賀圣凌，林雨蝶 ，鄧茹月，熊江 ，周鑼娜 ，羅林麗，周玉鋒*

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，貴陽 550006；2.大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023；3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，貴陽 550006)

藜谷、南美藜、昆諾阿藜等都是藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)的別稱，作為莧科藜屬的一年生雙子葉植物，在安第斯山地區(qū)的種植歷史已有7000多年，為古印加民族的主要糧食作物之一[1]。藜麥?zhǔn)且环N具有較高營養(yǎng)價值的雜糧。聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)認(rèn)證藜麥?zhǔn)且环N單體植物即可滿足人體基本營養(yǎng)需求的食物，正式推薦藜麥為最適宜人類的全營養(yǎng)食品[2]。而對于藜麥的研究現(xiàn)狀而言，國外研究遠(yuǎn)早于國內(nèi)，李娜娜等[3]對藜麥的研究現(xiàn)狀與發(fā)展前景進(jìn)行了相對仔細(xì)的分析，結(jié)果表明我國對藜麥的研究開始得較晚，且缺乏自主知識產(chǎn)權(quán)的品種，藜麥作為全營養(yǎng)雜糧的價值已被廣泛認(rèn)可，雖對其進(jìn)行了初步的研究，卻不夠深入，其藥用保健功能有待進(jìn)一步研究。紅曲菌能產(chǎn)生洛伐他汀類物質(zhì)、紅曲色素、γ-氨基丁酸、麥角甾醇、桔霉素以及多種酶類等次級代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物大多數(shù)具有生理活性[4]，經(jīng)眾多研究表明紅曲在其色素和功能性方面都有著很好的應(yīng)用前景，2018年，張婷婷等[5]探究了紅曲紅作為肉脯中亞硝酸鹽發(fā)色作用替代品的可行性。2018年，胡楊等[6]采用全液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲米醋，開發(fā)了全液態(tài)發(fā)酵紅曲米醋的生產(chǎn)工藝。2018年，張江寧等[7]研究了不同發(fā)酵基質(zhì)對紅曲產(chǎn)洛伐他汀、桔青霉素含量的影響，進(jìn)一步說明不同發(fā)酵基質(zhì)對紅曲發(fā)酵代謝產(chǎn)物的影響尤為顯著。2019年，張江寧等[8]研究了紅曲菌發(fā)酵制備紅曲米過程中的關(guān)鍵控制點，為紅曲米制備提供了高效且安全的發(fā)酵工藝條件。從近年來國內(nèi)相關(guān)紅曲類食品發(fā)明專利申請的情況來看[9]，目前紅曲的應(yīng)用除了發(fā)酵大米方面，在著色劑、釀酒、飲料、調(diào)味品及保健品方面也得到廣泛應(yīng)用。為提高藜麥的食用價值，為藜麥微生物固態(tài)發(fā)酵提供基礎(chǔ)，本研究將紅曲菌與藜麥結(jié)合，分析基質(zhì)適生性尤為重要。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：紅藜麥，產(chǎn)自山西忻州，由繁峙縣玥晨貿(mào)易有限公司提供。

菌種：紫紅曲霉3.4629(Monascuspurpureus)，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

試劑：蛋白胨、蔗糖、硫酸鎂、馬鈴薯葡糖、PDA培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂。

1.2 儀器設(shè)備

LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋；PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱；JM2003型電子天平；LDP-750A型高速多功能搖擺粉碎機(jī)；KDN-04CHP6890/5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；手動固相微萃取裝置 美國Supelco公司；CS21FS1型光學(xué)顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 紅曲發(fā)酵藜麥基質(zhì)單因素試驗

藜麥添加量對紅曲菌的擴(kuò)大培養(yǎng)：以藜麥添加量為0的種子培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別按60，80，100 g/L的添加量添加藜麥，接種量為10%，培養(yǎng)溫度為30 ℃，搖瓶轉(zhuǎn)速為180 r/min，培養(yǎng)5 d。測定種子液的菌體量，考察藜麥添加量對紅曲菌擴(kuò)大培養(yǎng)的影響。

不同碳源對紅曲菌的擴(kuò)大培養(yǎng)：以無碳源的種子液培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，按30 g/L的添加量分別添加蔗糖、葡萄糖、麥芽糖為碳源，藜麥添加量為60 g/L，接種量為10%，培養(yǎng)溫度為30 ℃，搖瓶轉(zhuǎn)速為180 r/min，培養(yǎng)5 d。測定種子液的菌體量，考察不同碳源對紅曲菌擴(kuò)大培養(yǎng)的影響。

不同氮源對紅曲菌的擴(kuò)大培養(yǎng)：以無氮源的種子液培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，按20 g/L的添加量分別添加蛋白胨、牛肉膏、酵母膏為附加氮源，藜麥添加量為60 g/L，葡萄糖添加量為30 g/L，接種量為10%，培養(yǎng)溫度為30 ℃，搖瓶轉(zhuǎn)速為180 r/min，培養(yǎng)5 d。測定種子液的菌體量，考察不同氮源對紅曲菌擴(kuò)大培養(yǎng)的影響。

不同無機(jī)鹽對紅曲菌的擴(kuò)大培養(yǎng)：以無機(jī)鹽的種子培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別添加硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵為無機(jī)鹽，添加量為1 g/L，接種量為10%，培養(yǎng)溫度為30 ℃，搖瓶轉(zhuǎn)速為180 r/min，培養(yǎng)5 d。測定種子液的菌體量，考察不同無機(jī)鹽對紅曲菌擴(kuò)大培養(yǎng)的影響。

1.3.2 正交試驗設(shè)計

設(shè)計以藜麥添加量、碳源添加量、氮源添加量及無機(jī)鹽添加量為因素的正交試驗，該試驗以菌體干重為評分指標(biāo)。綜合分析單因素試驗結(jié)果，由于不同濃度的硫酸鎂在整個試驗驗中所顯示出來的差異性不明顯，因此，試驗選擇藜麥添加量、碳源(蔗糖)添加量、氮源(蛋白胨)添加量為因素設(shè)計三因素三水平正交試驗，見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 The table of factors and levels of orthogonal experiment g/L

1.3.3 感官評定

利用種子液進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，其發(fā)酵工藝為：將紫紅曲霉活化后制成濃度為1×106CFU/mL的孢子懸浮液，備用；將藜麥蒸料滅菌(121 ℃,15 min)，待其冷卻后按10%的接種量接入孢子懸浮液進(jìn)行搖床培養(yǎng)(30 ℃，180 r/min)；利用正交試驗所得的最優(yōu)培養(yǎng)基組合的種子液對藜麥進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)(30 ℃，8 d)。

參考GB/T 15682-2008《糧油檢驗 稻谷、大米蒸煮食用品質(zhì)感官評價方法》對樣品進(jìn)行感官評定[10]，擬定的紅曲發(fā)酵后的藜麥參考評定表見表2。

表2 感官評分參考表Table 2 Reference table of sensory scoring

1.3.4 風(fēng)味物質(zhì)的測定

分別取混勻未發(fā)酵樣品2 g和發(fā)酵樣品2 g，置于10 mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS Stable Flex纖維頭的手動進(jìn)樣器，在60 ℃的平板加熱條件下頂空萃取50 min后，移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口(溫度250 ℃)中，熱解吸5 min進(jìn)樣。

色譜柱為HP-5MS (60 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱，柱溫40 ℃(保留2 min)，以3.5 ℃/min升溫至208 ℃，再以10 ℃/min升溫至228 ℃，運(yùn)行時間52 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純He(99.999%)；柱前壓6.89 psi，載氣流量1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣；溶劑延遲時間3 min。

離子源為EI源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1658 V；接口溫度280 ℃；質(zhì)量范圍29～500 amu。

對總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對Nist 14和Wiley 275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，確定了X種揮發(fā)性化學(xué)成分，用峰面積歸一化法測定各化學(xué)成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果分析

圖1 藜麥添加量對紅曲菌培養(yǎng)的影響Fig.1 Effect of quinoa additive amount on Monascus culture

圖2 不同碳源對紅曲菌擴(kuò)大培養(yǎng)的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on expanding culture of Monascus

圖3 不同氮源對紅曲菌擴(kuò)大培養(yǎng)的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on expanding culture of Monascus

圖4 不同無機(jī)鹽對紅曲菌擴(kuò)大培養(yǎng)的影響Fig.4 Effect of different inorganic salts on expanding culture of Monascus

由圖1可知，菌體干重隨著藜麥添加量的增加而有所增加，當(dāng)添加量為30 g/L時，菌體干重為59.49 g/L，當(dāng)藜麥添加量為50 g/L時，菌體干重達(dá)78.75 g/L，表明藜麥添加量是影響紅曲發(fā)酵藜麥的重要因素。由圖2可知，當(dāng)碳源添加量都為30 g/L時，添加蔗糖作為附加碳源對紅曲菌擴(kuò)培的促進(jìn)作用較其他兩種碳源更大，此時菌體干重達(dá)78.68 g/L，因此，選擇蔗糖作為種子培養(yǎng)基的較適合碳源。由圖3可知，當(dāng)附加氮源添加量都為20 g/L時，添加不同氮源對紅曲擴(kuò)培影響顯著，其中添加蛋白胨對紅曲菌的擴(kuò)培效果更好，因此，選擇蛋白胨作為培養(yǎng)基的最適氮源。由圖4可知，同濃度無機(jī)鹽作用下，硫酸鎂作用最為顯著，菌體干重高達(dá)77 g/L，因此，選擇硫酸鎂作為培養(yǎng)基的最適無機(jī)鹽，但因硫酸鎂濃度水平影響極不顯著，故不再分析其濃度水平。

2.2 正交試驗結(jié)果分析

表3 正交試驗結(jié)果分析Table 3 Orthogonal test results and analysis

由表3極差分析可知，3個因素對菌體干重的影響大小排序為：A>B>C，即3個因素主次關(guān)系為藜麥添加量>蔗糖添加量>蛋白胨添加量，且最終可以得出最佳種子培養(yǎng)基組合為A3B2C3，即最優(yōu)組合為：藜麥添加量100 g/L，蔗糖添加量30 g/L，蛋白胨添加量30 g/L時，最優(yōu)組合得到菌體干重為91.24 g/L。

由表4中F檢驗表方差分析可知，藜麥添加量對紅曲培養(yǎng)影響極顯著(P<0.01)，而蔗糖添加量和蛋白胨添加量的影響不顯著(P>0.05)。且3個因素影響程度的大小排序為：A>B>C，即3個因素的主次關(guān)系為藜麥添加量>蔗糖添加量>蛋白胨添加量，與表3中極差分析得到的結(jié)果一致。

表4 培養(yǎng)基正交試驗結(jié)果方差分析表Table 4 Anova of orthogonal test results of culture medium

注：R2=0.994(RAdj2=0.975)。

2.3 感官評定結(jié)果分析

圖5 感官分析雷達(dá)圖Fig.5 Sensory analysis radar map

由圖5可知，未發(fā)酵藜麥的感官綜合評分為82分，紅曲發(fā)酵藜麥的最終感官評分為90分，結(jié)果表明僅從感官方面，紅曲發(fā)酵藜麥已經(jīng)比未發(fā)酵的藜麥更加良好，尤其在色澤、氣味和組織形態(tài)方面差距最為明顯。

2.4 風(fēng)味物質(zhì)測定結(jié)果分析

圖6 未發(fā)酵藜麥風(fēng)味物質(zhì)離子流圖Fig.6 Ion flow diagram of flavor substances of unfermented quinoa

圖7 紅曲發(fā)酵藜麥風(fēng)味物質(zhì)離子流圖Fig.7 Ion flow diagram of flavor substances of quinoa by Monascus fermentation

表5 風(fēng)味物質(zhì)含量對比表Table 5 Comparison table of flavor substances content

續(xù) 表

續(xù) 表

由圖6、圖7和表5可知，在風(fēng)味物質(zhì)總數(shù)上，發(fā)酵組中共有88種化合物，未發(fā)酵組只有85種化合物，紅曲發(fā)酵藜麥總數(shù)略優(yōu)。在類別上，未發(fā)酵組中只有16種(含其他類中各類)，其中酯類化合物百分含量最高，為38.23%；其次為醚類化合物，占20.72%；其他類化合物含量都在10%以內(nèi)；發(fā)酵組風(fēng)味物質(zhì)共17類(含其他類中各類)，且其醇類化合物(24.27%)、酸類化合物(16.93%)、酯類化合物(11.55%)、烯烴類化合物(11.85%)等多種化合物的百分含量都有極明顯的提升。綜合分析，紅曲發(fā)酵后使藜麥風(fēng)味物質(zhì)更多樣化，紅曲發(fā)酵藜麥組優(yōu)于未發(fā)酵組。

3 結(jié)論

通過單因素試驗，確定了種子液培養(yǎng)基的基本成分：藜麥、蔗糖、蛋白胨、硫酸鎂。正交試驗結(jié)果顯示，最佳培養(yǎng)基配方為A3B2C3，即藜麥添加量為100 g/L，蔗糖添加量為30 g/L，蛋白胨添加量為30 g/L。由感官試驗可以得出，紅曲發(fā)酵后的藜麥整體上比未發(fā)酵的藜麥評分高，風(fēng)味物質(zhì)檢測結(jié)果表明，利用紅曲菌發(fā)酵后的藜麥風(fēng)味物質(zhì)優(yōu)于未發(fā)酵的藜麥。相對紅曲菌的應(yīng)用來說，藜麥作為發(fā)酵基質(zhì)的應(yīng)用目前還較少，2017年,劉曉艷等[11]對藜麥味噌釀造工藝進(jìn)行了研制；2018年,韓林等[12]利用酵母發(fā)酵藜麥，并對其發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化；2019年,孫子羽等[13]利用藜麥為原料發(fā)酵制造格瓦斯，并對其工藝進(jìn)行了優(yōu)化；2019年，張紛等[14]利用藜麥和小麥混合發(fā)酵制作饅頭，并對其生產(chǎn)工藝進(jìn)行了優(yōu)化。雖然我國對以藜麥為發(fā)酵基質(zhì)的研究較少，但并不是空白，本研究將益生菌——紅曲菌和全營養(yǎng)食品藜麥相結(jié)合，證實了紅曲菌可較好利用藜麥基質(zhì)，具有較好的適生性，對其培養(yǎng)基質(zhì)條件的優(yōu)化無論是為將來藜麥飲料的開發(fā)還是藜麥調(diào)味品的開發(fā)都奠定了一定基礎(chǔ)。