑黃龍病疑似樣品進(jìn)行檢測(cè)，產(chǎn)物條帶明亮，能清楚鑒別疑似樣品是否感染黃龍病，且對(duì)于帶菌但不顯癥的正常葉也能檢出，與王茜等（2013a）對(duì)南豐蜜桔、黃宏明等（2014）對(duì)砂糖橘的研究結(jié)果一致，說(shuō)明Nested-PCR技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，能夠快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出各種癥狀樣品的黃龍病病原。正常葉也能檢出病原，原因是病原菌在寄主體內(nèi)含量、分布不均造成，沃柑疑似樣品正常葉中，黃龍病病原菌的陽(yáng)性率達(dá)16.7%，比南豐蜜桔高近1倍，說(shuō)明沃柑感染黃龍病后，相對(duì)其他柑橘品種，早期葉片不易顯癥，且未結(jié)果樹(shù)開(kāi)始顯癥時(shí)，斑駁黃化葉較少，新梢黃化居多，與其他很多生理病害和蟲(chóng)害癥狀類(lèi)似，僅通過(guò)田間癥狀難以作出準(zhǔn)確診斷。現(xiàn)有田間檢測(cè)儀器主要是基于高光譜成像無(wú)損黃龍病檢測(cè)技術(shù)的設(shè)備，一般操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快，但存在假陽(yáng)性和假陰性情況，會(huì)有誤診的情況發(fā)生（肖翠等，2017）。因此，Nested-PCR技術(shù)是沃柑感染黃龍病早期較理想的一項(xiàng)鑒定技術(shù)。

本研究發(fā)現(xiàn)沃柑結(jié)果樹(shù)感染黃龍病的最初表現(xiàn)癥狀為出現(xiàn)果蒂稍紅果，落果較多，但果實(shí)大小、果型正常，果枝上葉片不表現(xiàn)癥狀，與其他柑橘品種存在差異，但感染嚴(yán)重時(shí)，其典型紅鼻子果與砂糖橘、南豐蜜桔、臍橙和金柑等表現(xiàn)一致，僅與柚類(lèi)不同。樹(shù)梢表現(xiàn)與砂糖橘相似，沃柑感染黃龍病初期黃梢在春、夏、秋梢上均有發(fā)生，但夏梢較嚴(yán)重，與臍橙存在差異，臍橙黃龍病初期樹(shù)冠只有個(gè)別或少數(shù)夏梢出現(xiàn)黃化，偶見(jiàn)均勻黃化;根系表現(xiàn)，沃柑感染黃龍病初期根系即受損，而砂糖橘和臍橙感病初期根部正常，后期才出現(xiàn)爛根;沃柑感染黃龍病初期斑駁黃化葉較少，與金柑一致，但嚴(yán)重時(shí)顯癥的斑駁葉片非常典型。

相關(guān)性分析方面，沃柑典型紅鼻子果黃龍病陽(yáng)性檢出率為100.0%，與張培（2009）利用TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)砂糖橘疑似樣品的檢測(cè)結(jié)果一致，斑駁黃化葉在疑似黃龍病葉樣中陽(yáng)性檢出率最高，與王茜等（2013a）利用Nested-PCR技術(shù)對(duì)南豐蜜桔不同癥狀黃龍病疑似樣品的檢測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明沃柑與其他柑橘品種一樣，典型紅鼻子果和斑駁黃化葉與感染黃龍病的相關(guān)性最大，可作為田間診斷沃柑感染黃龍病的依據(jù);其次，沃柑果蒂稍紅果黃龍病陽(yáng)性檢出率也高達(dá)90.9%，相關(guān)性很大，可作為田間診斷沃柑感染黃龍病的重要參考依據(jù)。因2019年沃柑春梢均勻黃化葉未檢出黃龍病，導(dǎo)致均勻黃化葉檢測(cè)陽(yáng)性率降為37.0%，原因有待進(jìn)一步鑒定;除去春梢均勻黃化葉，夏、秋梢均勻黃化葉的陽(yáng)性檢出率為46.5%，與感染黃龍病相關(guān)性大。由于沃柑感染黃龍病后根系容易受損，老葉出現(xiàn)葉脈黃化，葉片退綠現(xiàn)象，葉脈黃化葉陽(yáng)性檢出率較高，為36.4%，與感染黃龍病相關(guān)性較大。此外，僵果、缺鋅黃化葉、其他黃化葉和正常葉等黃龍病疑似癥狀也與感染黃龍病存在一定的相關(guān)性。但沃柑均勻黃化葉、葉脈黃化葉、僵果、缺鋅黃化葉、其他黃化葉和正常葉等黃龍病疑似癥狀要確診，還需通過(guò)PCR技術(shù)鑒定。

4 結(jié)論

沃柑出現(xiàn)典型紅鼻子果和斑駁黃化葉與感染黃龍病相關(guān)性最大，可田間診斷其已感染黃龍病;沃柑出現(xiàn)果蒂稍紅果與感染黃龍病相關(guān)性很大，結(jié)合樹(shù)體情況，如出現(xiàn)嚴(yán)重落果，可田間診斷其為黃龍病樹(shù);未結(jié)果樹(shù)夏梢均勻黃化黃龍病陽(yáng)性檢出率高，但與其他疑似癥狀（葉脈黃化葉、僵果、缺鋅黃化葉、其他黃化葉和正常葉）一樣需通過(guò)PCR進(jìn)一步檢測(cè)確診，以免造成傳播或誤砍;沃柑感染黃龍病早期不易顯癥，且斑駁葉相對(duì)其他品種較少，Nested-PCR檢測(cè)可作為沃柑感染黃龍病早期鑒定技術(shù)。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）