胡孝林 王良婷 顧瑋 羅陽

（1. 重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶 400044；2. 重慶大學(xué)醫(yī)學(xué)院，重慶 400044）

CRISPR/Cas技術(shù)作為一種革命性的基因編輯工具，被廣泛應(yīng)用于基因編輯、基因組成像等領(lǐng)域。因其獨(dú)特的精準(zhǔn)識(shí)別能力，CRISPR/Cas系統(tǒng)在生物傳感領(lǐng)域也展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。近年來，通過與核酸擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)用，CRISPR生物傳感系統(tǒng)已將檢測特異性提高到單堿基水平，并在不同亞型的病毒鑒別領(lǐng)域取得了突破性的進(jìn)展，正日趨成為臨床核酸檢測的有利工具。本文主要就CRISPR生物傳感系統(tǒng)的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 常見CRISPR/Cas系統(tǒng)及其工作原理

1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)簡介

CRISPR/Cas系統(tǒng)由簇狀規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）和CRISPR關(guān)聯(lián)蛋白（CRISPR associated，Cas）組成，是一種古生菌和細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)［1-2］。CRISPR/Cas系統(tǒng)主要包括Cas基因序列、前導(dǎo)區(qū)、重復(fù)序列區(qū)和間隔區(qū)（圖1）［3］。CRISPR/Cas系統(tǒng)種類繁多，根據(jù)發(fā)揮作用的蛋白類型，大致可分為兩類：1類為多蛋白效應(yīng)復(fù)合物；2類為單一效應(yīng)蛋白。目前常見的Cas9、Cas12a、Cas13a均屬于第2類（表1）［4］。近年來，CRISPR/Cas技術(shù)發(fā)展迅速，已被大量應(yīng)用于基因修飾［5］、基因治療［6］、生物傳感［7］等領(lǐng)域。

圖1 CRISPR/Cas系統(tǒng)示意圖

1.2 CRISPR/（d）Cas9系統(tǒng)

CRISPR/Cas9是第一個(gè)應(yīng)用于基因工程的CRISPR/Cas系統(tǒng)。Cas9蛋白含有HNH和RuvC兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域，能夠?qū)﹄p鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）進(jìn)行定點(diǎn)編輯［8］。其原理是CRISPR系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄并處理后形成由CRISPR RNA（crRNA）和反式作用crRNA（tran-activating CRISPR RNA，tracrRNA） 構(gòu) 成 的 單 導(dǎo) RNA（single guide RNA，sgRNA）。Cas9蛋白在sgRNA引導(dǎo)下形成Cas9-tracrRNA-crRNA復(fù)合物，通過掃描外源DNA序列，定位到前間隔序列鄰近基序（Protospacer adjacent motif，PAM）位點(diǎn)（通常為5'-NGG）。隨后，雙鏈DNA被部分打開，crRNA與互補(bǔ)鏈雜交，Cas9蛋白中的HNH結(jié)構(gòu)域部分切割雜交DNA鏈，而RuvC結(jié)構(gòu)域部分切割游離鏈，造成目標(biāo)DNA雙鏈斷裂［9-10］。2013 年，Gilbert等［11］通過引入催化失活突變，使Cas9的RuvC和HNH兩個(gè)結(jié)構(gòu)域失去剪切dsDNA能力，形成Cas9的突變體dCas9。dCas9既能特異性靶向dsDNA，又保留了dsDNA結(jié)構(gòu)的完整。通過在dCas9上標(biāo)記各種功能蛋白，可構(gòu)建相應(yīng)的生物傳感器以檢測靶標(biāo)序列，較傳統(tǒng)的原位雜交技術(shù)具有更高的特異性［12-13］，進(jìn)一步拓展了CRISPR/Cas系統(tǒng)在生物傳感中的應(yīng)用。

表1 常見CRISPR/Cas系統(tǒng)特點(diǎn)

1.3 CRISPR/Cas12a系統(tǒng)

CRISPR/Cas12a系統(tǒng)是由RNA引導(dǎo)的DNA靶向CRISPR系統(tǒng)。Cas12a又名Cpf1，是一種由RNA介導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶，包含一個(gè)RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域，由張鋒團(tuán)隊(duì)于2015年發(fā)現(xiàn)。與Cas9相比，Cas12a具有3個(gè)特性：（1）Cas12a能催化其自身的crRNA成熟，不需要tracrRNA參與；（2）Cas12a-crRNA復(fù)合物通過靶向一個(gè)短的T核苷酸豐富的PAM位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對靶DNA序列的精準(zhǔn)切除；（3）Cas12a切割dsDNA后，會(huì)產(chǎn)生 4-5個(gè)核苷酸的 5'缺口［14-15］。2018年，Jennifer Dounda團(tuán)隊(duì)［16］在研究Lachnospiraceae bacteriumND2006 Cas12a（LbCas12a）和Streptococcus pyogenesCas9（SpCas9）時(shí)發(fā)現(xiàn)，在 sgRNA引導(dǎo)下，LbCas12a能夠快速的降解單鏈M13DNA噬菌體而SpCas9不能。由此提出了LbCas12a在與靶DNA結(jié)合后具有強(qiáng)大的非特異性裂解單鏈DNA（singlestranded DNA，ssDNA）的能力，即“附屬切割”活性，為CRISPR/Cas系統(tǒng)在生物傳感中的應(yīng)用提供了一個(gè)新的思路。

1.4 CRISPR/Cas13a系統(tǒng)

CRISPR/Cas13a系統(tǒng)是由RNA引導(dǎo)的RNA靶向CRISPR系統(tǒng)。Cas13a又名C2c2，含有兩個(gè)HEPN結(jié)構(gòu)域，由Broad研究所最早發(fā)現(xiàn)［17］。Cas13a與Cas12a相似，都只需要crRNA引導(dǎo)，但CRISPR/Cas9和Cas12a在序列特定位點(diǎn)附近與crRNA互補(bǔ)的位置切割DNA，而Cas13a是在crRNA互補(bǔ)位置外的側(cè)翼序列附近切割靶RNA。2016年，Abudayyeh等［18］在進(jìn)行Leptotrichia shahiiC2c2（LshC2c2）的體外切割實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在靶RNA存在的情況下，LshC2c2-crRNA復(fù)合物不僅可以切割靶RNA，還可以非特異性地切割側(cè)枝單鏈RNA（singlestranded RNA，ssRNA）。Cas13a的“附屬切割”活性具有應(yīng)用于快速、高靈敏度、高特異性的生物傳感器的潛力。

2 CRISPR/Cas系統(tǒng)在生物傳感中的應(yīng)用

生物傳感器是將生物信號轉(zhuǎn)化為其他可定量的信號的檢測技術(shù)，主要可以分為核酸傳感器、酶傳感器、免疫傳感器等，近年來發(fā)展迅速。CRISPR/Cas系統(tǒng)作為基因編輯工具，大多應(yīng)用于分子傳感器，解決其特異性問題。目前已建立的一系列分子傳感器大多是將擴(kuò)增技術(shù)與CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)行整合，但各傳感器在靶標(biāo)分子類型、Cas效應(yīng)器類別、擴(kuò)增方法上存在根本差別。本文主要綜述了CRISPR/Cas系統(tǒng)在DNA、RNA及其他分子傳感中的應(yīng)用。

2.1 DNA傳感

傳統(tǒng)的生物傳感器在檢測靶標(biāo)分子時(shí)，通常需要擴(kuò)增以實(shí)現(xiàn)低濃度檢測。PCR是一種經(jīng)典核酸擴(kuò)增技術(shù)，但因擴(kuò)增時(shí)間長，逐漸被擴(kuò)增時(shí)間更短，效率更高的等溫?cái)U(kuò)增替代。喻學(xué)鋒團(tuán)隊(duì)［19］開發(fā)了一種CRISPR/Cas9觸發(fā)的內(nèi)切酶介導(dǎo)的鏈置換擴(kuò)增（CRISDA）檢測系統(tǒng)，具有aM靈敏度和單堿基特異性。CRISDA使用等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)鏈替代擴(kuò)增（Strand displacement amplification，SDA）作為擴(kuò)增手段，利用HNH結(jié)構(gòu)域失活的Cas9切割打開靶DNA的一條鏈，隨后引物結(jié)合啟動(dòng)SDA反應(yīng)，利用肽核酸探針進(jìn)行讀數(shù)。CRISDA可用于全基因組定點(diǎn)檢測，在復(fù)雜的背景干擾下仍然具有高特異性和靈敏度。除此之外，CRISDA通過引入等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，打破了傳統(tǒng)DNA傳感器對于設(shè)備的依賴性，在核酸的現(xiàn)場即時(shí)檢測中擁有巨大的應(yīng)用潛力。同時(shí)簡化了操作步驟，只需進(jìn)行簡單的引物設(shè)計(jì)即可在一個(gè)溶液體系里完成所有操作，縮短了檢測時(shí)間，在特異性上也有所提升。但受限于SDA的擴(kuò)增效率，CRISDA在靈敏度上具有一定的提升空間。

指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)（Exponential amplification reaction，EXPAR）是一種極為快速的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，可在0.5 h內(nèi)擴(kuò)增到106-108倍。但EXPAR非特異性擴(kuò)增明顯，限制了其應(yīng)用。Huang等［20］將CRISPR/Cas9與EXPAR聯(lián)用開發(fā)了Cas-EXPAR檢測系統(tǒng)用于ssDNA的快速超敏檢測，具有aM靈敏度和單堿基特異性。該系統(tǒng)通過一個(gè)獨(dú)立的反義PAM寡核苷酸來激活CRISPR/Cas9靶向dsDNA特定位點(diǎn)并切割。切割產(chǎn)物可以觸發(fā)EXPAR，產(chǎn)生大量靶標(biāo)dsDNA片段，并與SYBR Green I染料結(jié)合顯色（圖2）。Cas-EXPAR充分利用了CRISPR/Cas系統(tǒng)精準(zhǔn)識(shí)別并切割的特性，除去體系中不需要的多余片段，解決了EXPAR的非特異性擴(kuò)增問題，極大的提升了檢測速度和檢測效率。但該檢測方法需要對dsDNA進(jìn)行預(yù)處理，仍難以應(yīng)用于現(xiàn)場即時(shí)檢測。

Cas12a是由RNA引導(dǎo)的核酸酶，具有結(jié)合靶標(biāo)后非特異性裂解ssDNA的能力。王金團(tuán)隊(duì)［21］首次將CRISPR/Cas12a應(yīng)用于DNA傳感，將CRISPR/Cas12a與PCR聯(lián)用開發(fā)了快速靈敏的HOLMES（an one-Hour Low-cost Multipurpose highly Efficient System，HOLMES）系統(tǒng)。隨后對其進(jìn)行優(yōu)化，將Cas12b與擴(kuò)增效率更高的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）結(jié)合開發(fā)了HOLMES version2（HOLMESv2） 系 統(tǒng)［22］。Cas12b 同 樣具有結(jié)合dsDNA靶標(biāo)后非特異性裂解ssDNA的能力，且Cas12b切割特異性更高，但臨床樣本的檢測仍具有一定難度。

基于此，Jennifer Doudna團(tuán)隊(duì)［16］開發(fā)了DETECTR（DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter，DETECTR）生物傳感平臺(tái)，可準(zhǔn)確和快速的檢測人乳頭瘤病毒（HPV），且能鑒別不同HPV亞型，具有aM靈敏度。DETECTR使用重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase polymerase amplification，RPA）擴(kuò)增含有HPV16的質(zhì)粒，將擴(kuò)增后的HPV16質(zhì)粒、以HPV16為靶標(biāo)的LbCas12a-crRNA復(fù)合物、ssDNA熒光猝滅基團(tuán)共培養(yǎng)。LbCas12a-crRNA復(fù)合物結(jié)合靶標(biāo)DNA后，激活了其“附屬切割”活性，切割體系中的ssDNA熒光猝滅基團(tuán)，產(chǎn)生熒光信號。但用以HPV18為靶標(biāo)的LbCas12a-crRNA復(fù)合物時(shí)，不能檢測到熒光信號。與其他新型DNA傳感器相比，DETECTR不僅做到了單一病毒的檢測，還能夠區(qū)分出序列極為類似的病毒不同亞型，使現(xiàn)場即時(shí)檢測結(jié)果的判斷更為準(zhǔn)確。同時(shí)DETECTE具有檢測復(fù)雜樣本的能力，在臨床樣本檢測時(shí)，識(shí)別HPV16樣本檢測準(zhǔn)確率達(dá)到100%，HPV18樣本達(dá)到92%，在臨床診斷、現(xiàn)場檢測中擁有巨大的應(yīng)用前景。然而DETECTR存在擴(kuò)增和切割步驟需分離開的弊端，增加了檢測時(shí)間。Wang等［23］提出了一種基于CRISPR/Cas12a的快速核酸傳感策略（Cas12aVDet），將Cas12a附著在管壁上，在RPA擴(kuò)增后通過離心的方式使Cas12a加入體系，實(shí)現(xiàn)一體化檢測。該方法將檢測時(shí)間縮短到了0.5 h左右，超過了目前已知的絕大部分檢測方法。CRISPR芯片的出現(xiàn)進(jìn)一步擴(kuò)展了CRISPR-Cas9技術(shù)在DNA傳感中的應(yīng)用，使CRISPR傳感器在無需擴(kuò)增的情況下仍然具有較高靈敏度［24-25］。

圖2 Cas-EXPAR檢測ssDNA原理［20］

近年來，不斷有新的Cas蛋白被發(fā)現(xiàn)，如Cas12b、Cas14a等。這些新型Cas蛋白被報(bào)道同樣具有識(shí)別靶標(biāo)后的“附屬切割”活性。Teng等［26］開發(fā)了一種Cas12b介導(dǎo)的DNA檢測系統(tǒng)（CDetection），同樣用于HPV16和HPV18的鑒別。CDetection檢測原理與DETECTR類似，但相比于Cas12a和Cas12b對dsDNA的切割具有更高的活性和特異性，因此CDetection在檢測靈敏度上優(yōu)于DETECTR。而與同樣用Cas12b的HOLMESv2相比，CDetection使用了更為高效的RPA作為擴(kuò)增手段，且使用了dsDNA激活劑輔助Cas12b激活其“附屬切割”活性，提高了檢測的靈敏度。CDetection在分子診斷和臨床研究具有應(yīng)用潛力，但是其臨床樣本檢測效果較差，仍需進(jìn)一步優(yōu)化提高檢測準(zhǔn)確性。

Cas14蛋白是一種RNA引導(dǎo)的ssDNA靶向蛋白，其大小僅為目前已知的2類Cas效應(yīng)器的一半，但其獨(dú)特的ssDNA靶向性為DNA傳感提供了新的思路。Jennifer Doudna團(tuán)隊(duì)［27］在DETECTR的基礎(chǔ)上，將Cas12a換成Cas14a，開發(fā)了一種單核苷酸多態(tài)性基因分型系統(tǒng)（Cas14-DETECTR）。Cas14-DETECTR用含磷酸的引物擴(kuò)增DNA底物，以保護(hù)單鏈不被外切酶降解。擴(kuò)增完成后，添加T7外切酶，未經(jīng)修飾的鏈會(huì)被降解，留下可由Cas14a檢測的ssDNA底物。該方法選擇了人類HERC2基因上一個(gè)負(fù)責(zé)眼睛顏色的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)作為檢測對象，可鑒別藍(lán)眼和褐眼兩種不同類型的基因。Cas14蛋白的高保真度使Cas14-DETECTR能更為真實(shí)的反應(yīng)結(jié)果。除此之外，Cas14蛋白在直接檢測ssDNA病毒也擁有廣闊的應(yīng)用前景。

2.2 RNA傳感

RNA病毒占據(jù)了病毒的大部分，如何快速檢測RNA病毒成為了急需解決的問題。然而目前大多數(shù)RNA傳感系統(tǒng)缺乏高特異性，在實(shí)際應(yīng)用中受到阻礙。2016年，Collins教授［28］等首次將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于RNA傳感，開發(fā)了紙基寨卡病毒不同亞型檢測傳感器（NASBA/CRISPR Cleavage，NASBACC），實(shí)現(xiàn)了不同寨卡病毒亞型的區(qū)分。利用依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)（Nucleic acid sequencebased amplification，NASBA）對目標(biāo)RNA進(jìn)行高效擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物可打開試紙條上toehold生物傳感器的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，激活Lacz酶合成，通過生化反應(yīng)產(chǎn)生肉眼可見的顏色變化，以檢測寨卡病毒。進(jìn)一步將樣本與CRISPR/Cas9結(jié)合，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對PAM序列精準(zhǔn)的特異性識(shí)別，鑒別寨卡病毒不同亞型（圖3），可在3 h內(nèi)讀出結(jié)果，檢出限達(dá)到fM水平。NASBACC是第一個(gè)使用CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)行病毒亞型鑒別的傳感器，通過設(shè)計(jì)特異的sgRNA，可使Cas9對不同病毒亞型序列展現(xiàn)出不同的切割活性，解決了寨卡病毒現(xiàn)場即時(shí)檢測的難題。但Cas9僅僅只能對靶標(biāo)序列進(jìn)行切割，當(dāng)靶標(biāo)濃度過低時(shí)，往往無法產(chǎn)生可讀出的信號結(jié)果。

圖3 NASBACC檢測RNA原理［28］

Cas13a是一種由RNA引導(dǎo)的核酸酶，在crRNA引導(dǎo)下可特異性結(jié)合ssRNA，并展現(xiàn)出驚人的附屬ssRNA切割活性。目前的Cas效應(yīng)器大多是以DNA為靶向目標(biāo)，因此在RNA傳感器構(gòu)建時(shí)需要額外的逆轉(zhuǎn)錄步驟，使操作更為繁瑣，而Cas13a獨(dú)特的ssRNA靶向性解決了此問題。基于此，張鋒團(tuán)隊(duì)［29］開發(fā)了鑒別寨卡病毒不同亞型的SHERLOCK（Specific high-sensitivity enzymatic reporter unLOCKing）傳感系統(tǒng)。該系統(tǒng)使用RPA對靶標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增，可在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增出大量目的片段，極大地提高了其檢測的靈敏度。并利用Cas13a的“附屬切割”活性切割體系中的熒光報(bào)告基團(tuán)，產(chǎn)生可定量的信號（圖4）。SHERLOCK展現(xiàn)出aM靈敏度及單堿基的特異性，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了臨床檢測要求。但仍然存在一定的局限性：（1）RPA擴(kuò)增后目標(biāo)DNA拷貝數(shù)過多，導(dǎo)致熒光報(bào)告基團(tuán)飽和；（2）需額外的輔助設(shè)備。

圖4 SHERLOCK檢測dsDNA和RNA原理［29］

為了解決上述問題，張鋒團(tuán)隊(duì)［30］開發(fā)出超敏、便攜、可多重檢測的SHERLOCK version 2（SHERLOCKv2）傳感系統(tǒng)。相較于SHERLOCK，SHERLOCKv2具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）將輔助性CRISPR酶Csm6與Cas13a耦合實(shí)現(xiàn)信號增強(qiáng)，將靈敏度提高了3.5倍；（2）減少了等溫?cái)U(kuò)增時(shí)引物的加入量，避免熒光報(bào)告基團(tuán)飽和；（3）簡單便攜；（4）篩選了4種不同的Cas效應(yīng)器分別切割各自特異性的ssDNA 熒光報(bào)告基團(tuán)，可同時(shí)檢測4種不同類型的病毒。但SHERLOCKv2無法直接檢測人的體液樣本，限制了其在實(shí)際生活中的應(yīng)用。Myhrvold等［31］通過將SHERLOCK與不經(jīng)核酸提取熱處理樣品滅活核酸酶技術(shù)相結(jié)合，可以在不經(jīng)DNA/RNA提取和純化步驟的情況下，直接從臨床樣本中檢測病毒核酸，極大地簡化了操作步驟，使SHERLOCK技術(shù)在生物傳感的應(yīng)用得到進(jìn)一步的加強(qiáng)。

除了檢測寨卡病毒RNA，CRISPR傳感器還被用于檢測多種微小RNA（microRNA，miRNA）。miRNA是許多癌癥的生物標(biāo)志物，通過胞外囊泡傳遞［32］，若能在癌癥早期實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)、超敏檢測，將具有廣闊的應(yīng)用前景［33］。Qiu等［13］將滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（Rolling circle amplification，RCA）、辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）和 CRISPR/dCas9系統(tǒng)結(jié)合開發(fā)了RCA-CRISPR-split-HRP（RCH）平臺(tái)，低成本、高效檢測miRNA。RCA擴(kuò)增后，將dCas9蛋白預(yù)先與分離的HRP報(bào)告片段結(jié)合。在sgRNA的引導(dǎo)下，可在擴(kuò)增產(chǎn)物的莖環(huán)結(jié)構(gòu)周圍重新聚集HRP蛋白，從而激活HRP活性。利用3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺顯色反應(yīng)檢測靶miRNA（圖5）。該方法可在4 h內(nèi)讀出結(jié)果，靈敏度達(dá)到fM級別，且能夠檢測出具有單堿基特異性的miRNA。RCH通過RCA的特點(diǎn)將靶標(biāo)RNA轉(zhuǎn)化成dCas9可識(shí)別的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并利用dCas9蛋白的可修飾性使信號讀數(shù)方式更加簡便。

除了miRNA傳感外，CRISPR系統(tǒng)也可應(yīng)用于mRNA傳感。Li等［34］開發(fā)出一種基于邏輯門的mRNA傳感系統(tǒng)。該系統(tǒng)設(shè)計(jì)了一種具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的mRNA傳感的向?qū)NA（sgRNA），只有在同時(shí)存在mRNA和Cas9時(shí)才能觸發(fā)其切割活性，產(chǎn)生可讀出的熒光信號。通過直接對sgRNA進(jìn)行修飾使其作為一種傳感分子，為CRISPR傳感系統(tǒng)提供了一個(gè)新的思路。

2.3 其他分子傳感

雖然目前已發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas系統(tǒng)都是靶向核酸，但通過一定的信號轉(zhuǎn)換也可實(shí)現(xiàn)其他分子的檢測。Liang等［35］利用細(xì)菌變構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子（aTFs）對小分子的敏感性，開發(fā)了一種可檢測小分子的 CRISPR傳感策略（CaT-SMelor）。aTFs通常包括DNA結(jié)合域和效應(yīng)小分子結(jié)合域，將aTFs與dsDNA連接，當(dāng)靶標(biāo)小分子存在時(shí)，小分子會(huì)與aTFs結(jié)合并改變其構(gòu)象，使dsDNA脫落從而觸發(fā)Cas12a的“附屬切割”活性切割熒光報(bào)告集團(tuán)產(chǎn)生熒光信號。CaT-SMelor已成功實(shí)現(xiàn)了對人血液樣本中尿酸的檢測，且通過選擇不同的aTFs，有望實(shí)現(xiàn)其他多種小分子的檢測?，F(xiàn)目前用于核酸檢測的CRISPR傳感器種類繁多且各有特點(diǎn)（表2），但用于檢測其他生物分子的傳感器數(shù)量仍然非常少，有待進(jìn)一步開發(fā)。

圖5 RCH檢測miRNA原理［13］

表2 典型CRISPR傳感器特點(diǎn)

3 總結(jié)與展望

近年來，CRISPR傳感器逐漸往更便攜、快速、靈敏的方向發(fā)展，且如今的CRSIPR傳感器已不再局限于單一病毒DNA或RNA的傳感，而是更偏向于多重檢測及亞型鑒別?；贑RISPR/Cas9的生物傳感器，如Cas-EXPAR、CRISDA等，在特異性上高于傳統(tǒng)生物傳感器。但由于受到Cas9蛋白自身特性的限制，其讀出信號的高低完全取決于靶標(biāo)DNA的濃度，難以在靈敏度上有進(jìn)一步的提升。基于Cas12a，Cas13a，Cas14的生物傳感器，如SHERLOCK，DETECTR等，利用Cas蛋白的“附屬切割”活性對信號進(jìn)行了第二次放大，使其在靈敏度、特異性、便攜性上均更有提升，在未來也將擁有更好的發(fā)展前景。

盡管CRISPR/Cas系統(tǒng)在生物傳感領(lǐng)域已被成功應(yīng)用，但仍存在許多共性問題亟待解決：（1）不能實(shí)時(shí)監(jiān)測：現(xiàn)有的基于熒光或顯色反應(yīng)的生物傳感策略只能在反應(yīng)結(jié)束后通過肉眼或儀器讀出結(jié)果，無法觀測整個(gè)過程；（2）無法做到真正的通用檢測平臺(tái)：CRISPR/Cas系統(tǒng)中sgRNA不同則其靶向的目標(biāo)也不同，且不同的靶標(biāo)結(jié)合能力也不同；（3）環(huán)境差異可能影響檢測結(jié)果：這些檢測系統(tǒng)是在實(shí)驗(yàn)室條件下開發(fā)出來的，若今后應(yīng)用于與實(shí)驗(yàn)室相比差異較大的環(huán)境時(shí)，其效果有待觀察。因此，CRISPR生物傳感系統(tǒng)仍然有較大的提升空間。

在過去的幾年中，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了許多多功能的Cas蛋白酶（Cas12a、Cas13a等），未來也將會(huì)有更多這樣的Cas酶被發(fā)現(xiàn)。這些酶或許可以再次提高CRISPR生物傳感器的靈敏度等。而各種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的不斷改進(jìn)，也為CRISPR生物傳感器的發(fā)展提供了另一個(gè)思路。這些新的CRISPR/Cas生物傳感器或?qū)氐赘淖內(nèi)藗儗魅静『瓦z傳病快速、敏感和準(zhǔn)確診斷的認(rèn)識(shí)。