李堃 劉悅 黃鵬 楊智昉 胡茜 張穎 李志宏 呂葉輝 梁樂

（1. 上海健康醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201318；2. 上海健康醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，上海 201318；3. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200025）

隨著時(shí)代的進(jìn)步，輔助生殖技術(shù)大大發(fā)展，而在此過程中精子的選擇尤為重要。精子在雄性動物遺傳信息傳遞過程中發(fā)揮著重要作用，其發(fā)生過程相對復(fù)雜。精子發(fā)生過程中，精原細(xì)胞作為精子發(fā)生的“種子”，起著十分重要的作用。根據(jù)分化的不同，精原細(xì)胞可以分為兩大類：未分化的精原細(xì)胞（Undifferentiated spermatogonia）和分化中的精原細(xì)胞（Differentiating spermatogonia）。未分化的精原細(xì)胞包括單一型和合胞體型的A型精原細(xì)胞（A single、A paired、A aligned）。A single可以通過有絲分裂形成新的A single細(xì)胞或者A paired和A aligned細(xì)胞，從而維持精原細(xì)胞的數(shù)量的穩(wěn)定。在精原細(xì)胞自身增殖過程中，有部分細(xì)胞發(fā)生分化，分化過程中依次形成A1精原細(xì)胞、A2精原細(xì)胞、A3精原細(xì)胞、A4精原細(xì)胞、In精原細(xì)胞和B型精原細(xì)胞。B型精原細(xì)胞再次分裂后則形成初級精母細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂。精原細(xì)胞的命運(yùn)和調(diào)控精原細(xì)胞的增殖或者分化的機(jī)制均尚未明確。未分化精原細(xì)胞與分化中精原細(xì)胞蛋白質(zhì)組有所不同。因此有效地將兩類精原細(xì)胞蛋白質(zhì)組的表達(dá)差異進(jìn)行探索，并且鑒定與精原細(xì)胞分化相關(guān)的蛋白質(zhì)，對于精原細(xì)胞分化的研究具有重要的意義。

未分化的精原細(xì)胞和分化中的精原細(xì)胞在形態(tài)上很難區(qū)分，其主要依靠特異性標(biāo)志物進(jìn)行區(qū)分［1］。因此很難從形態(tài)學(xué)上對精原細(xì)胞的分化調(diào)控進(jìn)行直觀分析。而未分化的精原細(xì)胞和分化中的精原細(xì)胞來自同一個(gè)體，其基因組相同，因此用基因組學(xué)的方法對精原細(xì)胞分化的調(diào)控的研究也受到局限。而因?yàn)榉只癄顟B(tài)的不同，兩類精原細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控水平（蛋白組）會發(fā)生顯著變化。因此，通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究能對精原細(xì)胞分化過程中蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有廣泛而完整的認(rèn)知，找到精原細(xì)胞分化過程中的發(fā)生改變的重要蛋白。蛋白質(zhì)組學(xué)方法通過高通量、大規(guī)模水平去研究細(xì)胞或機(jī)體內(nèi)動態(tài)變化蛋白質(zhì)的組成、翻譯后修飾及表達(dá)水平［2］，可以反映細(xì)胞或者組織整體的蛋白質(zhì)動態(tài)變化［3］，因此利用蛋白組學(xué)的方法對兩類精原細(xì)胞的研究具有整體性。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究的諸多方法中，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法（LC-MS/MS）具有高靈敏度檢測范圍、高通量和高質(zhì)量的優(yōu)勢［4］，所以我們選擇LC-MS/MS的方法對兩類精原細(xì)胞進(jìn)行研究。

通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法將兩類精原細(xì)胞的蛋白質(zhì)組鑒定出來后，我們將獲取到大量而復(fù)雜的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)。因此需通過肽段序列的注釋、數(shù)據(jù)庫的比對、GO功能分析以及KEGG通路分析等生物信息學(xué)［5］的方法將實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的有效信息篩選出來，進(jìn)而對下一步實(shí)驗(yàn)提供方向。本研究利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法（LC-MS/MS）方法結(jié)合生物信息學(xué)分析，從未分化和分化中兩類精原細(xì)胞的蛋白水平揭示調(diào)控精原細(xì)胞分化的差異蛋白，旨為兩類精原細(xì)胞的特性提供科學(xué)依據(jù)，為進(jìn)一步研究精原細(xì)胞的分化的相關(guān)分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇生后7 d雄性C57BL/6小鼠，由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心提供。抗Thy1（CD90）磁珠抗體（貨號：130-049-101德國美天旎公司）、抗c-Kit（CD117）磁珠抗體（貨號：130-091-224 德國美天旎公司）、膠原酶I，DNase I，胰蛋白酶（美國羅氏公司）、Laminin包被培養(yǎng)皿（美國BD公司）、精原細(xì)胞培養(yǎng)液：α-MEM培養(yǎng)液中添加1%FBS、1×NEAA、1×N2-1、4 ng/mL GDNF、1 000 U/mL LIF（ 美 國Gibico公司）。新鮮配制使用。DPBS，乙醚，BSA等一般化學(xué)試劑購自上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 精原細(xì)胞的分離、純化

1.2.1.1 消化分離小鼠睪丸細(xì)胞

（1）每批8-10只出生7 d小鼠，取出雙側(cè)睪丸。體視鏡下（30×）去除白膜，收集生精小管，加入3-4mL D-PBS。

（2）反復(fù)吹打分散生精小管，吸除上層液體，再加入3 mL DPBS，重復(fù)洗2遍。

（3）吸除DPBS，加入3 mL膠原酶I 1 mg/mL，于37℃孵育10-15 min。每隔5 min小心吹打，直至無明顯組織團(tuán)塊，自然沉降5 min。

（4）吸除膠原酶，DPBS洗2遍，去除DPBS。加入2 mL 0.25%和0.2 mL 10 mg/mL DNase I，37℃孵育2-5 min，充分吹打，顯微鏡下觀察，細(xì)胞基本分散，呈單細(xì)胞狀態(tài)。

（5）加入5 mL PBE液終止蛋白酶反應(yīng)。將細(xì)胞懸液經(jīng)細(xì)胞濾器過濾，收集濾過的細(xì)胞懸液，200×g離心2 min，收集細(xì)胞沉淀。

1.2.1.2 磁珠分選純化精原細(xì)胞

（1）200 μL PBE溶液重懸細(xì)胞，加入20 μL抗Thy1（CD90）或者抗c-Kit（CD117）磁珠抗體，吹打混勻，4℃孵育20 min。

（2）將磁珠分選柱置于磁力架上，加入4 mL PBE溶液洗滌柱子。然后將抗體標(biāo)記的細(xì)胞懸液小心加在分選柱中心，待液體完全進(jìn)入柱體后，加入6 mL PBE溶液洗滌細(xì)胞。

（3）用6 mL PBE溶液重復(fù)洗滌3次。

（4）將分選柱從磁力架上取下，置于15 mL離心管，向分選柱內(nèi)加入3 mL PBE溶液，將液體快速推出分選柱，收集細(xì)胞懸液，即為分離純化的精原細(xì)胞。

1.2.2 蛋白質(zhì)譜分析

1.2.2.1 蛋白質(zhì)譜分析 以8-10只小鼠取到的細(xì)胞為一組。將磁珠分選純化分離的細(xì)胞以PBS（含蛋白酶抑制劑）洗滌3次，充分去除BSA。-80℃凍存。共收集到Thy1陽性細(xì)胞3組，c-kit陽性細(xì)胞4組，進(jìn)行生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞沉淀交給中國科學(xué)院上海生化所蛋白質(zhì)組分析中心進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析：蛋白酶解，并置于反相高效液相層析柱上洗脫蛋白，然后以LTQ-Orbitrap高效液相色譜組合式高分辨率質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析。每個(gè)樣品重復(fù)3次，以排除實(shí)驗(yàn)誤差。

1.2.2.2 蛋白定量比較及生物信息學(xué)分析

（1）利用Maxquant軟件將肽段質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)在小鼠IPI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，匹配蛋白質(zhì)。以非標(biāo)記定量的方法對質(zhì)譜結(jié)果中的蛋白進(jìn)行定量，并比較兩組中含量差異的蛋白質(zhì)（P＜0.05且差異＞1.5倍）。

（2）以層次聚類分析（Hierachical cluster analysis，HCA）方法進(jìn)行聚類分析，確認(rèn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。

（3）以互聯(lián)網(wǎng)的生物信息學(xué)軟件DAVID和KEGG數(shù)據(jù)庫對質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行分析，推測差異蛋白的生物學(xué)分類和功能分類。

1.2.3 細(xì)胞標(biāo)志基因及篩選出通路中重要基因的表達(dá)分析 以Gfrα1、Plzf作為未分化精原細(xì)胞標(biāo)志，以c-Kit、Sohlh2作為分化精原細(xì)胞標(biāo)志，prp4、prp8、p68、ddx1、fkbp5、top2、uba1、ube2o、tjp1和ctnna1作為篩選出通路的相關(guān)基因，磁珠分選的兩組精原細(xì)胞，抽提總RNA后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照Premix exTaq說明書，以表1所示引物在ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行定量擴(kuò)增。記錄CT值，用2-ΔΔCT法計(jì)算mRNA表達(dá)變化。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SAS9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。流式細(xì)胞儀和免疫熒光法檢測細(xì)胞純度實(shí)驗(yàn)各組數(shù)據(jù)，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，組間樣本數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，Real-time PCR檢測標(biāo)志基因表達(dá)的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，組間樣本數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩類精原細(xì)胞的純度

經(jīng)流式細(xì)胞分選，Thy1+細(xì)胞中抗Gfrα1染色陽性率為85.65%±8.35%，而c-Kit+細(xì)胞約5.03%±1.98%（P＜0.01）。 在 c-Kit+細(xì) 胞 中， 未分化精原細(xì)胞的表面標(biāo)志Gfrα1陽性的細(xì)胞約2.41%±0.93%，c-Kit+細(xì)胞達(dá)到約90.02%±2.77%（P＜0.01）。以抗 Gfrα1抗體為一抗對 Thy1+細(xì)胞進(jìn)行染色，細(xì)胞純度 86.83%±7.35%（P＜0.01）。以抗c-Kit為一抗驗(yàn)證c-Kit+分選細(xì)胞，細(xì)胞純度90.37%±3.74%（P＜0.01）。

表1 Real-time PCR引物

2.2 兩類精原細(xì)胞蛋白質(zhì)鑒定基本結(jié)果

檢測的7組樣品，在“1%FDR” 的過濾標(biāo)準(zhǔn)下，共有 112 584條肽段，112 584條特異肽段和3 228個(gè)蛋白得到鑒定。兩類精原細(xì)胞中含量差異的蛋白質(zhì)（P＜0.05且差異＞1.5倍）共256個(gè)（表2）。分化中的精原細(xì)胞表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)數(shù)量為193個(gè)，在分化中的精原細(xì)胞表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)數(shù)量為63個(gè)。在3 228個(gè)蛋白質(zhì)中，蛋白質(zhì)長度主要集中在100-750個(gè)氨基酸（圖1-A），蛋白質(zhì)的分子量大小主要集中在100-200 kD和10-60 kD（圖1-B）。

表2 兩類精原細(xì)胞蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果

圖1 蛋白質(zhì)的分子量大小及長度

2.3 兩類精原細(xì)胞差異表達(dá)蛋白質(zhì)功能聚類

差異蛋白的富集分析發(fā)現(xiàn)，在生物過程方面，注釋結(jié)果顯示差異蛋白主要在代謝過程（Primary metabolic process），細(xì)胞代謝過程（Cellular metabolic process），分子代謝過程（Macromolecule metabolic process）和氮化合物代謝過程（Nitrogen compound metabolic process）中富集，他們占比分別17.94%，18.19%，15.06%和9.91%；在細(xì)胞組分方面，蛋白主要富集在細(xì)胞（Cell part）、細(xì)胞內(nèi)組分（Intracellular part）和細(xì)胞器（Intracellular organelle）中；在分子功能方面，鑒定到的蛋白主要參與蛋白結(jié)合（Protein binding）、核苷結(jié)合（Nucleotide binding）、水解酶活性（Hydrolase activity）和核酸結(jié)合過程（Nucleic acid binding），它們占比分別達(dá)到39.13%、30.83%、21.74%和29.64%（圖2）。

2.4 兩類精原細(xì)胞差異表達(dá)蛋白質(zhì)KEGG注釋

圖2 兩類精原細(xì)胞差異表達(dá)蛋白質(zhì)GO分析

KEGG注釋結(jié)果顯示：c-Kit陽性的精原細(xì)胞中上調(diào)的蛋白質(zhì)中有65個(gè)蛋白質(zhì)在KEGG數(shù)據(jù)庫中有功能注釋，共參與了12條代謝通路。其中，最主要的代謝通路是剪接體（Spliceosome）和泛素介導(dǎo)的蛋白水解（Ubiquitin mediated proteolysis），分別有12（6.25%）和 10（5.21%）個(gè)蛋白參與。在Kit陽性的精原細(xì)胞中下調(diào)的蛋白質(zhì)中有23個(gè)蛋白質(zhì)在KEGG數(shù)據(jù)庫中有功能注釋，共參與了6條代謝通路。其中，最主要的代謝通路是緊密連接（Tight junction），有6個(gè)（9.83%）蛋白質(zhì)參與。另外，在c-Kit陽性的精原細(xì)胞中下調(diào)的蛋白質(zhì)中有3個(gè)蛋白質(zhì)在黏著連接（Adherens junction）通路有功能注釋（圖 3）。

2.5 差異蛋白質(zhì)層次聚類分析

將256個(gè)差異蛋白進(jìn)行層次聚類分析。左側(cè)3列表示Thy1表達(dá)陽性的3組未分化的精原細(xì)胞，右側(cè)4列表示c-Kit表達(dá)陽性的4組分化中的精原細(xì)胞。圖中顏色表示表達(dá)量值，在分化中的精原細(xì)胞表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)為綠色，表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)為紅色。3組Thy1+的細(xì)胞中蛋白表達(dá)的趨勢基本一致，4組c-Kit+的細(xì)胞中蛋白的表達(dá)的趨勢基本一致。結(jié)果如圖（圖4），在c-Kit+的分化中的精原細(xì)胞中，約2/3的差異蛋白表達(dá)上升。細(xì)胞分化前后標(biāo)志基因及篩選出通路中相關(guān)蛋白表達(dá)分析的結(jié)果以Real-time PCR進(jìn)一步分析。

圖3 在分化中精原細(xì)胞中上調(diào)蛋白質(zhì)和下調(diào)蛋白質(zhì)的KEGG分析

2.6 細(xì)胞標(biāo)志基因及篩選出通路中相關(guān)基因的表達(dá)分析

通過熒光定量實(shí)時(shí)定量PCR（Real-time PCR）方 法 分 別 對 Gfrα1、Plzf、c-Kit、Sohlh2、prp4、prp8、p68、ddx1、fkbp5、top2、uba1、ube2o、tjp1和ctnna1基因在磁珠分選的兩組細(xì)胞的mRNA的表達(dá)差異?？梢娫赥hy1+細(xì)胞中Gfrα1和Plzf兩個(gè)未分化精原細(xì)胞的標(biāo)志基因的相對表達(dá)量分別可達(dá)到c-Kit+細(xì)胞的約9.47±1.29和4.40±0.59倍（P＜0.01）；緊密連接和黏著連接相關(guān)通路的tjp1和ctnna1基因的相對表達(dá)量分別可以達(dá)到c-Kit+細(xì)胞的3.04±0.22和2.33±0.15倍（P＜0.01）。而在c-Kit+細(xì)胞中kit和sohlh2兩個(gè)分化中精原細(xì)胞的標(biāo)志基因的相對表達(dá)量分別可達(dá)到Thy1+細(xì)胞的約7.38±1.07和 3.88±0.28倍（P＜0.01）；剪接體通路相關(guān)的prp4、prp8和p68基因的相對表達(dá)量分別可以達(dá)到Thy1+ 細(xì)胞的 3.15±0.52，2.32±0.44（P＜0.05）和2.60±0.14倍（P＜0.01）；DNA/RNA/蛋白合成相關(guān)的ddx1、fkbp5和top2 基因的相對表達(dá)量可以達(dá)到Thy1+細(xì)胞的 2.29±0.19，2.96±0.29和 3.02±0.18倍（P＜0.01）；泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路相關(guān)的uba1和ube2o基因的相對表達(dá)量可以達(dá)到Thy1+細(xì)胞的3.27±0.36 和 2.52±0.45 倍（P＜0.01）（圖 5）。

圖4 差異蛋白質(zhì)層次聚類分析

圖5 Real-time PCR檢測Thy1+細(xì)胞和c-Kit+細(xì)胞中的Gfrα1、Plzf、c-Kit、Sohlh2、prp4、prp8、p68、ddx1、fkbp5、top2、uba1、ube2o、tjp1 和 ctnna1基因的mRNA表達(dá)水平的相對差異

3 討論

精子的產(chǎn)生依賴于一組精原細(xì)胞（Spermatogonia）的分化，它們是在嬰兒時(shí)期通過其前體細(xì)胞生殖母細(xì)胞（Gonocytes）分化而形成。在整個(gè)成年期，精原細(xì)胞將自我更新或分化，以維持干細(xì)胞儲備，同時(shí)為生精周期提供細(xì)胞。精原細(xì)胞進(jìn)一步分化，以形成第一波生精波。精原細(xì)胞自我更新以維持干細(xì)胞的數(shù)量，以維持整個(gè)成年期的精子生成。人們較重視青春期后的精子形成，而生殖細(xì)胞發(fā)育的早期階段直到最近才引起人們的注意。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是有機(jī)大分子，是構(gòu)成細(xì)胞的基本有機(jī)物，是生命活動的主要承擔(dān)者。機(jī)體所有重要的組成部分都需要有蛋白質(zhì)的參與。精原細(xì)胞的分化有大量蛋白質(zhì)參與其中，未分化的精原細(xì)胞和分化中的精原細(xì)胞中的蛋白質(zhì)存在大量的差異蛋白質(zhì)。此前的研究都著眼于特定或不同睪丸時(shí)期的蛋白組研究［6-10］、睪丸中已經(jīng)分化的不同時(shí)期的生精細(xì)胞的蛋白組研究［11］。然而，目前對于未分化的精原細(xì)胞和分化中的精原細(xì)胞中的差異蛋白質(zhì)并未有過多討論。本研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合生物信息學(xué)的方法，篩選出了未分化精原細(xì)胞和分化中的精原細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)并嘗試揭示調(diào)控精原細(xì)胞的自我更新和分化的基因和途徑。

本研究通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析，3 228個(gè)蛋白得到鑒定。兩類精原細(xì)胞中含量差異的蛋白質(zhì)（P＜0.05且差異＞1.5倍）共256個(gè)。其中在分化中的精原細(xì)胞表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)數(shù)量為193個(gè)，在分化中的精原細(xì)胞表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)數(shù)量為63個(gè)。可見在精原細(xì)胞分化過程中，相對更多的蛋白質(zhì)的表達(dá)上調(diào)。在3 228個(gè)蛋白質(zhì)中，蛋白質(zhì)長度主要集中在100-750個(gè)氨基酸的中等大小的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的分子量大小主要集中在100-200 kD和10-60 kD兩個(gè)區(qū)間中。通過差異蛋白的富集分析發(fā)現(xiàn)來推測，精原細(xì)胞分化過程中，主要是參與細(xì)胞分子代謝的蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生了變化，說明分化中的精原細(xì)胞和未分化的精原細(xì)胞中的細(xì)胞代謝水平有明顯區(qū)別。并且通過分析細(xì)胞組分，主要是細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器的蛋白質(zhì)表達(dá)水平出現(xiàn)明顯差異，說明精原細(xì)胞分化過程中細(xì)胞內(nèi)的成分和細(xì)胞器的種類和數(shù)量都發(fā)生了明顯改變。從分子功能方面分析，鑒定到的差異蛋白主要參與蛋白結(jié)合、核苷結(jié)合、水解酶活性和核酸結(jié)合過程，說明精原細(xì)胞分化過程中細(xì)胞中的蛋白質(zhì)相互作用，蛋白質(zhì)與核酸的相互作用都比較旺盛，預(yù)示著分化中的精原細(xì)胞即將進(jìn)入減數(shù)分裂，最終分化為成熟的精子。

KEGG注釋結(jié)果顯示：分化中的c-Kit陽性的精原細(xì)胞中上調(diào)的蛋白質(zhì)中有65個(gè)蛋白質(zhì)在KEGG數(shù)據(jù)庫中有功能注釋，共參與了12條代謝通路。其中，最主要的代謝通路是剪接體和泛素介導(dǎo)的蛋白水解，剪接體依靠RNA-RNA、RNA-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)等三方面的相互作用。要涉及snRNA的堿基配對，相互識別等。它由多個(gè)核蛋白聚集而成，具有識別mRNA前體的5'剪接位點(diǎn)、3'剪接位點(diǎn)和分支點(diǎn)的功能［12］。這也與精原細(xì)胞分化過程中，精原細(xì)胞分化的眾多基因表達(dá)調(diào)控相吻合。泛素化在蛋白質(zhì)的定位、代謝、功能、調(diào)節(jié)和降解中都起著十分重要的作用。同時(shí)，它也參與了細(xì)胞周期、增殖、凋亡、分化、轉(zhuǎn)移、基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號傳遞、損傷修復(fù)、炎癥免疫等幾乎一切生命活動的調(diào)控。說明在精原細(xì)胞的分化過程中泛素化起著非常重要的作用［13］。

在分化中的c-Kit陽性的精原細(xì)胞中下調(diào)的蛋白質(zhì)中有23個(gè)蛋白質(zhì)在KEGG數(shù)據(jù)庫中有功能注釋，共參與了6條代謝通路。其中，最主要的代謝通路是緊密連接，并且有3個(gè)蛋白質(zhì)在黏著連接有功能注釋。在精原細(xì)胞分化為精子的過程中，精原細(xì)胞從睪丸生精上皮中支持細(xì)胞（Sertoli cells）形成的基底小室向近腔小室遷移。在此過程中，血睪屏障需要在特定的時(shí)間節(jié)點(diǎn)開閉。血睪屏障是生精小管與毛細(xì)血管血液之間的一層屏障結(jié)構(gòu)。包括間質(zhì)的毛細(xì)血管內(nèi)皮、基膜、結(jié)締組織、生精上皮基膜及支持細(xì)胞間的緊密連接［14-17］。血睪屏障的開閉取決于支持細(xì)胞間緊密連接的形成與否或緊密程度［18-19］。因此，分化中的精原細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的參與緊密連接的蛋白質(zhì)可能與血睪屏障的調(diào)節(jié)有關(guān)系。

通過差異蛋白質(zhì)層次聚類分析我們可以看到，3組Thy 1陽性細(xì)胞和4組c-Kit陽性細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)圖譜基本具有一致性，因此可以確認(rèn)本實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。細(xì)胞分化前后標(biāo)志基因及篩選出通路中相關(guān)基因的Real-time PCR表達(dá)分析的結(jié)果顯示，剪接體通路相關(guān)的prp4、prp8和p68基因，DNA/RNA/蛋白合成相關(guān)的ddx1、fkbp5和top2基因，泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路相關(guān)的uba1和ube2o基因在c-Kit+細(xì)胞中表達(dá)升高。而緊密連接和黏著連接相關(guān)通路的tjp1和ctnna1基因的c-Kit+細(xì)胞中表達(dá)降低。這些結(jié)果都與KEGG注釋結(jié)果相互印證。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于未分化精原細(xì)胞和分化中精原細(xì)胞的蛋白質(zhì)組進(jìn)行了鑒定及差異分析。研究發(fā)現(xiàn)，兩類精原細(xì)胞中3 228個(gè)蛋白得到鑒定，其中含量明顯差異的蛋白質(zhì)共256個(gè)。差異蛋白在生物過程方面主要在代謝過程，細(xì)胞代謝過程，分子代謝過程和氮化合物代謝過程中富集；在細(xì)胞組分方面，蛋白主要富集在細(xì)胞、細(xì)胞內(nèi)組分和細(xì)胞器中；在分子功能方面，鑒定到的蛋白主要參與蛋白結(jié)合、核苷結(jié)合、水解酶活性和核酸結(jié)合過程。兩類精原細(xì)胞中差異蛋白質(zhì)中共有88個(gè)蛋白參與了18條代謝通路。這些結(jié)果為闡明精原細(xì)胞分化的分子機(jī)制提供了新的策略與理論依據(jù)。