李金梅， 張志強(qiáng)， 劉云佳， 張東晨， 孫吉瑞， 趙文明， 陳雪， 李藝萱， 張金庫

保定市第一中心醫(yī)院病理科(河北保定 071000)

腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)指存在于腫瘤間質(zhì)和實(shí)質(zhì)內(nèi)的特殊淋巴細(xì)胞群體，有免疫調(diào)控和免疫應(yīng)答作用，其介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫具有局部持續(xù)抗腫瘤作用，可以殺傷腫瘤細(xì)胞，降低轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[1]。有研究顯示，在三陰乳腺癌中，TILs 是提示其復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志物，伴隨TILs密度的增加，其復(fù)發(fā)和病死率相應(yīng)降低[2]。多數(shù)基底細(xì)胞樣型乳腺癌中也存在較豐富淋巴細(xì)胞浸潤[3]，提示腫瘤與機(jī)體免疫系統(tǒng)相互作用較強(qiáng)，因此免疫治療也是人們一直努力探索的一條治療基底細(xì)胞樣型乳腺癌的途徑[4]。人類黏液病毒抵抗蛋白A(MxA)，是一種干擾素觸發(fā)的最大多域GTP酶，參與先天免疫系統(tǒng)對病毒感染的反應(yīng)[5]，也是監(jiān)測干擾素活性和預(yù)測干擾素治療療效的生物標(biāo)志物[2]，2016年，Kim等[2]研究發(fā)現(xiàn)MxA高表達(dá)和豐富的間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤是三陰乳腺癌患者無病生存率的獨(dú)立預(yù)后因素。眾所周知，基底細(xì)胞樣型乳腺癌與三陰乳腺癌既存在共同點(diǎn)，又存在差異性。MxA、TILs與基底細(xì)胞樣型乳腺癌的關(guān)系和作用機(jī)制在國內(nèi)外尚未報(bào)道。為此，本研究檢測MxA在基底樣乳腺癌中的表達(dá)，并初步探討其可能的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性收集保定市第一中心醫(yī)院2009年1月至2019年4月手術(shù)切除和外院會診66例基底細(xì)胞樣型乳腺癌和22例對應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性癌，92例乳腺非基底樣型浸潤性導(dǎo)管癌組織做對照組。病理標(biāo)本都是手術(shù)后立即取材，并固定于10%的中性甲醛液中，石蠟包埋。本實(shí)驗(yàn)通過醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 試劑 MxA(兔抗人多克隆抗體，克隆號：ab95926，Abcam公司)；Ki-67(鼠抗人單克隆抗體，克隆號：MIB-1，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，通用型SP免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)。

1.3 免疫組織化學(xué) 應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP方法，操作步驟均按試劑盒說明書進(jìn)行。陽性對照參照試劑說明書，陰性對照以PBS液代替一抗。

1.4 資料分析 MxA實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷：MxA在細(xì)胞胞質(zhì)著色，參照文獻(xiàn)[2]，在癌區(qū)域隨機(jī)選10個(gè)高倍鏡視野(×400)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞數(shù)，首先判斷著色強(qiáng)度：無染色為0分，輕度染色為1分，中度染色為2分，重度染色為3分，然后判斷癌細(xì)胞占所觀察癌細(xì)胞的百分比：陽性細(xì)胞數(shù)目<25%為1分，25%～75%為2分，>75%為3分，然后計(jì)算染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比率得分的乘積判定各標(biāo)本的染色得分，最后計(jì)算平均分，小于等于平均分者為低表達(dá)，高于平均分者為高表達(dá)。Ki-67在細(xì)胞核染色，在每張切片上尋找10個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)所有癌細(xì)胞，以每個(gè)視野陽性癌細(xì)胞占所有癌細(xì)胞平均比率作為Ki-67增殖指數(shù)。TILs密度計(jì)算方法[2]：腫瘤間質(zhì)浸潤淋巴細(xì)胞所占面積/腫瘤間質(zhì)面積。兩位病理學(xué)專家采用雙盲法閱片并判定結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料應(yīng)用2檢驗(yàn)、Fisher 精確概率法，計(jì)量資料用Mann-Whiney檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MxA在基底細(xì)胞樣型乳腺癌原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶和非基底樣乳腺癌的表達(dá)情況 MxA表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)，呈現(xiàn)棕黃色顆粒(圖1)。MxA在基底細(xì)胞樣型乳腺癌原發(fā)灶中的表達(dá)低于淋巴結(jié)原發(fā)灶，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=2.573，P=0.109)，見表1；MxA在基底細(xì)胞樣型乳腺癌中的陽性表達(dá)率(51.5%)高于乳腺非基底樣型浸潤性導(dǎo)管癌(33.7%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=5.039，P=0.025)，見表2。

注：A：MxA在基底細(xì)胞樣型乳腺癌癌細(xì)胞高表達(dá)；B：基底細(xì)胞樣型乳腺癌的腫瘤間質(zhì)浸潤性淋巴細(xì)胞

表1 MxA在基底細(xì)胞樣型乳腺癌原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的表達(dá)情況 例(%)

表2 MxA在基底細(xì)胞樣型乳腺癌和非基底樣型乳腺癌的表達(dá)情況 例(%)

2.2 基底細(xì)胞樣型乳腺癌中MxA表達(dá)和臨床病理特征的關(guān)系 MxA的陽性表達(dá)與基底細(xì)胞樣型乳腺癌pTNM分期相關(guān)，Ⅰ～Ⅱ期MxA的高表達(dá)率(57.1%)高于Ⅲ期(20%)(P=0.041)，與其他臨床病理特征均不相關(guān)(P>0.05)。見表3。

表3 基底細(xì)胞樣型乳腺癌中MxA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

注：*與Ⅲ期比較P<0.05

2.3 基底細(xì)胞樣型乳腺癌中MxA表達(dá)和Ki-67增殖指數(shù)的關(guān)系 MxA低表達(dá)組和高表達(dá)組的Ki-67增殖指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.185)，見表4。

表4 基底細(xì)胞樣型乳腺癌中MxA表達(dá)和Ki-67增殖指數(shù)的關(guān)系

2.4 基底細(xì)胞樣型乳腺癌中MxA表達(dá)和腫瘤間質(zhì)浸潤性淋巴細(xì)胞密度的關(guān)系 部分基底細(xì)胞樣乳腺癌中存在豐富的腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤(圖1)，MxA高表達(dá)組的腫瘤間質(zhì)浸潤性淋巴細(xì)胞密度高于MxA低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.010)，見表5。

表5 基底細(xì)胞樣型乳腺癌中MxA表達(dá)和腫瘤間質(zhì)浸潤性淋巴細(xì)胞密度的關(guān)系

3 討論

基底細(xì)胞樣型乳腺癌是一個(gè)特殊的分子亞型，其發(fā)病年輕化、惡性度高、易復(fù)發(fā)、預(yù)后差。近年來，雖然對于基底細(xì)胞樣型乳腺癌的治療取得了一定進(jìn)展，但它的療效和預(yù)后在乳腺癌的眾多亞型中仍是較差的。盡管治療之初，患者對化療反應(yīng)較其亞型更好，但大多最終難避免耐藥和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的結(jié)局，導(dǎo)致治療失敗。

MxA本是一種具有廣譜抗病毒作用的蛋白質(zhì)，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)其與多種腫瘤密切相關(guān)。目前，在肺腺癌[6]、前列腺癌[7]、結(jié)直腸癌[8]、皮膚鱗狀細(xì)胞癌[9]、淋巴瘤[10]、胚胎性橫紋肌肉瘤[11]等惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)Mx1基因的突變。另外有學(xué)者研究腫瘤中Mx1基因的22種突變與MxA蛋白功能變化的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了7種單點(diǎn)突變可能會導(dǎo)致MxA蛋白表達(dá)和功能的異常，進(jìn)而可能影響腫瘤的形成和發(fā)展[12]。然而，MxA蛋白的功能尚存在爭議，多數(shù)研究支持它是一個(gè)抑癌蛋白。如頭頸部原發(fā)鱗癌的研究中發(fā)現(xiàn)Mx1基因存在甲基化現(xiàn)象并呈抑制狀態(tài)[13]；MxA在高侵襲性前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3M中的表達(dá)被抑制，其能在體內(nèi)外抑制PC-3M細(xì)胞的游動和侵襲性[14]；MxA基因1的缺失與前列腺癌的高侵襲傾向相關(guān)[15]。

我們的研究結(jié)果顯示，MxA在基底細(xì)胞樣型乳腺癌中的陽性表達(dá)率(51.5%)高于非基底樣型乳腺癌(33.7%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并與基底細(xì)胞樣型乳腺癌pTNM分期相關(guān)，Ⅰ～Ⅱ期MxA的高表達(dá)率(57.1%)高于Ⅲ期(20%)(P=0.041)，與其他臨床病理特征均不相關(guān)，這提示MxA高表達(dá)的基底細(xì)胞樣型乳腺癌患者可能有相對好的預(yù)后。這與文獻(xiàn)報(bào)道一致。例如2016年，Kim等[2]報(bào)道MxA蛋白的高表達(dá)和豐富的間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤是三陰乳腺癌患者無病生存率的獨(dú)立的預(yù)后因素。另外，有學(xué)者報(bào)道敲除Mx1基因的前列腺細(xì)胞比MxA陽性的細(xì)胞對多西他賽的敏感性要差[16]，MxA高強(qiáng)度表達(dá)的乳腺癌患者對蒽環(huán)類藥物更敏感。MxA在基底細(xì)胞樣型乳腺癌和三陰乳腺癌的高表達(dá)，也為它們的治療提供了新的思路和可能治療的靶點(diǎn)。

據(jù)目前資料研究報(bào)道，在肺癌和乳腺癌中 miR-211過表達(dá)時(shí)可以和MxA的3′非翻譯區(qū)結(jié)合，在翻譯和轉(zhuǎn)錄水平抑制MxA的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖和浸潤[17-18]，那么在基底細(xì)胞樣型乳腺中MxA是否和增殖相關(guān)呢，本研究探討了基底樣乳腺癌中MxA表達(dá)和Ki-67增殖指數(shù)的關(guān)系，結(jié)果MxA高表達(dá)和低表達(dá)組的Ki-67增殖指數(shù)并無明顯差異，因此有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞是基于免疫系統(tǒng)提示預(yù)后的可靠標(biāo)記物。在乳腺癌分子亞型中，腫瘤細(xì)胞和免疫系統(tǒng)相互作用在不同亞型中不同。以往研究結(jié)果提示三陰乳腺癌患者有更多腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞反應(yīng)，而且間質(zhì)淋巴細(xì)胞的增加與較好的預(yù)后相關(guān)，包括降低復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險(xiǎn)，TILs的存在還是判斷新輔助化療療效的獨(dú)立預(yù)測因素[19]?；准?xì)胞樣型乳腺癌和三陰乳腺癌既存在共同點(diǎn)，又存在差異性，基底細(xì)胞樣型乳腺癌中，84%腫瘤周邊或癌細(xì)胞之間有不同程度的淋巴細(xì)胞浸潤。在我們的實(shí)驗(yàn)中，MxA高表達(dá)組的基底細(xì)胞樣型乳腺癌腫瘤間質(zhì)浸潤性淋巴細(xì)胞密度明顯高于MxA低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測基底細(xì)胞樣型乳腺癌部分患者可能誘導(dǎo)了機(jī)體較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，這部分患者中MxA和腫瘤間質(zhì)浸潤性淋巴細(xì)胞相互作用，可能在腫瘤免疫抑制腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮了一定的作用，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。