劉金濤，李 玲，董家吏，焦必寧，蘇學(xué)素*

(1.西南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院/西南大學(xué)柑橘研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑橘產(chǎn)業(yè)質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，重慶 400712)

圖1 柚皮素的分子結(jié)構(gòu)

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有一種或多種足夠均勻和準(zhǔn)確的特性值、高精確度和溯源性，可用來校準(zhǔn)測(cè)量裝置，評(píng)價(jià)測(cè)量方法或給材料賦值，是測(cè)試分析技術(shù)的保障、量值傳遞和量值溯源的基礎(chǔ)[1]。

柚皮素(Naringenin)屬于二氫黃酮類化合物，是柚皮苷的苷元，主要存在于柑橘類水果、蔬菜、堅(jiān)果及其他植物中[2]，其分子式為C15H12O5，分子結(jié)構(gòu)見圖1。病理學(xué)研究表明，柚皮素具有抗菌消炎、抗癌、抗腫瘤、改善糖尿病、預(yù)防老年癡呆癥等多種生理功能[3-5]，可被開發(fā)應(yīng)用于食品和藥品行業(yè)。目前，我國(guó)尚無市售柚皮素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，研制柚皮素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)能夠保證柚皮素檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可比性和溯源性。質(zhì)量平衡法可直接溯源到國(guó)際單位制(SI)中的質(zhì)量(kg)，是一種潛在的基準(zhǔn)方法，被世界衛(wèi)生組織和歐洲藥典推薦為藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值方法[6-7]。差示掃描量熱法(DSC)具備試樣用量少、操作簡(jiǎn)單、無需分離雜質(zhì)、能測(cè)定物質(zhì)的絕對(duì)純度等優(yōu)點(diǎn)，適合于高純度化工醫(yī)藥產(chǎn)品的測(cè)定，是美國(guó)藥典推薦的藥品純度檢驗(yàn)及生產(chǎn)質(zhì)量控制方面的首選方法[8]。本研究同時(shí)采用以上兩種方法對(duì)柚皮素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定值分析，其中質(zhì)量平衡法包括液相色譜法測(cè)定主成分的含量，以及水分、無機(jī)雜質(zhì)和殘留溶劑的分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的相關(guān)要求和技術(shù)規(guī)范，對(duì)柚皮素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性考察及不確定度評(píng)價(jià)[9]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

600 MHz核磁共振譜儀(瑞士Bruck公司)；紫外可見近紅外光譜儀(日立有限公司)；HP1200高效液相色譜儀，VWD檢測(cè)器(美國(guó)Agilent公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；XC841遠(yuǎn)紅外鼓風(fēng)干燥箱(吳江市新成烘箱制造廠)；ZF-1三用紫外分析儀(上海力辰科技有限公司)；DL32型卡爾費(fèi)休水分測(cè)定儀，XS205十萬分之一分析天平(瑞士梅特勒公司)；DSC60-Plus(日本島津公司)；Agilent5110ICP-OES，Agilent 6890N氣相色譜儀,Agilent G1888頂空進(jìn)樣器(美國(guó)Agilent公司)；Y101超純水儀(美國(guó)Millipore公司)。

柚皮素樣品(上海源葉生物有限公司，純度98.5%)；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、氯仿、二氯甲烷、無水乙醇(色譜純，美國(guó)Merck公司)；C18硅膠(美國(guó)Sigma公司)；液體水分含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBWE130654)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

將150 g反相C18硅膠在甲醇中浸泡12 h，搖勻裝入內(nèi)徑40 mm的層析柱中，以洗脫劑水-甲醇(65∶35，體積比)平衡層析柱。稱取300 mg柚皮素樣品，用3.9 mL甲醇溶解后加入2.1 mL超純水，搖勻，用滴管緩慢滴入層析柱中，加入洗脫劑水-甲醇(65∶35)洗脫，并用20 mL玻璃試管收集洗脫液，隨后用毛細(xì)管吸取少量洗脫液在硅膠板上點(diǎn)樣，將可在紫外燈下顯色的洗脫液合并，旋蒸除去溶劑，即得到標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品。經(jīng)液相檢測(cè)，樣品純度從98.89%提高到99.85%。重復(fù)上述操作，將得到的柚皮素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品混合均勻，于105 ℃烘箱中干燥6 h，分裝到棕色樣品瓶中，每個(gè)單元包裝量為20 mg，共制備120瓶。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 液相色譜分析條件通過優(yōu)化色譜柱種類(XDB-C18、SB-C18和XBridge-C18)、流動(dòng)相比例(V水相∶V有機(jī)相=60∶40、65∶35、70∶30)以及樣品質(zhì)量濃度(100、300、500、700、1 000 mg/L)，得到液相色譜定值條件為：Agilent1200液相色譜儀；Agilent XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相：0.2%乙酸水溶液-乙腈(70∶30)；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；樣品質(zhì)量濃度：700 mg/L；檢測(cè)波長(zhǎng)：290 nm。

1.3.2 水分測(cè)定條件將樣品于105 ℃烘箱中干燥6 h后進(jìn)行水分測(cè)定。環(huán)境條件為溫度：25 ℃，濕度：23%。開啟卡爾費(fèi)休水分儀，待儀器穩(wěn)定后開始測(cè)定。用微量注射器吸取30 μL液體水分含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)。每次準(zhǔn)確稱取10 mg樣品，迅速加入滴定池內(nèi)，輸入稱樣質(zhì)量，讀取水分值。

1.3.3 殘留溶劑測(cè)定條件色譜柱：DB-624(0.32 mm×1.8 μm,30 m)，載氣：氫氣，流速：40 mL/min，空氣流速：400 mL/min，檢測(cè)器溫度：260 ℃；程序升溫條件：初始溫度保持5 min，以7 ℃/min的速率升溫至60 ℃，再以15 ℃/min的速率升溫至190 ℃。

頂空進(jìn)樣器條件：進(jìn)樣量：1 mL；恒溫爐溫度：90 ℃；樣品流路溫度：105 ℃；傳輸線溫度：120 ℃。

1.3.4 無機(jī)雜質(zhì)測(cè)定條件ICP-OES儀器工作參數(shù)：射頻功率：1 300 W；等離子體流速：4 L/min；輔助氣流速(Ar)：5 L/min；觀察高度：7.8 mm；蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速：30 r/min；檢測(cè)時(shí)間20 s。

1.3.5 DSC測(cè)定條件準(zhǔn)確稱取4～6 mg樣品于鋁坩堝中，用卷邊器密封，置于DSC儀中。參比：空的40 μL標(biāo)準(zhǔn)鋁坩堝；N2流速：50 mL/min；程序升溫：20～230 ℃，10 ℃/min；230～260 ℃，1 ℃/min；純度分析軟件：TA acquisition。

1.4 均勻性檢驗(yàn)與穩(wěn)定性考察

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的技術(shù)規(guī)范，從分裝好的120瓶樣品中，隨機(jī)抽取15瓶進(jìn)行編號(hào)，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。用甲醇溶解，配成質(zhì)量濃度為700 mg/L的溶液，采用高效液相色譜法進(jìn)行純度檢測(cè)，測(cè)得數(shù)據(jù)采用方差分析法(F檢驗(yàn)法)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。

采用線性擬合法對(duì)柚皮素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行長(zhǎng)期和短期穩(wěn)定性考察。長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察：將樣品保存在4 ℃條件下，用液相色譜法在第0、1、2、4、6月進(jìn)行檢測(cè)，每次抽取2個(gè)樣品單元，每個(gè)單元重復(fù)測(cè)定3次。短期穩(wěn)定性考察：取3組樣品(每組5瓶)分別在20、40、60 ℃條件下保存，于第1、3、5、7、9 d取樣進(jìn)行檢測(cè)，采用趨勢(shì)分析(t檢驗(yàn)法)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 原料定性分析

在紅外光譜儀上測(cè)定柚皮素的紅外光譜，3 279 cm-1處有強(qiáng)而寬的吸收峰，為羥基的伸縮振動(dòng)峰，由氫鍵締合后的羥基引起；1 633 cm-1處的強(qiáng)吸收為羰基的伸縮振動(dòng)峰；1 518、1 497、1 463 cm-1處為苯環(huán)骨架的伸縮振動(dòng)峰。樣品的紅外譜圖(圖2A)與標(biāo)準(zhǔn)紅外譜圖(圖2B)吸收峰一致。

圖2 柚皮素樣品紅外光譜(A)與柚皮素標(biāo)準(zhǔn)紅外光譜(B)

測(cè)定柚皮素樣品的核磁共振氫譜，其化學(xué)位移及對(duì)應(yīng)的質(zhì)子數(shù)為：12.15(1H,s,Ar-OH),10.76(1H,s,Ar-OH),9.57(1H,s,Ar-OH),7.32(2H,dd,J=8.5,4.9 Hz,H-2*,H-6*),6.80(2H,d,J=1.2 Hz,H-6,H-8),5.89(2H,m,H-3*,H-5*),5.43(1H,m,H-2),3.23(1H,m,H-3),2.88-2.61(1H,m,H-3)。樣品的核磁氫譜與標(biāo)準(zhǔn)核磁氫譜相同(圖3)。因此可以確認(rèn)樣品為柚皮素。

圖3 柚皮素樣品核磁氫譜(A)與柚皮素標(biāo)準(zhǔn)核磁氫譜(B)

2.2 純度定值

為了提高定值準(zhǔn)確度，同時(shí)采用質(zhì)量平衡法和差示掃描量熱法兩種不同原理的方法對(duì)柚皮素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定值分析。

2.2.1 質(zhì)量平衡法質(zhì)量平衡法又叫雜質(zhì)扣除法，指通過測(cè)定所有雜質(zhì)的含量從而得到樣品的純度[10]。由于液相色譜面積歸一化法測(cè)定純度值的局限性，樣品中的水分、無機(jī)雜質(zhì)和殘留溶劑均無法檢出[11]。因此分別采用卡爾費(fèi)休庫(kù)倫法、等離子體原子吸收光譜法和頂空氣相色譜法測(cè)定樣品中相關(guān)雜質(zhì)的含量，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行校正。

純度計(jì)算公式為：PMB=(1-Xmoi-Xele-Xvola)·P0

(1)

圖4 柚皮素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)液相定值色譜圖

圖5 柚皮素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的DSC圖譜

式中：PMB為質(zhì)量平衡法定值結(jié)果；P0為主成分含量；Xmoi為水分含量；Xele為無機(jī)雜質(zhì)含量；Xvola為殘留溶劑含量。

(1)主成分的測(cè)定：采用液相色譜法測(cè)定柚皮素主成分的含量，重復(fù)測(cè)定7次，主成分測(cè)定結(jié)果的平均值為99.85%，液相定值色譜圖如圖4所示。

(2)水分、殘留溶劑和無機(jī)雜質(zhì)的測(cè)定：樣品在105 ℃干燥6 h后采用卡爾費(fèi)休庫(kù)倫法測(cè)定水分值，殘留溶劑含量采用頂空氣相色譜法測(cè)定，無機(jī)雜質(zhì)含量采用ICP-OES法測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表1所示。結(jié)果顯示，柚皮素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)水分含量為0.655 1%,無機(jī)雜質(zhì)含量為0.004 27%,殘留溶劑含量為0.042 57%。質(zhì)量平衡法得到的柚皮素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度值為99.14%。

2.2.2 DSC法DSC法測(cè)定樣品的純度以范德霍夫熔點(diǎn)下降理論為依據(jù)，由于柚皮素含有雜質(zhì)，其熔點(diǎn)有所降低，熔點(diǎn)的降低值與雜質(zhì)的摩爾分?jǐn)?shù)之間符合范德霍夫方程[12-14]：

(2)

式中，T0為純樣品的熔化溫度；TS為實(shí)際樣品的熔化溫度；R為氣體常數(shù)；ΔHf為純樣品的摩爾熔化焓；F為熔化了的樣品分?jǐn)?shù)；x為雜質(zhì)摩爾分?jǐn)?shù)。

表1 柚皮素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果

柚皮素的DSC測(cè)定曲線如圖5所示，DSC法得到的柚皮素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度值為99.16%(表1)。將質(zhì)量平衡法和DSC法測(cè)得的兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行等精度檢驗(yàn)，t(0.80)

2.3 均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

高效液相色譜法均勻性檢驗(yàn)結(jié)果見表2，經(jīng)計(jì)算F=2.01，查臨界值表F0.05(14,30)=2.04。F

表2 柚皮素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

2.4 穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果通過高效液相色譜法對(duì)柚皮素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。采用線性擬合法進(jìn)行分析。以x代表時(shí)間，y代表純度值，擬合成一條直線，設(shè)時(shí)間對(duì)純度值的方程為y=b0+b1x，采用t檢驗(yàn)法來檢驗(yàn)斜率b1的顯著性,從而評(píng)估長(zhǎng)期穩(wěn)定性。當(dāng)|b1|>t0.95,n-2·S(b1)時(shí),斜率被認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的,其中S(b1)是斜率的不確定度,t0.95,n-2是95%置信度,n-2自由度下的臨界t值。經(jīng)計(jì)算|b1|

表3 柚皮素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果短期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)的處理方式與長(zhǎng)期穩(wěn)定性一樣,采用t檢驗(yàn)法來檢驗(yàn)斜率b1的顯著性,從而評(píng)估短期穩(wěn)定性。經(jīng)計(jì)算在20、40、60 ℃下的|b1|均小于t0.95,n-2·S(b1)(表4)，表明在模擬運(yùn)輸條件下柚皮素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)9 d穩(wěn)定性良好。

表4 柚皮素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

2.5 不確定度評(píng)定

根據(jù)《JJF1342-2012 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》[15]，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)總的不確定度包括以下3個(gè)方面：(1)樣品均勻性引入的不確定度uH；(2)樣品穩(wěn)定性引入的不確定度us(包括長(zhǎng)期穩(wěn)定性不確定度ults和短期穩(wěn)定性不確定度usts)；(3)樣品定值引入的不確定度uchar。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的合成不確定度為：

(3)

2.5.1 均勻性引入的不確定度

2.5.2 穩(wěn)定性引入的不確定度

2.5.3 定值引入的不確定度

(1)質(zhì)量平衡法定值引入的不確定度：

質(zhì)量平衡法定值的不確定度uMB計(jì)算公式如下：

(4)

其中：uMB、u(P0)、u(Xmoi)、u(Xele)、u(Xvola)分別為質(zhì)量平衡法定值不確定度、液相色譜法測(cè)定主成分的不確定度、水分測(cè)定不確定度、無機(jī)雜質(zhì)測(cè)定不確定度和殘留溶劑測(cè)定不確定度。

液相色譜法測(cè)定的不確定度主要由兩部分組成。分別為：(1)測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性引入的不確定度u1,由多次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算；式中，Bimax為在6個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)下雜質(zhì)成分i的最大百分比含量;Bi定值λ為定值波長(zhǎng)下的雜質(zhì)成分i的百分比含量。(2)主成分和雜質(zhì)最大響應(yīng)波長(zhǎng)差異引入的不確定度u2。

(5)

表5 不同波長(zhǎng)下主成分和雜質(zhì)的響應(yīng)

(續(xù)表5)

Wavelength/nmImpurities contents/%Impurity 1(2.88 min)Impurity 2(3.41 min)Impurity 3(4.18 min)Impurity 4(8.16 min)Impurity 5(9.15 min)Impurity 6(10.91 min)2900.050.030.020.010.010.013000.120.030.020.040.020.083050.070.040.030.030.020.01310-0.020.020.040.020.01ui0.070.030.040.030.010.07u20.066 7

液相色譜法的合成不確定度為：

(6)

無機(jī)雜質(zhì)和殘留溶劑的含量很少，因此主要考慮測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度。無機(jī)雜質(zhì)測(cè)定的不確定度u(Xele)為0.000 4%，殘留溶劑測(cè)定的不確定度u(Xvola)為0.001 0%。

因此，質(zhì)量平衡法的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

(7)

(2)差示掃描量熱法引入的不確定度：

DSC法定值引入的不確定度uDSC分為A類不確定度和B類不確定度。A類不確定度由測(cè)量的重復(fù)性引起，用測(cè)量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差來計(jì)算。B類不確定度是儀器設(shè)備或測(cè)量條件等影響因素引入的不確定度。將ΔHf=Q·M/m代入公式(2)可得：

(8)

式中：x表示雜質(zhì)的摩爾分?jǐn)?shù)；R為氣體常數(shù)；T0和TS分別表示純樣品和實(shí)際樣品的熔化溫度；ΔHf表示摩爾熔化焓；Q為樣品熱焓；m為樣品質(zhì)量；M為樣品摩爾質(zhì)量;F為熔化了的樣品分?jǐn)?shù)。

DSC法測(cè)量中的B類不確定度由以下公式計(jì)算：

(9)

式中，u(x)為雜質(zhì)含量測(cè)定的偏差，u(Q)為銦標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的熱焓測(cè)定值與實(shí)際值的偏差，u(F)為熔融峰面積計(jì)算的偏差，u(TS)為銦標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)熔點(diǎn)不確定度，u(m)為天平稱量和檢定的不確定度。

2.5.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的合成及擴(kuò)展不確定度下表所示為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值過程中各不確定度的分量，將其合并得到標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的總不確定度。

ParametersValue/%均勻性不確定度uH0.004 3長(zhǎng)期穩(wěn)定性不確定度ults0.006 1短期穩(wěn)定性不確定度usts0.037 3質(zhì)量平衡法定值不確定度uMB0.069 0差示掃描量熱法定值不確定度uDSC0.040 3

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的合成不確定度：

(10)

擴(kuò)展不確定度為：U=uC×k≈0.2%(k=2)。

3 結(jié) 論

本文以反相硅膠柱層析法純化得到柚皮素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用質(zhì)量平衡法和差示掃描量熱法進(jìn)行定值分析。定值結(jié)果不確定度較低，表明質(zhì)量平衡法和DSC法作為純度定值方法具有很高的準(zhǔn)確性。柚皮素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)水分含量較高，可能由于烘箱干澡法效果不理想，可嘗試同時(shí)使用真空冷凍干燥。另外，采用卡爾費(fèi)休法測(cè)定微量水分時(shí)，稱樣量的選擇要保證測(cè)量結(jié)果的均勻性。通過高效液相色譜法進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)和穩(wěn)定性考察，研制的柚皮素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性、穩(wěn)定性良好，純度值為99.2%，擴(kuò)展不確定度U=0.2%(k=2)，有效期為6個(gè)月。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)于柚皮素樣品分析檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、量值溯源和量值傳遞具有重大意義。