劉天紅, 王穎*, 孫元芹, 李紅艷, 李曉,李陽, 姜曉東, 紀蕾

(1.山東省海洋生物研究院, 山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室, 青島市淺海底棲漁業(yè)增殖重點實驗室,山東 青島 266100; 2.中國海洋大學海洋生命學院, 山東 青島 266003)

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用沙蠶為野生非生殖態(tài)雙齒圍沙蠶(非異沙蠶體)，于2017年9月采自山東省東營河口，體質量為300～400尾·kg-1，采集后清洗，吸凈表面水分凍存。

堿性蛋白酶(20萬U·g-1)、中性蛋白酶(20萬U·g-1)、胃蛋白酶(30萬U·g-1)、木瓜蛋白酶(80萬U·g-1)購自南寧龐博生物工程有限公司；風味蛋白酶(30萬U·g-1)購自吉寶中新國際貿易有限公司；胰蛋白酶(28萬U·g-1)購自北京索萊寶科技有限公司；桿菌肽(Mw=1 422.69 Da Dr. Ehrenstorfer)，德國LGC GmbH研究所生產；乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(Mw=189.1 Da)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(Mw=451.2 Da)、抑菌肽(Mw=6 511 Da)、細胞色素C(Mw=12 355 Da)，均為德國Biosun公司生產。其他所用試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀(LC-20A，日本島津公司，帶GPC軟件)、紫外-可見分光光度計(UV2450，日本島津公司)、真空冷凍干燥機(北京博醫(yī)康醫(yī)學設備有限公司)、高速冷凍離心機(CR21N，日本日立公司)、自動電位滴定儀(ET18，梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司)、水浴恒溫振蕩器(上海雙捷實驗設備有限公司)。

1.3 研究方法

1.3.1沙蠶酶解 采用沙蠶∶蒸餾水為1∶3(質量比)制備沙蠶漿，6種蛋白酶作為實驗組，酶添加量600 U·g-1。以不添加蛋白酶的實驗組作為空白對照，其中，原液40 ℃為CKⅠ、原液50 ℃為CKⅡ。按表1中酶解條件，每組設3個平行，分別酶解1、2、3和4 h，沸水浴滅活5 min，8 000 r·min-1離心15 min，上清液過0.45 μm水相濾膜，凍干。

1.3.2水解度測定 酶解液氨基態(tài)氮的測定參照GB 5009.235-2016食品安全國家標準 食品中氨基酸態(tài)氮的測定[12]，沙蠶勻漿總氮含量參照GB 5009.5-2016食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定[13]。吸取5.0 mL酶解液置于200 mL燒杯中，加60 mL 水，用氫氧化鈉標準溶液[c(NaOH)=0.050 mol·L-1]滴定至pH為8.2，記錄消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積數(shù)，計算總酸含量。加入10.0 mL甲醛溶液，混勻。再用氫氧化鈉標準滴定溶液繼續(xù)滴定至pH為9.2，記錄消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積數(shù)。同時取80 mL 水，按上述步驟做試劑空白試驗。水解度(degree of hydrolysis，DH)計算公式如下。

表1 不同處理的酶解條件Table 1 Enzymolysis condition in different treatments

1.3.3酶解液中肽分子量分布 參照GB/T 22729-2008海洋魚低聚肽粉[14]中高效凝膠過濾色譜法執(zhí)行，修正后的色譜條件為色譜柱：東曹(TOSOH) TSKgel G2000SWXL(7.8 mm×300 mm)；流動相：30%乙腈-水+0.1%三氟乙酸(CV)，超聲脫氣5 min，紫外檢測器(220 nm)，流速梯度升至0.5 mL·min-1，進樣量10 μL，室溫，檢測時間35 min。利用GPC軟件，以標準品分子-出峰時間作三次方程擬合，計算各酶解液中肽分子量分布。

1.3.4DPPH清除率的測定 參照Li等[15]的方法，取0.2 mmol·L-1DPPH甲醇溶液2 mL，甲醇定容至3 mL，測量517 nm處吸光值作為A0；取DPPH甲醇溶液2 mL，加入100 μL不同濃度酶解液(以Vc溶液為陽性對照)，甲醇定量至3 mL，充分混勻，置于暗處反應30 min后，測量517 nm處吸光值作為A，甲醇調儀器零點。反應后體系若有少量沉淀會影響吸光值測定，可以過0.45 μm濾膜去除。DPPH清除率計算公式如下。

△A0=A1-A2

取100 μL不同濃度酶解液(以Vc溶液為陽性對照)，加入2 950 μL Tris-HCl緩沖液，再加50 μL聯(lián)苯三酚溶液，迅速混合，測量325 nm吸光值。30 s時讀數(shù)為A樣1，每隔30 s測量一次，至讀數(shù)接近穩(wěn)定時為A樣2，計算公式如下。

△A樣=A樣1-A樣2

1.3.6·OH清除率的測定 采用水楊酸法[17]測定·OH清除率，取1 mL 1.8 mmol·L-1FeSO4溶液(取0.05 g FeSO4·7H2O溶于雙蒸水，溶解后加入少量H2SO4與還原鐵粉，定容至100 mL)、1 mL 9 mmol·L-1乙醇-水楊酸溶液、250 μL雙蒸水和1 mL 8.8 mmol·L-1H2O2混合作為A0；取1 mL FeSO4溶液、1 mL乙醇-水楊酸溶液與100 μL不同濃度的樣品溶液混合，用雙蒸水定量到2 250 μL，最后加入1 mL H2O2混合均勻作為Ax；取1 mL FeSO4溶液、1 mL乙醇-水楊酸溶液與100 μL不同濃度酶解液(以Vc溶液為陽性對照)混合，用雙蒸水定量到3 250 μL，混合均勻作為Ax0，均置于37 ℃水浴10 min，于505 nm下測定吸光值。全部溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。·OH清除率計算公式如下。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007整理數(shù)據(jù)，采用SPSS 18.0進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同蛋白酶對水解度的影響

由圖1可知，中性蛋白酶組水解度隨酶解時間的延長而增長。其他5種蛋白酶酶解2 h時的水解度均比1 h時低，組內差異極顯著(P<0.01)，隨著酶解時間的延長，水解度又呈明顯上升趨勢，這可能是酶解過程中氨基態(tài)氮不穩(wěn)定所致。對照組水解度明顯低于添加蛋白酶組(P<0.01)，且水解度基本不隨時間延長而增長。酶解4 h以后，堿性蛋白酶和風味蛋白酶的水解度最高，達到53.34%；其次是木瓜蛋白酶和胃蛋白酶，分別達到50.13%和49.69%；CKⅠ水解度最低，僅15.62%。堿性蛋白酶是一種內切酶，主要裂解疏水性氨基酸，增加酶解液中疏水性氨基酸為終端的多肽；風味蛋白酶是一種內切和外切的混合型酶，可在多肽鏈兩端或內部破壞肽鍵[18]，形成更多的肽段。

注：同一蛋白酶不同酶解時間下不同希臘文字母表示差異在P<0.01水平具有統(tǒng)計學意義，同一酶解時間不同蛋白酶間不同英文字母表示差異在P<0.01水平具有統(tǒng)計學意義。Note: Different Greek letters of the same protease in different enzymolysis time indicate significant difference at P<0.01 level, different English letters of different proteases in the same enzymolysis time indicate significant difference at P<0.01 level.圖1 不同蛋白酶對沙蠶蛋白水解度的影響Fig.1 Effect of different proteases on protein DH of clam worm

2.2 沙蠶酶解物分子量的分布

利用GPC軟件擬合肽標準品出峰時間-分子量標準曲線，其三次方擬合標準方程為:f(x)=2.656 273 e-3x3-0.147 813 1x2+2.445 461x-8.571 43，R2=0.998 9，相關性良好。由該標準曲線計算各酶解產物分子量分布(表2)。由表2可以看出，未酶解的沙蠶原液分子量在6 511～12 355 Da有明顯分布，且與蛋白酶組差異極顯著(P<0.01)，經過各蛋白酶酶解后，這一分子段的蛋白含量幾乎為零(除風味蛋白酶組外)，說明不同蛋白酶解鏈降解了這一分子段的蛋白。各酶解產物中含有大量小分子肽(189～6 511 Da，含多肽和寡肽)或氨基酸(<189 Da)，其中胰蛋白酶的酶解產物小分子肽含量最高，達70.47%，比小分子肽含量最低的風味蛋白酶酶解產物(54.77%)高15.7%。這一結果與小麥蛋白酶解情況正好相反[19]，可能是植物蛋白與動物蛋白的結構不同所致。胃蛋白酶酶解產物中小分子肽含量次之，為68.12%。

表2 不同蛋白酶酶解產物分子量分布Table 2 Molecular weight distribution of enzymatic hydrolysis products by different proteases %

2.3 Vc抗氧化效果

表3 不同濃度Vc的抗氧化效果Table 3 Antioxidant activities of Vc with different concentration %

2.4 不同蛋白酶對沙蠶酶解液抗氧化效果的影響

2.4.1不同蛋白酶的DPPH清除效果 圖2表明，不同酶解條件下，各蛋白酶組和對照組的酶解液濃度與DPPH清除率均呈正相關關系，但同一種蛋白酶在不同酶解時間下對DPPH清除率隨酶解液濃度變化又有所不同。胃蛋白酶不同酶解時間下隨濃度增加，對DPPH清除率變化趨勢基本一致；同一濃度下，不同酶解時間對DPPH清除率相差不大，基本是酶解3 h后DPPH清除率最高。胰蛋白酶酶解1 h時DPPH清除率普遍高于4 h，與胃蛋白酶相反。風味蛋白酶酶解3 h和4 h時的DPPH清除率明顯高于酶解1 h，且隨濃度的增加而升高，酶解3 h和4 h時DPPH清除率的增長速率明顯高于酶解1 h和2 h。木瓜蛋白酶酶解3 h以后，明顯比酶解時間短的酶解液對DPPH的清除率高，且當濃度增加到3 mg·mL-1以上時，酶解4 h對DPPH清除率達到60%以上。中性蛋白酶酶解2 h對DPPH清除率反而低于酶解1 h，可能是部分蛋白不穩(wěn)定造成的，但酶解4 h時DPPH清除率最高。堿性蛋白酶與其他蛋白酶不同，不同酶解時間下隨酶解液濃度增加，DPPH清除率的增長斜率不同，酶解4 h對DPPH清除率隨著濃度的增加，清除率增加斜率最大。兩對照組在不同酶解時間下對DPPH清除率均隨濃度的增加而升高，但酶解時間增加到4 h，對DPPH清除能力反而要小，這說明在40 ℃下，部分活性蛋白不穩(wěn)定。

圖2 不同蛋白酶對DPPH清除率的影響Fig.2 Effect of different proteases on DPPH scavenging rate

圖3結果表明，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶對DPPH的清除率最高，濃度為2 mg·mL-1時就可清除90%DPPH，與0.3 mg·mL-1Vc的清除效果接近，比對照組清除率高約30%。Rajapakse等[20]研究認為，水解產物清除DPPH自由基活性與疏水性氨基酸或肽呈正相關關系。木瓜蛋白酶是特異性內切酶，作用位點廣泛，可從蛋白質內部切開肽鏈而生成小分子質量的生物活性多肽；胃蛋白酶具有廣泛特異性作用位點，主要作用于Phe、Trp、Tyr等疏水性氨基酸，這兩種酶均可增加酶解液中疏水性氨基酸含量。胰蛋白酶、風味蛋白酶和中性蛋白酶對DPPH的清除率均比對照組高，但堿性蛋白酶卻比對照組低，這說明堿性蛋白酶酶解沙蠶比沙蠶原液本身對DPPH的清除能力要低，可能與其酶解產物中小分子肽被過度水解、喪失了部分功能鍵有關。

圖3 不同蛋白酶在最佳酶解時間下對DPPH的清除率Fig.3 DPPH scavenging rate of different proteases under optimal enzymatic hydrolysis time

圖4 不同蛋白酶對清除率的影響Fig.4 Effect of different proteases on scavenging rate

圖5 不同蛋白酶在最佳酶解時間下對的清除率 scavenging rate of different proteases under optimal enzymatic hydrolysis time

2.4.3不同蛋白酶的·OH清除率 如圖6所示，各處理組對·OH清除率與酶解液濃度呈正相關關系。胃蛋白酶在不同酶解時間下的酶解液隨濃度增加，對·OH清除率的增加斜率不同，酶解2 h時對·OH清除率最高。胰蛋白酶與胃蛋白酶相似，酶解2 h時對·OH清除率普遍高于酶解4 h。風味蛋白酶與其他蛋白酶組有所不同，酶解1～2 h對·OH清除率比酶解4 h高，可能是由于部分活性蛋白不穩(wěn)定造成的，酶解3 h對·OH的清除率最高。木瓜蛋白酶1～3 h的酶解產物隨濃度增加，對·OH清除率的增長趨勢一致，而酶解4 h對·OH清除率增加斜率最大。中性蛋白酶在酶解4 h時對·OH的清除率明顯高于3 h。堿性蛋白酶酶解4 h以后，對·OH的清除率明顯高于時間短的酶解組，且隨酶解液濃度增加到2 mg·mL-1以上，對·OH清除率達到70%以上。對照組對·OH清除率也隨著濃度的增加而升高，隨著水浴時間增加到3 h，對·OH清除能力最高，但酶解時間再延長，清除能力反而下降，這說明在40 ℃下活性蛋白不穩(wěn)定。

圖6 不同蛋白酶對·OH清除率的影響Fig.6 Effect of different proteases on·OH scavenging rate

圖7結果表明，木瓜蛋白酶組在濃度高于2 mg·mL-1時，對·OH清除率最高，與0.5 mg·mL-1Vc的清除效果接近，比空白對照組清除率高約40%。隨著酶解液濃度的升高，5 mg·mL-1時胃蛋白酶組的清除效果最優(yōu)，與木瓜蛋白酶差別不大。胰蛋白酶、風味蛋白酶對·OH的清除率高于對照組，但中性蛋白酶和木瓜蛋白酶清除效果與對照組相近。堿性蛋白酶和胃蛋白酶的酶切位點均為疏水性氨基酸，其酶解產物清除·OH效果較好。

圖7 不同蛋白酶在最佳酶解時間下對·OH的清除率Fig.7 ·OH scavenging rate of different proteases under optimal enzymatic hydrolysis time

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