崔鈺瑩，于欣楷，章 航，梁鵬宇,崔 鼎，徐 童，杜振霞*，謝云峰

(1.北京化工大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，北京 100029；2.中糧營養(yǎng)健康研究院 營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室，北京 102209)

食品工業(yè)一直努力改善乳制品風(fēng)味，為消費者提供多重選擇。乳品經(jīng)煮開后自然發(fā)酵產(chǎn)生的發(fā)酵乳種類豐富，風(fēng)味獨特，更易被人體吸收利用[1-2]。然而，在熱處理過程中易發(fā)生一種普遍的非酶褐變現(xiàn)象(即美拉德反應(yīng))，該反應(yīng)會產(chǎn)生抗?fàn)I養(yǎng)和有毒化合物，并改變發(fā)酵乳的感官和功能特性[3]。炭燒風(fēng)味發(fā)酵乳在發(fā)酵的基礎(chǔ)上進行長時間低溫烤制，使牛奶中的乳糖焦糖化，美拉德反應(yīng)充分，自然形成褐色酸奶，口感焦香濃郁[4-6]。美拉德反應(yīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的羥甲基糠醛(5-HMF)是衡量反應(yīng)程度的重要指標(biāo)，其經(jīng)水解可產(chǎn)生糠醛(F)、甲基糠醛(MF)、2-乙?；秽?FMC)，是美拉德反應(yīng)的晚期產(chǎn)物[7]。據(jù)報道，此4種糠醛類物質(zhì)均有不同程度的毒性，對人體健康具有潛在危害[8]。因此，發(fā)酵乳的營養(yǎng)價值及質(zhì)量問題備受消費者和科研工作者關(guān)注。

目前，國內(nèi)外報道了很多用于分離分析牛乳、蜂蜜、調(diào)味品、飲料和酒類中糠醛類物質(zhì)的方法[9-15]，如劉暢等[16]采用HPLC法檢測褐色酸奶中5-羥甲基糠醛；林曉珊等[17]利用GC-MS/MS快速測定了調(diào)味品中3種糠醛類物質(zhì)；孫瑤等[18]應(yīng)用一種基于氮酮形成的柱前熒光衍生化方法測定牛奶粉和葡萄干中的羥甲基糠醛、糠醛、甲基糠醛、2-乙?；秽?。然而，對發(fā)酵乳中上述4種糠醛類物質(zhì)同時檢測的方法尚未見報道。本研究建立了一種發(fā)酵乳中上述4種糠醛類物質(zhì)同時檢測的GC-MS/MS方法，采用QuEChERS前處理技術(shù)[19-20]，有效降低了基質(zhì)干擾，操作簡單，靈敏度高，重現(xiàn)性好，是一種快速有效的檢測方法。通過該方法可判斷發(fā)酵乳生產(chǎn)工藝對其糠醛危害物產(chǎn)生量的影響，進而為消費者提供合理的選購建議與指導(dǎo)，具有一定的創(chuàng)新性和實用價值。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo TQS8000氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(賽默飛公司)，配RTX-WAX色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；MX-S渦旋振蕩器(萬順儀器公司)；SB-3200DTDN超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；RJ-2GL-1850臺式高速離心機(無錫市瑞江分析儀器有限公司)；0.22 μm有機濾膜(安捷倫公司)。

羥甲基糠醛(5-HMF)、糠醛(F)、甲基糠醛(MF)、2-乙酰基呋喃(FMC)標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司);乙腈(色譜純，F(xiàn)isher Chemical公司)；氯化鈉、無水乙酸鈉、無水硫酸鎂(分析純，國藥集團)；C18、PSA(Agela Technologies公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取1.00 mg 4種糠醛標(biāo)準(zhǔn)品溶于1 mL甲醇(色譜純)溶液中，分別配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL單標(biāo)貯備液，-20 ℃保存，備用。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：使用甲醇(色譜純)溶液配制質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L的4種糠醛的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱量1.0 g(精確至0.000 1 g)樣品，加入2 mL乙腈、0.6 g氯化鈉(NaCl)和0.2 g無水乙酸鈉(NaAc)鹽析破乳，充分渦旋2 min，超聲20 min，再加入0.6 g無水MgSO4除水，放入高速冷凍離心機中以6 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液加入40 mg C18、10 mg PSA和100 mg無水MgSO4凈化，渦旋，靜置，過0.22 μm PTFE膜，濾液上機測試。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

氣相色譜條件：色譜柱RTX-WAX(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，載氣為氦氣(He)，碰撞氣為氬氣(Ar)，進樣口溫度250 ℃，恒流模式，柱流量1 mL/min，升溫程序：初始溫度60 ℃，保持2 min，以20 ℃/min升至120 ℃，再以10 ℃/min升至220 ℃，保持10 min。

三重四極桿質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊源(EI)，傳輸線溫度為280 ℃，離子源溫度為300 ℃，電離能量為70 eV，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。4種糠醛類化合物的保留時間、離子信息及碰撞能量見表1。

表1 4種糠醛類化合物的保留時間、離子對以及碰撞能量

*quantitation ion pair

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化

取1 mg/L 4種糠醛類化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液上機檢測，采用全掃描確定各化合物的質(zhì)譜圖，再經(jīng)子離子掃描后，利用儀器配置的Trace Finder自動優(yōu)化軟件，確定兩個子離子豐度較高時的碰撞電壓，得到各待測物的2組母離子->子離子對，即目標(biāo)化合物的定性和定量離子對，以響應(yīng)值較高的離子對作為定量離子對，結(jié)果見表1。

基于化合物沸點及色譜柱使用范圍優(yōu)化色譜柱條件。由于目標(biāo)化合物具有醛、醚和酮官能團，因此考察HP-5和RTX-WAX兩種極性色譜柱對糠醛化合物的分離效果。結(jié)果顯示，HP-5色譜柱存在嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象，分離效率差；而RTX-WAX極性色譜柱具有尖峰和高分辨率。因此，選擇RTX-WAX色譜柱分離4種糠醛化合物。

圖1 4種糠醛類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖

在優(yōu)化條件下，F(xiàn)、FMC、MF、5-HMF得到了較好的分離，其混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖見圖1。

2.2 前處理條件的優(yōu)化

QuEChERS技術(shù)是本研究前處理的關(guān)鍵，為考慮多因素的綜合效應(yīng)，實驗選擇萃取試劑、鹽析劑用量、凈化劑用量3個因素設(shè)計實驗，每個因素取2個水平，共8組實驗，每組重復(fù)3次取平均值。實驗的因素及水平條件選擇如下：以乙腈或含有0.1%乙酸的乙腈為萃取劑；0.6 g NaCl+0.2 g NaAc或0.4 g NaCl+0.4 g NaAc為鹽析劑；40 mg C18+10 mg PSA+100 mg MgSO4或30 mg C18+20 mg PSA+100 mg MgSO4為凈化劑。結(jié)果顯示，選擇以乙腈為萃取劑，鹽析劑為0.6 g NaCl+0.2 g NaAc，凈化劑為40 mg C18+10 mg PSA+100 mg MgSO4時，4種糠醛類化合物回收率最優(yōu)，達到90.6%～122%，滿足實驗要求。

2.3 方法學(xué)評價

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍與檢出限配制4種糠醛類化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化條件下測定，以各化合物的峰面積(y)為縱坐標(biāo)，對應(yīng)質(zhì)量濃度(x,mg/L)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，糠醛、2-呋喃基甲基酮、甲基糠醛、5-羥甲基糠醛在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均不低于0.998。分別以3倍信噪比(S/N=3)和S/N=10計算方法的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，得4種糠醛類化合物的LODs為1.0～15 μg/kg,LOQs為3.0～45 μg/kg(表2)。

表2 復(fù)原乳基質(zhì)中4種糠醛化合物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、回收率、檢出限(LODs)及定量下限(LOQs)

2.3.2 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差選擇某品牌原味發(fā)酵乳，在優(yōu)化條件下測定，得糠醛、2-呋喃基甲基酮、甲基糠醛、5-羥甲基糠醛的含量分別為0.038、0.022、0.010、0.093 mg/kg，再以其為基質(zhì)進行低、中、高3個濃度水平的加標(biāo)回收實驗，每個水平平行實驗6次，計算方法的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果顯示，4種糠醛化合物在3個加標(biāo)水平下的平均回收率為82.2%～118%，RSD為0.74%～10%(表2)，表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

2.4 實際樣品測定

采集市售相同生產(chǎn)日期的發(fā)酵乳(原味發(fā)酵乳5種，炭燒風(fēng)味發(fā)酵乳6種)在優(yōu)化條件下檢測，發(fā)現(xiàn)4種糠醛化合物均有不同程度的檢出，F(xiàn)、FMC、MF、5-HMF檢出量分別為0.016～0.619、LOD～0.052、0.005～0.320、LOD～1.760 mg/kg，且5-HMF含量最高(表3)。其中樣品2和樣品6的色譜圖見圖2。

表3 11種發(fā)酵乳中4種糠醛類危害物含量

NF：not found

圖2 實際樣品色譜圖

由表3可知，4種糠醛類危害物在炭燒風(fēng)味發(fā)酵乳中的含量明顯高于在原味發(fā)酵乳中，其中5-HMF含量高出近15倍。這可能是因為發(fā)酵乳生產(chǎn)工藝中涉及原料乳進行殺菌褐變(95 ℃,150 min)，經(jīng)一些系列過程后再自然冷卻發(fā)酵[21]，該處理過程中易產(chǎn)生相應(yīng)的美拉德反應(yīng)。炭燒風(fēng)味發(fā)酵乳由鮮牛奶與糖經(jīng)過長時間的高溫加熱后得到，其中的糖(羥基化合物)與氨基酸(氨基化合物)發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生具有特殊氣味的棕褐色物質(zhì)，美拉德反應(yīng)進行更加徹底，導(dǎo)致糠醛類危害物含量明顯增高，與實驗結(jié)論相吻合。就本實驗結(jié)果而言，熱處理產(chǎn)生的糠醛類物質(zhì)，對人體健康有一定影響;原味發(fā)酵乳中糠醛類物質(zhì)含量更低，質(zhì)量更優(yōu)，從而可在兩種發(fā)酵乳的選購上為消費者提供參考依據(jù)。同時，炭燒風(fēng)味發(fā)酵乳發(fā)酵工藝復(fù)雜，成本高，建議乳制品工業(yè)在滿足風(fēng)味要求的基礎(chǔ)上，盡量減少熱處理，保證發(fā)酵乳品質(zhì)。

3 結(jié) 論

本文利用氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合QuEChERS技術(shù)，對發(fā)酵乳中4種糠醛類化合物進行了定性定量分析。該方法前處理操作簡單快速，加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均滿足要求，具有靈敏度高，檢出限低，準(zhǔn)確度好，重現(xiàn)性好等優(yōu)點。通過對原味發(fā)酵乳和炭燒風(fēng)味發(fā)酵乳中的糠醛類物質(zhì)含量的比較可間接評價其質(zhì)量優(yōu)劣。結(jié)合發(fā)酵乳生產(chǎn)工藝，探究了炭燒工藝技術(shù)對糠醛產(chǎn)生量的影響，進而對消費者合理選擇發(fā)酵乳提供建議與指導(dǎo)，同時建議乳制品工業(yè)生產(chǎn)盡量減少不必要的熱處理，保證發(fā)酵乳品質(zhì)。