張恒威，王新軍，付旭東，周少龍，楊卓，張旭陽(yáng)，曾凡濤，劉婉清

（鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科，河南 鄭州）

0 引言

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見(jiàn)的腫瘤，發(fā)病率高、死亡率高[1]。目前膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床上膠質(zhì)瘤患者的治療效果并不理想[2]。神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)下調(diào)因子 8(neural precursor cell-expressed developmentally down regulated 8，NEDD8)是機(jī)體內(nèi)一種具有重要功能有類泛素蛋白。NEDD8通過(guò)一系列酶促反應(yīng)后可與底物蛋白共價(jià)結(jié)合，調(diào)節(jié)底物蛋白生物性質(zhì)，這一過(guò)程稱之為Neddylation[3]。大量研究證實(shí)，NEDD8的過(guò)表達(dá)與人類多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，如多發(fā)性骨髓瘤、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌和黑色素瘤等[4]。程序性死亡配體1(programmed death-ligand 1， PD-L1)是位于人染色體9q24的跨膜蛋白,是B細(xì)胞、T細(xì)胞及單核細(xì)胞表面程序性死亡分子1(programmed death-1 PD1)的配體[5]。已有研究表明，PD-L1在多種惡性腫瘤中高表達(dá),并通過(guò)激活PD1/PD-L1信號(hào)通路減弱機(jī)體免疫細(xì)胞的致死率，使惡性腫瘤細(xì)胞躲過(guò)機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)控和殺傷，從而增進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，如肺癌、肝癌、乳腺癌等[6]。目前關(guān)于NEDD8和PD-L1在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)情況的報(bào)道不多，對(duì)于二者在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)是否存在相關(guān)性的探索更少。本研究旨在通過(guò)對(duì)NEDD8和PD-L1在80例不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本及30例減壓腦組織標(biāo)本中的表達(dá)情況的分析，進(jìn)一步的揭示，NEDD8和PD-L1在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中所起的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性收集2015年01月01日至2018年03月01日在鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科接受手術(shù)治療的80位膠質(zhì)瘤患者的石蠟標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn):①初發(fā)病例且首次手術(shù)治療；②手術(shù)治療前未接受放射性療、化療及免疫治療；③所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)確診為膠質(zhì)瘤，且患者臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者或患者家屬拒絕參與研究；②各種原因?qū)е碌幕颊吣z質(zhì)瘤標(biāo)本丟失。80位患者中男 46例，女 34 例；中位年齡 40(17～78)歲，其中＜40歲29例，≥40歲51例；患者術(shù)前頭顱MRI顯示：21例腫瘤位于枕葉，22例位于顳葉，37例位于額葉；80例膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本，參照2007版世界衛(wèi)生組織中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類系統(tǒng)，星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤33例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤25例，膠母細(xì)胞瘤22例。低級(jí)別膠質(zhì)瘤(1ow grade gliomas，LOG)27例，高 級(jí) 別 膠 質(zhì) 瘤(high grade gliomas，HGG)53例。另選取同期因顱腦損傷于該院行“去骨瓣減壓術(shù)”的30位患者的減壓腦組織作為對(duì)照。標(biāo)本取得后置于-800C冰箱冷凍保存。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬知情同意。

1.2 主要試劑和儀器

NEDD8兔單克隆抗體購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司（貨號(hào)BS-10222R）、兔多克隆抗體購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)PV-900）；PD-L1兔單克隆抗體購(gòu)于Cell Signaling公司(貨號(hào)13684T)、兔多克隆抗體CMTM6購(gòu)于Abcam公司(貨號(hào)ab198284)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液、NC膜等實(shí)驗(yàn)試劑均購(gòu)于武漢賽維爾生物有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織及對(duì)照腦組織NEDD8和PD-L1表達(dá)

取手術(shù)切除對(duì)照腦組織常規(guī)制作石蠟標(biāo)本。膠質(zhì)瘤石蠟標(biāo)本與對(duì)照腦組織石蠟標(biāo)本5μm厚連續(xù)切片。切片貼敷于經(jīng)過(guò)防脫劑處理過(guò)的載玻片上，滴加NEDD8和PD-L1單克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜；PBS洗滌，滴加多克隆抗體；室溫孵育30min后再次使用PBS沖洗，然后滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液；室溫下再次孵育30min后加二氨基聯(lián)苯胺顯色液顯色，沖洗后蘇木素復(fù)染，采用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，最后中性樹(shù)膠封片。用PBS液染色替換一抗，做陰性對(duì)照切片。切片制作全部完成后，置于顯微鏡下觀察。在常規(guī)顯微鏡視野（×200）下，選擇每張切片免疫應(yīng)答最典型區(qū)域，并在高倍視野（×400）中隨機(jī)觀察5個(gè)非重復(fù)視野。計(jì)數(shù) NEDD8和PD-L1染色細(xì)胞及視野中全部細(xì)胞數(shù)。其中陽(yáng)性細(xì)胞百分比≤25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分；根據(jù)染色程度評(píng)分：陰性者0分，淡黃色者1分，黃色或棕黃色者2分，褐色者3分。最后以兩者評(píng)分的總和為最終評(píng)分，2～6分為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.4 Western Blot檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織NEDD8和PD-L1表達(dá)

取冰凍組織 300 mg切碎，置于勻漿器中以充分裂解組織中的NEDD8和PD-L1，以Western Blot標(biāo)準(zhǔn)操作步驟進(jìn)行，檢測(cè)出NEDD8和PD-L1表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)分析由SPSS 22.0軟件完成。計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差）表示。NEDD8和PD-L1在試驗(yàn)組與對(duì)照組腦組織中陽(yáng)性表達(dá)率采用χ2檢驗(yàn)比較；兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)用于比較不同病理級(jí)別膠質(zhì)瘤NEDD8和PD-L1表達(dá)；采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法分析試驗(yàn)組NEDD8和PD-L1表達(dá)與患者年齡、性別、膠質(zhì)瘤病理類型、膠質(zhì)瘤位置、膠質(zhì)瘤直徑、膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的關(guān)系；利用列聯(lián)系數(shù)分析試驗(yàn)組膠質(zhì)瘤組織中 NEDD8和PD-L1表達(dá)的關(guān)聯(lián)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)均為a=0.05。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)NEDD8和PD-L1的表達(dá)

NEDD8在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都有表達(dá)，顯微鏡下觀察，陽(yáng)性細(xì)胞染色呈淡黃色至棕褐色不等。PD-L1表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，顯微鏡下觀察，陽(yáng)性細(xì)胞染色亦是呈淡黃色至棕褐色不等。試驗(yàn)組NEDD8和PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率分別為85.00%，78.75%，對(duì)照組NEDD8和PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率分別為30.00%，13.33%，由此可見(jiàn)NEDD8和PD-L1在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)明顯高于在對(duì)照腦組織中的表達(dá)（P均＜0.001），如圖1、表1。

表1 NEDD8和PD-L1在對(duì)照腦組織和膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況

2.2 Western Blot檢測(cè)NEDD8和PD-L1表達(dá)

如圖2、表2所示，HGG組NEDD8和PD-L1表達(dá)水平高于LOG組的表達(dá)水平(P均＜0.001)。

圖1 不同病理級(jí)別膠質(zhì)瘤組織和對(duì)照腦組織中NEDD8和PD-L1 的表達(dá)（SP,×400）A: 對(duì)照腦組織NEDD8表達(dá); B:低級(jí)別膠質(zhì)瘤NEDD8表達(dá); C:高級(jí)別膠質(zhì)瘤NEDD8表達(dá); D: 對(duì)照腦組織PD-L1表達(dá); E:低級(jí)別膠質(zhì)瘤PD-L1表達(dá); F: 高級(jí)別膠質(zhì)瘤PD-L1表達(dá)

圖2 不同病理級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中NEDD8和PD-L1的表達(dá)

表2不同病理級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中 NEDD8和PD-L1 表達(dá)水平

2.3 試驗(yàn)組膠質(zhì)瘤組織中NEDD8和PD-L1的表達(dá)與相關(guān)臨床因素的關(guān)系

經(jīng)過(guò)分析，試驗(yàn)組膠質(zhì)瘤組織中NEDD8和PD-L1的表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別、腫瘤直徑有關(guān)系（P均＜0.05），而與病人年齡，性別，腫瘤部位，腫瘤細(xì)胞類型均無(wú)關(guān)系（P均＞0.05）。隨著膠質(zhì)瘤病理級(jí)別升高、腫瘤直徑增大，NEDD8和PD-L1的陽(yáng)性表達(dá)率均增高（P均＜0.05），如表3所示。

2.4 試驗(yàn)組膠質(zhì)瘤組織中 NEDD8和PD-L1表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)性

試驗(yàn)組膠質(zhì)瘤組織中NEDD8表達(dá)水平與 PD-L1 表達(dá)水平呈正相關(guān)，如表4所示。

表4 試驗(yàn)組膠質(zhì)瘤組織中NEDD8和PD-L1 表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)性分析

3 討論

膠質(zhì)瘤是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞惡性腫瘤，具有高組織學(xué)異質(zhì)性和組織侵襲性等特征，膠質(zhì)瘤多數(shù)發(fā)展為彌漫性腫瘤，廣泛浸潤(rùn)腦實(shí)質(zhì)，嚴(yán)重影響患者腦功能，最終危及患者生命[7]。目前膠質(zhì)瘤的治療選擇有限，對(duì)新診斷的膠質(zhì)瘤常行最大安全范圍的手術(shù)切除，輔以放療、化療。由于膠質(zhì)瘤浸潤(rùn)能力強(qiáng)，常無(wú)法完全清除，致使腫瘤極易復(fù)發(fā)，患者最終預(yù)后較差，尤以膠質(zhì)母細(xì)胞瘤預(yù)后最差，中位生存時(shí)間為12-15個(gè)月，5年生存率僅為5%[8]。NEDD8和PD-L1可能作為重要因素協(xié)同參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展。

類泛素蛋白（Ubiquitin-like proteins，UBLs）是機(jī)體內(nèi)一類有重要功能的蛋白質(zhì)，具有與泛素類似的序列和空間結(jié)構(gòu)。泛素及類泛素蛋白參與的翻譯后修飾過(guò)程，幾乎貫穿于細(xì)胞內(nèi)的所有調(diào)控途徑[9]。神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)下調(diào)因子 8(NEDD8)是由81個(gè)氨基酸編碼的類泛素蛋白，是目前研究發(fā)現(xiàn)的與泛素最近似的蛋白[10]。正常細(xì)胞生理過(guò)程中，NEDD8的主要功能是保持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、增強(qiáng)或者減弱其特異性底物蛋白的活性和參與轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)等[11]。研究表明，NEDD8的底物中包含多種腫瘤相關(guān)蛋白、抑癌因子、調(diào)控基因表達(dá)過(guò)程的轉(zhuǎn)錄因子，如p53、鼠雙微體基因（murine double mimute2，MDM2）、希佩爾林道基因（Von Hippel-l indau，VHL）和 Cullin 家 族（Cul-lin-Ring E3 ligases，CRLs）等，NEDD8過(guò)表達(dá)會(huì)造成肝癌、乳腺癌、肺癌等的發(fā)生、發(fā)展[12]。

近幾年，關(guān)于腫瘤細(xì)胞如何引起免疫逃逸的相關(guān)機(jī)制研究，取得了很多突破性的進(jìn)展，其中PD-1/PD-L1途徑是眾多成果中研究相對(duì)較深的機(jī)制之一[13]。PD-L1由機(jī)體CD274基因編碼，是程序性死亡分子1(programmed death-1 PD1)的配體。生理情況下PD-L1 與 PD-1 結(jié)合后，PD-1向機(jī)體免疫系統(tǒng)遞送抑制性信號(hào)，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的功能，防治自身淋巴細(xì)胞攻擊自身抗原，避免自身免疫性疾病的發(fā)生[14]。腫瘤細(xì)胞高表達(dá)PD-L1，通過(guò)激活此通路，抑制T淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞( regulatory T cell，Treg)的生成，進(jìn)而達(dá)到抑制機(jī)體免疫系統(tǒng)的目的[15～16]。目前Treg細(xì)胞在腫瘤組織中所起的作用很受關(guān)注，有研究報(bào)道Treg細(xì)胞可以導(dǎo)致免疫抑制、免疫無(wú)功能，進(jìn)而促進(jìn)多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[17]。

本研究表明，NEDD8和PD-L1在試驗(yàn)組膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，隨著膠質(zhì)瘤病理級(jí)別升高、腫瘤直徑的增大表達(dá)上調(diào)更明顯，且試驗(yàn)組膠質(zhì)瘤組織NEDD8表達(dá)水平與 PD-L1 表達(dá)水平呈正相關(guān)。由此我們猜測(cè)NEDD8和PD-L1高表達(dá)協(xié)同促進(jìn)膠質(zhì)瘤的惡變以及向周圍侵襲性生長(zhǎng)，NEDD8和PD-L1可能作為重要的因素參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展，二者有可能成為衡量膠質(zhì)瘤惡性程度的蛋白標(biāo)志物。大量研究報(bào)道揭示，NEDD8活化酶E1 有希望成為抗腫瘤藥物的新靶點(diǎn)，其中MLN4924作為 NEDD8 修飾的特異性抑制劑，已在臨床上證實(shí)可以抑制結(jié)腸癌、肺癌、多發(fā)性骨髓癌等多種腫瘤細(xì)胞的惡性生長(zhǎng)[18]。同樣以PD-L1為靶點(diǎn)的靶向藥物，已在臨床上開(kāi)始應(yīng)用，且已經(jīng)證實(shí)對(duì)腎癌、宮頸癌、非小細(xì)胞癌患者有效[19]。目前我們研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)證實(shí)[20]，動(dòng)物及體外實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)減少NEDD8和PD-L1的表達(dá)，能有效的抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖，協(xié)同使用NEDD8和PD-L1抑制劑，膠質(zhì)瘤受抑制效果更加顯著。臨床上能否通過(guò)抑制NEDD8和PD-L1高表達(dá)，使膠質(zhì)瘤患者預(yù)后得到良好改善，需要進(jìn)一步的探索。

綜上所述，此次研究主要探討了NEDD8和PD-L1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況及與相關(guān)臨床因素的關(guān)系，未涉及NEDD8和PD-L1影響膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制，后續(xù)會(huì)做進(jìn)一步探索加以闡明。下一步將首先從NEDD8和PD-L1對(duì)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響著手開(kāi)始新的研究，更深層次的發(fā)掘NEDD8和PD-L1的臨床應(yīng)用價(jià)值。