溫永琴， 徐詠強， 何建芳， 黃會杰， 朱瑩， 周嬋， 張麗君

東莞市人民醫(yī)院病理科(廣東東莞 523059)

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，Rb)基因1(RB1)是腫瘤抑制基因。RB1是第1個被克隆的腫瘤抑制基因，RB1對人類視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用[1]。既往研究[2]表明，RB1基因在乳腺癌患者中經(jīng)常發(fā)生突變，特別是在三陰性乳腺癌中。Rb蛋白主要作為轉(zhuǎn)錄輔因子起作用，它能結(jié)合激活E2Fs，E2F1/2/3a的反式激活結(jié)構(gòu)域，并募集染色質(zhì)修飾因子如組蛋白脫乙酰酶和甲基化酶以沉默基因表達(dá)[3]。Rb蛋白也結(jié)合多種其他細(xì)胞蛋白[4],但它主要通過激活E2F的調(diào)節(jié)發(fā)揮其對細(xì)胞增殖和存活的抑制作用。既往研究[5]顯示Rb基因缺失可導(dǎo)致細(xì)胞增殖的失調(diào)從而促進了癌癥的生長，且在大多數(shù)類型的癌癥中，Rb蛋白的失活伴隨著諸如p53的失活從而促進腫瘤存活途徑的誘導(dǎo)。同時，RB1基因的缺失直接影響了腫瘤患者的藥物使用，既往對于RB1基因的研究主要集中在肺癌、卵巢癌以及膀胱癌[6]，但RB1基因表達(dá)及蛋白的表達(dá)水平在乳腺癌中的作用仍未明確。因此，進一步明確RB1基因及其蛋白在乳腺癌中的表達(dá)水平對臨床特征及預(yù)后的影響，對乳腺癌的防治具有重要意義。本研究旨在探討乳腺癌患者組織中RB1基因及蛋白表達(dá)與臨床特征的關(guān)系，并分析RB1基因表達(dá)與突變對臨床預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年1月至2017年6月于我院行手術(shù)治療的乳腺癌患者共250例，取其保存的病理石蠟切片進行檢查，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理確診為乳腺癌；(2)術(shù)前未行新輔助放化療；(3)所有患者獲得完整隨訪。排除病歷資料不完整或失訪的患者，以及合并機體免疫性疾病或長期使用激素治療的患者。所有標(biāo)本均取其癌組織和癌旁組織進行后續(xù)研究，本研究獲得醫(yī)院倫理委員會審核并批準(zhǔn)。250例乳腺癌患者，年齡35～71歲，平均(54.6±7.3)歲。記錄所有患者的基本臨床資料，包括腫瘤大小、組織分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、表皮生長因子受體2(HER2)、雌激素受體(ER)、孕酮受體(PR)以及TNM分期。

1.2 免疫組化檢測 將石蠟包埋的乳腺癌組織和癌旁正常組織以5 μm厚度進行組織切片。將組織切片進行脫蠟水化后，采用檸檬酸鹽緩沖液中進行抗原修復(fù)，應(yīng)用過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。采用山羊血清進行封閉后，采用兔Anti-RB-1抗體(ab224426,Abcam)以1∶100稀釋后，在4℃條件下進行一抗孵育過夜，隨后在室溫條件下與HRP標(biāo)記的山羊二抗孵育。最后采用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)作為底物進行變色反應(yīng)，然后蘇木精復(fù)染并封片。所有切片RB1的表達(dá)水平由2位有經(jīng)驗的病理師在隨機選擇5個高倍鏡視野(200×)進行評估，具體的評估方法為：染色強度(0為未染色; 1為弱染; 2為中等染; 3為強染)，同時記錄陽性表達(dá)RB1的范圍(計分為0：<5%; 1：5%～25%; 2：26%～50%; 3：51%～75%; 4：76%～100%)。將RB1的染色強度計分和陽性表達(dá)范相乘以獲得復(fù)合表達(dá)分?jǐn)?shù)(composite expression score，CES)[7]，將得到RB1的表達(dá)水平的CES，將患者分為兩組，RB1低表達(dá)(CES <6)和高表達(dá)組(CES≥6)。

1.3 RB1表達(dá)的生物信息學(xué)分析 采用Kaplan-Meier Plotter工具(http://kmplot.com/analysis/)分析RB1基因與乳腺癌患者臨床預(yù)后的關(guān)系。采用cBioPortal工具(http://www.cbioportal.org/)分析RB1基因在乳腺癌病例集中的突變水平，并分析乳腺癌患者RB1基因突變與非突變患者臨床預(yù)后的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 RB1在乳腺癌和癌旁組織的表達(dá)水平對比 250例患者的乳腺癌和癌旁組織中，其中乳腺癌組織的RB1表達(dá)水平的CES得分平均為4.8±1.6，而癌旁組織為5.2±2.1，其中乳腺癌組織的RB1表達(dá)水平顯著低于正常癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，不同表達(dá)RB1水平的癌組織和癌旁組織見圖1。

2.2 乳腺癌RB1表達(dá)水平與乳腺癌臨床特征的關(guān)系 其中RB1表達(dá)水平與乳腺癌的年齡、組織分級、HER2、ER和PR的陽性比例均沒有顯著的相關(guān)性(P>0.05)，而RB1低表達(dá)的患者其腫瘤最大徑≥3 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的患者比例均顯著高于RB1高表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.3 乳腺癌組織中RB1表達(dá)水平與臨床預(yù)后的關(guān)系 250例乳腺癌患者隨訪時間為6～47個月，中位隨訪時間為33個月， 其中RB1高表達(dá)的患者其總體生存率顯著高于RB1低表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(HR=0.56，95%CI：0.32～0.97，P=0.036)。見圖2～3。

圖1 乳腺癌組織和癌旁組織的不同RB1表達(dá)水平(免疫組化，×200)

2.4 RB1表達(dá)與乳腺癌臨床預(yù)后的多元Cox回歸分析 Cox 多因素模型分析結(jié)果顯示乳腺癌患者的TNM分期及RB1表達(dá)水平顯著影響患者的臨床預(yù)后(P<0.05)，見表2。

3 討論

乳腺癌是一種異質(zhì)性疾病，其中不同的病理學(xué)和基因表現(xiàn)影響患者的臨床預(yù)后和治療方案。通常，ER和PR或HER2擴增狀態(tài)的存在直接影響了治療的過程[8]。由于乳腺癌中復(fù)雜的分子機制，既往研究[9]表明，RB1和Tp53是腫瘤的重要抑癌基因，也參與了乳腺癌在內(nèi)的許多人類癌癥的發(fā)生和進展。同時，有研究[10]顯示RB1和Tp53在28%～40%的三陰性乳腺癌患者中一起存在失活狀態(tài)，且通常由純合缺失引起的RB基因缺失主要發(fā)生在三陰性乳腺癌中。然而，在內(nèi)分泌治療后的促轉(zhuǎn)移性腫瘤微環(huán)境中，RB1表達(dá)損失更加明顯。既往研究[11]顯示RB也可以通過由含有CDK4/6的復(fù)合物引發(fā)的磷酸化而失活。在乳腺癌中，異常的CDK4/6活性可解除對RB磷酸化的正常控制，活性細(xì)胞周期蛋白-CDK復(fù)合物對Rb(pRb)的磷酸化導(dǎo)致E2F家族轉(zhuǎn)錄因子的釋放，以及S期進入所需基因的轉(zhuǎn)錄。CDK4/6作為治療靶標(biāo)的重要性現(xiàn)已在ER/PR陽性乳腺癌中得到充分證實。但即使這些藥物有效，仍難以阻礙疾病的臨床進展，這可能與RB1基因表達(dá)損失的有關(guān)。由于RB1基因與乳腺癌存在密切的關(guān)系，但目前對于RB1基因、蛋白表達(dá)水平以及其突變對于乳腺癌患者臨床預(yù)后的影響仍未明確。本研究擬通過臨床樣本以及生物信息學(xué)初步明確了RB1基因和蛋白高表達(dá)是乳腺癌預(yù)后良好的標(biāo)記物，但RB1基因突變的乳腺癌患者預(yù)后不良。RB1基因表達(dá)水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期密切相關(guān)，表明了抑癌基因RB1基因發(fā)生突變是影響乳腺癌預(yù)后不良的重要風(fēng)險因素。

表1 乳腺癌組織中RB1表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系 例(%)

腫瘤抑制基因RB1基因調(diào)節(jié)細(xì)胞周期導(dǎo)致細(xì)胞分裂的過程，并且CDK4和CDK6酶阻斷RB1活性，這可導(dǎo)致不受控制的細(xì)胞增殖和生長[12]。因此，本研究結(jié)果顯示，RB1蛋白在乳腺癌中的表達(dá)水平顯著下降，且RB1蛋白在乳腺癌中的表達(dá)水平與腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，本研究結(jié)果與既往研究[13]結(jié)果表明RB1基因在腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控的重要作用相一致。雖然乳腺癌的CDK 4/6抑制劑可以抑制腫瘤的增殖，但容易在治療反應(yīng)數(shù)月后出現(xiàn)耐藥性。有研究[14]表明，RB1基因的突變導(dǎo)致RB1基因功能喪失并因此導(dǎo)致促進了腫瘤對CDK4/6抑制劑的抗性。本研究中采用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫的結(jié)果顯示了雖然RB1基因高表達(dá)其乳腺癌患者預(yù)后更優(yōu)，但進一步分析RB1基因突變的患者其預(yù)后顯著差于非突變的患者，表明了RB1基因突變嚴(yán)重影響了RB1基因的抑癌功能。

注：A：不同RB1表達(dá)水平對乳腺癌總體存活率的影響(n=1 420)；B：不同RB1表達(dá)水平對乳腺癌無復(fù)發(fā)生存率的影響(n=3 951)；C：RB1突變與非突變對患者的總體存活率的影響(n=1 918)

圖2乳腺癌RB1基因表達(dá)及突變對臨床預(yù)后的影響

圖3 乳腺癌RB1表達(dá)水平與臨床預(yù)后的關(guān)系

表2 乳腺癌患者Cox多因素生存分析

本研究結(jié)果也進一步顯示，乳腺癌組織樣本中，RB1高表達(dá)患者的總體生存率更優(yōu)。既往有研究[15]表明RB1基因富集的卵巢癌患者其預(yù)后更好，聯(lián)合PD0332991 與卡鉑或紫杉醇共同治療時能顯著提高RB1基因富集卵巢癌患者的臨床療效。同時，在肺癌中，抑制RB1后可導(dǎo)致p16 表達(dá)上調(diào)，p16 保護RB1 缺乏的細(xì)胞免受DNA損傷，也導(dǎo)致了基因的不穩(wěn)定，增加了細(xì)胞的增殖功能[16]。RB1 的表達(dá)水平也是膀胱癌患者膀胱灌注化療治療效果以及腫瘤復(fù)發(fā)的預(yù)測因子[17]。而本研究結(jié)果也顯示RB1高表達(dá)水平是乳腺癌患者預(yù)后良好的重要因素。雖然本研究對納入的樣本進行了蛋白水平的評估，但本研究并未對所納入的標(biāo)本進行RB1基因突變檢測，對于RB1基因突變其對蛋白功能的影響以及對乳腺癌患者預(yù)后的影響仍需要進一步加大樣本量進行評估。

綜上所述，乳腺癌RB1表達(dá)水平與腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床預(yù)后密切相關(guān)，RB1基因高表達(dá)顯著改善乳腺癌患者的臨床預(yù)后，合并RB1基因突變的乳腺癌患者預(yù)后較差。