楊海峰, 李艷艷, 陳曉蘭, 姚詩贇, 黃亞奇,夏良友, 李宇琛, 卜仕金*

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院, 江蘇 泰州 225300; 2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州 225009)

隨著社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展和科技進(jìn)步，養(yǎng)豬業(yè)趨向規(guī)?；?、集約化、標(biāo)準(zhǔn)化、機(jī)械化和自動化方向發(fā)展，這就要求對繁殖豬群實(shí)行整批管理，使整批母豬同步發(fā)情、排卵、配種及產(chǎn)仔，因此,發(fā)情控制技術(shù)的研究與應(yīng)用顯得十分重要。同期發(fā)情是利用激素制劑調(diào)整母豬的發(fā)情周期，使其在預(yù)定時間內(nèi)集中發(fā)情的一種技術(shù)，該技術(shù)對規(guī)?；i場批次化生產(chǎn)管理具有重要意義[1-2]。同期發(fā)情的母豬分娩時間相對集中，便于集中斷奶、全進(jìn)全出、同步進(jìn)入下一個繁殖周期，從而有效提高生豬生產(chǎn)效率，降低疫病感染風(fēng)險(xiǎn)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來較高經(jīng)濟(jì)效益。

烯丙孕素(altrenogest)是一種人工合成的口服型促孕激素[3]，通過抑制促性腺激素分泌而調(diào)整母畜發(fā)情周期[4]，最早于1984年在法國獲得上市許可，在歐盟和美國被批準(zhǔn)用于犬(母犬黃體不足[5])、馬(母馬同期發(fā)情[6]、孕酮水平不足的母馬妊娠維持[7]、長期使用抑制賽馬發(fā)情以保持其競技狀態(tài)[8-9])和豬(母豬同期發(fā)情[10-11])。烯丙孕素作用于下丘腦和垂體的孕酮受體，通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，抑制促性腺激素卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)和黃體生成素(luteinizing hormone, LH)的分泌，使卵泡發(fā)育受阻，動物在給藥期間自然發(fā)情停止；連續(xù)給藥一定時期后停止藥物處理，F(xiàn)SH和LH恢復(fù)正常水平，卵泡迅速生長和成熟，之后，動物同步開始發(fā)情周期[12-13]。目前，歐美發(fā)達(dá)國家已將烯丙孕素作為養(yǎng)豬生產(chǎn)中必不可少的同期發(fā)情調(diào)控劑，且無更好的替代產(chǎn)品[14]。

我國于“十三五”期間啟動了烯丙孕素原料及其制劑研發(fā)，國內(nèi)多家獸藥企業(yè)聯(lián)合農(nóng)業(yè)院校參與實(shí)施，寧波三生生物科技有限公司、寧波第二激素廠、天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司先后于2018年2月、4月和12月獲批烯丙孕素內(nèi)服溶液國家二類新獸藥證書。烯丙孕素內(nèi)服溶液給單劑量內(nèi)服后，在母豬體內(nèi)具有吸收迅速、消除較慢、有效血藥濃度維持較長的藥物代謝動力學(xué)特征[15]；母豬連續(xù)內(nèi)服給藥18 d，停藥后豬組織中藥物殘留規(guī)律為肝>腎>脂肪>肌肉，建議休藥期為9 d[16]。安全、有效、質(zhì)量可控是藥品的三大核心要素，本研究根據(jù)我國獸藥評審中心《獸藥臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》[17]，評價了烯丙孕素內(nèi)服溶液的臨床藥效和靶動物安全性，為其新獸藥注冊申報(bào)和臨床合理應(yīng)用提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1藥品 受試藥物：國產(chǎn)烯丙孕素內(nèi)服溶液，含量4 mg·mL-1，規(guī)格450 mL·瓶-1，批號1506003，天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司產(chǎn)品。對照藥物：進(jìn)口烯丙孕素內(nèi)服溶液，商品名Altresyn，含量4 mg·mL-1，規(guī)格1 080 mL·瓶-1，批號150A1，法國詩華動物保健有限公司產(chǎn)品。

1.1.2儀器與耗材 AU5800型全自動血液生化分析儀，美國貝克曼庫爾特公司；XN-20型全自動模塊式血液體液分析儀，日本希森美康株式會社；RM2235型石蠟切片機(jī)，德國徠卡公司；Axio Scope A1型正置顯微鏡，配備AxioVision Rel. 4.8顯微圖像分析系統(tǒng)，德國卡爾蔡司顯微成像有限公司；2 mL抗凝真空采血管、5 mL促凝真空采血管，成都瑞琦科技實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司；血液生理生化檢測試劑均為原廠配套試劑。

1.1.3試驗(yàn)動物 臨床藥效試驗(yàn)選用性成熟且至少經(jīng)歷過一次發(fā)情周期的長大二元后備母豬，由江蘇鹽城市大豐區(qū)中北畜牧場、上海崇明縣益民畜禽養(yǎng)殖場和新海農(nóng)場愛茵康畜禽養(yǎng)殖場提供；靶動物安全性試驗(yàn)選用性成熟的蘇姜后備母豬，由江蘇泰興市蘇姜種豬有限公司提供。

1.2 烯丙孕素內(nèi)服溶液調(diào)控母豬同期發(fā)情的臨床藥效試驗(yàn)

1.2.1試驗(yàn)動物選擇與淘汰 在具有一定養(yǎng)殖規(guī)模的種豬場中選擇供繁殖用的后備母豬作為試驗(yàn)對象，必需滿足以下條件：①8月齡左右的性成熟后備母豬，且給藥前至少經(jīng)歷過一次發(fā)情周期；②臨床健康，生長發(fā)育良好，體重110 kg以上，未發(fā)現(xiàn)可對健康造成影響的疾?。虎弁馍称鳠o明顯異物，也未見有病理性的紅腫或液體流出[18]。試驗(yàn)過程中，入選動物如發(fā)生以下幾種情況需要淘汰：①患有對身體有一定影響的疾??；②計(jì)劃在人工授精當(dāng)周發(fā)病的動物；③飼養(yǎng)記錄不全的動物。

1.2.2試驗(yàn)動物飼養(yǎng)管理 受試母豬在定位欄內(nèi)飼養(yǎng)，每個定位欄飼養(yǎng)一頭。在試驗(yàn)期間所有入選的受試動物將依據(jù)所在種豬場現(xiàn)有條件和飼養(yǎng)規(guī)程進(jìn)行飼養(yǎng)管理，每天定時飼喂2次，自由飲水。

1.2.3動物來源、分組與給藥 臨床藥效試驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)性臨床試驗(yàn)(Ⅱ期臨床試驗(yàn))和擴(kuò)大臨床試驗(yàn)(Ⅲ期臨床試驗(yàn))兩個階段，均為非盲法評價。實(shí)驗(yàn)性臨床試驗(yàn)在江蘇鹽城市大豐區(qū)中北畜牧場種豬場進(jìn)行，將滿足入選標(biāo)準(zhǔn)的受試動物隨機(jī)分為4組，分別為烯丙孕素內(nèi)服溶液高劑量組(25 mg·d-1)、中劑量組(20 mg·d-1)、低劑量組(10 mg·d-1)和空白對照組(自來水5 mL)。擴(kuò)大臨床試驗(yàn)在江蘇鹽城市大豐區(qū)中北畜牧場、上海崇明縣益民畜禽養(yǎng)殖場和新海農(nóng)場愛茵康畜禽養(yǎng)殖場進(jìn)行，將滿足入選標(biāo)準(zhǔn)的受試動物隨機(jī)分為受試藥物組、推薦劑量組(國產(chǎn)烯丙孕素內(nèi)服溶液)和藥物對照組組(進(jìn)口烯丙孕素內(nèi)服溶液)，給藥劑量均為20 mg·d-1。給藥前預(yù)先將達(dá)到性成熟的后備母豬移入定位欄內(nèi)飼養(yǎng)，給藥時將烯丙孕素內(nèi)服溶液(或自來水)灑在飼料表層，讓動物經(jīng)口攝入，每頭動物每天上午定時給藥一次，連續(xù)給藥18 d。

1.2.4發(fā)情鑒定和人工授精 各受試動物在停藥后第2 d起，每天觀察母豬發(fā)情跡象，上午和下午用公豬進(jìn)行誘情，根據(jù)母豬陰門檢查和“靜立反應(yīng)”進(jìn)行發(fā)情鑒定，發(fā)情母豬8～12 h內(nèi)進(jìn)行第一次輸精，間隔8～12 h后進(jìn)行第二次輸精[19-20]。人工授精后每天觀察母豬的生理變化情況確定是否懷孕。

1.2.5臨床藥效評價 烯丙孕素內(nèi)服溶液調(diào)控母豬同期發(fā)情臨床藥效的主要評價指標(biāo)為受試母豬從停藥后到出現(xiàn)發(fā)情反應(yīng)的間隔時間、發(fā)情率、發(fā)情集中度、妊娠率等[21]。

1.3 烯丙孕素內(nèi)服溶液的靶動物安全性試驗(yàn)

1.3.1試驗(yàn)動物選擇與飼養(yǎng)管理 靶動物安全性試驗(yàn)的動物選擇與飼養(yǎng)管理參照臨床藥效試驗(yàn)執(zhí)行。

1.3.2動物來源、試驗(yàn)分組、給藥 靶動物安全性試驗(yàn)在江蘇泰興市蘇姜種豬有限公司進(jìn)行，24頭達(dá)到性成熟的蘇姜后備母豬隨機(jī)分為4組，每組6頭，分別為國產(chǎn)烯丙孕素內(nèi)服溶液1倍推薦劑量組(20 mg·d-1)、3倍推薦劑量組(60 mg·d-1)和5倍推薦劑量組(100 mg·d-1)和空白對照組(自來水5 mL)。給藥方法同臨床藥效試驗(yàn)，連續(xù)給藥18 d。

1.3.3臨床觀察 每天觀察并記錄試驗(yàn)動物精神狀況、采食量、呼吸、活動、排泄、可視黏膜等臨床癥狀，給藥前、第9和18 d(給藥結(jié)束當(dāng)天)各組動物分別稱重和測量體溫。

1.3.4血常規(guī)指標(biāo)與血清生化指標(biāo)測定 在給藥前、給藥第9和第18 d(每次給藥結(jié)束后4 h內(nèi))分別經(jīng)母豬的前腔靜脈采集血液。取2 mL血液置于抗凝真空采血管中，采用全自動模塊式血液體液分析儀測定紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(red blood cell，RBC)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(white blood cell，WBC)、血紅蛋白(hemoglobin，HGB)、紅細(xì)胞壓積(hematocrit，HCT)、平均血紅蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin， MCH)、平均血紅蛋白濃度(mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC)、血小板(platelet，PLT)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(neutrophils，NEUT)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(lymphocyte，LYMPH)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)(monocyte，MONO)、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(eosinophils，EO)、嗜堿性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(basophils，BASO)等血常規(guī)指標(biāo)。取4 mL血液置于促凝真空采血管中，采用全自動血液生化分析儀測定直接膽紅素( direct bilirubin，DBIL)、總蛋白(total bilirubin，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、球蛋白(globulin，GLO)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶酶(aspartate aminotransferase，AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、尿素(urea，UREA)、肌酐(creatinine，CRE)、葡萄糖(glucose，GLU)、鉀(K+)、鈉(Na+)、氯(Cl-)、鈣(Ca2+)等血清生化指標(biāo)。血液生理生化指標(biāo)檢測在泰州市第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科完成。

1.3.5尸體剖檢與組織病理學(xué)檢查 試驗(yàn)結(jié)束后(第19 d)撲殺各組所有動物，進(jìn)行尸體剖檢，觀察大體病變；采集胃、小腸、卵巢、肝臟、心臟、脾臟、腎臟等臟器組織，經(jīng)10%福爾馬林溶液固定24 h后，石蠟切片，HE染色，正置顯微鏡進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，在揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院病理組完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Micrsoft Excell對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，應(yīng)用SPSS19.0軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 烯丙孕素內(nèi)服溶液誘導(dǎo)后備母豬同期發(fā)情的臨床藥效

2.1.1實(shí)驗(yàn)性臨床試驗(yàn)結(jié)果分析 實(shí)驗(yàn)性臨床試驗(yàn)結(jié)果見表1。國產(chǎn)烯丙孕素內(nèi)服溶液高、中、低劑量組的母豬從停藥到出現(xiàn)發(fā)情反應(yīng)的間隔時間分別為(3.45±0.81)(3.35±0.66)(5.21±2.65)d，發(fā)情率分別為100%(20/20)、100%(20/20)和95%(19/20)。空白對照組的母豬因自然發(fā)情不受調(diào)控，發(fā)情時間變化較大，因此僅收集考察了10頭母豬的發(fā)情及配種受孕情況，其中3頭母豬在給藥期間發(fā)情(未納入結(jié)果統(tǒng)計(jì))，停藥后有7頭母豬發(fā)情，這7頭母豬平均發(fā)情間隔時間為(11.71±5.39)d。比較烯丙孕素內(nèi)服溶液各劑量組的發(fā)情集中度，低劑量組的母豬有16頭在停藥后一周內(nèi)發(fā)情，3頭在停藥8 d后發(fā)情，1頭母豬一直未發(fā)情；中、高劑量組母豬均集中在停藥一周內(nèi)發(fā)情。因此，將中劑量(20 mg·d-1)作為國產(chǎn)烯丙孕素內(nèi)服溶液調(diào)控母豬同期發(fā)情的推薦劑量進(jìn)行擴(kuò)大臨床試驗(yàn)。

表1 實(shí)驗(yàn)性臨床試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of experimental clinical trials

2.1.2擴(kuò)大臨床試驗(yàn)結(jié)果分析 擴(kuò)大臨床試驗(yàn)結(jié)果見表2。受試藥物組和藥物對照組的母豬在烯丙孕素調(diào)控下均表現(xiàn)出良好的同期發(fā)情效果，發(fā)情間隔時間分別為(3.59±1.07)(3.75±1.22)d，發(fā)情率分別為96.72%(59/61)和98.33%(59/60)，且絕大多數(shù)受試母豬集中在停藥一周內(nèi)發(fā)情，發(fā)情配種后均全部受孕，未有妊娠終止或流產(chǎn)現(xiàn)象。兩組受試母豬的發(fā)情間隔、發(fā)情率、發(fā)情集中度、妊娠率、窩產(chǎn)活仔數(shù)等臨床藥效評價指標(biāo)均無顯著差異(P>0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明，國產(chǎn)烯丙孕素內(nèi)服溶液按推薦劑量(20 mg·d-1)連續(xù)給藥18 d，用于調(diào)控后備母豬同期發(fā)情，與法國詩華公司的進(jìn)口產(chǎn)品具有同等的臨床藥效。

表2 擴(kuò)大臨床試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of expanded clinical trials

2.2 烯丙孕素內(nèi)服溶液的靶動物安全性

2.2.1臨床表現(xiàn) 整個試驗(yàn)期間各組受試動物均無死亡，未見嘔吐反應(yīng)，精神狀態(tài)、體溫、采食、飲水、排泄和活動等均表現(xiàn)正常。試驗(yàn)結(jié)束時，各給藥組動物的體重增長與空白對照組相比無顯著差異(P>0.05)。

2.2.2血常規(guī)指標(biāo)與血清生化指標(biāo)分析 給藥前、試驗(yàn)期間及試驗(yàn)結(jié)束時的血常規(guī)和血清生化指標(biāo)測定結(jié)果分別見表3和表4。與空白對照組相比，給藥至第9 d結(jié)束時，1倍劑量組的淋巴細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)(LYMF)、5倍劑量組的血紅蛋白(HGB)及3倍劑量組的白蛋白(ALB)差異顯著(P<0.05)，至最后一次給藥結(jié)束后，5倍劑量組的紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、紅細(xì)胞壓積(HCT)和1倍及3倍劑量組的白蛋白(ALB)與空白對照組差異亦顯著(P<0.05)，以上少數(shù)血液生理生化指標(biāo)的變化與給藥劑量沒有明顯的相關(guān)性，且均在母豬正常范圍值內(nèi)波動。結(jié)果表明，國產(chǎn)烯丙孕素內(nèi)服溶液在5倍推薦劑量下對豬的血常規(guī)指標(biāo)和血清生化指標(biāo)無明顯的異常影響。

表3 烯丙孕素內(nèi)服溶液對母豬血常規(guī)指標(biāo)的影響Table 3 Effects of altrenogest oral solution on blood routine index in mature sows

表4 烯丙孕素內(nèi)服溶液對母豬血清生化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of altrenogest oral solution on serum biochemical index in mature sows

2.2.3組織病理學(xué)變化 試驗(yàn)結(jié)束后將各組受試動物宰殺剖檢，逐一進(jìn)行大體病理學(xué)檢查，均未發(fā)現(xiàn)任何肉眼可見的異?；蚩梢刹∽?。進(jìn)一步對5倍劑量組和空白對照組的豬只進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，胃、小腸、卵巢、肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腎臟等主要器官的組織切片如圖1所示，未發(fā)現(xiàn)明顯組織病理學(xué)變化。

圖1 組織病理學(xué)變化(200×)Fig.1 Histopathological changes (200×)

3 討論

烯丙孕素通過抑制促性腺激素FSH和LH的釋放來抑制母豬發(fā)情，停藥后激素重新釋放，母豬重返發(fā)情并同期發(fā)情，以便于規(guī)模豬場實(shí)施批次化生產(chǎn)管理。與其他促進(jìn)母豬同期發(fā)情的注射藥物相比，烯丙孕素內(nèi)服給藥對母豬的刺激性小，因而在國外已廣泛用于母豬同期發(fā)情。國產(chǎn)烯丙孕素內(nèi)服溶液的給藥途徑、給藥劑量、給藥周期是參照歐洲進(jìn)口產(chǎn)品的給藥方案以及臨床藥效預(yù)實(shí)驗(yàn)制定。歐洲藥品管理局(European Medicines Agency，EMA)和美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration, FDA)批準(zhǔn)烯丙孕素的給藥途徑為口服，母豬經(jīng)口喂服操作不便，本研究采用將藥液灑在飼料表面的方式給藥，受試母豬在各自的定位欄中飼養(yǎng)，飼料槽是分開的，且每次給藥后飼料很快被吃光，這樣確保了烯丙孕素全部被內(nèi)服，進(jìn)而被母豬吸收利用。持續(xù)給藥時間為18 d，主要與母豬的發(fā)情周期為18～23 d有關(guān)。

多名研究人員先后報(bào)道，烯丙孕素以20 mg·d-1的劑量給后備母豬飼喂，連用15～18 d，停藥數(shù)日內(nèi)母豬可集中發(fā)情，發(fā)情率85%～100%，并且對母豬卵泡發(fā)育、排卵時間和繁殖性能無不良作用[22-26]。Stevenson等[27]對烯丙孕素最佳給藥持續(xù)時間進(jìn)行了研究，觀察14和18 d的持續(xù)給藥對同期發(fā)情效果的影響，結(jié)果表明，持續(xù)給藥18 d后備母豬表現(xiàn)出更為精確的同情發(fā)情，停藥6 d內(nèi)的發(fā)情率也更高(給藥14 d為89%，給藥18 d為96%)。本研究通過試驗(yàn)性及擴(kuò)大臨床試驗(yàn)評價了國產(chǎn)烯丙孕素調(diào)控后備母豬同期發(fā)情的臨床效果，結(jié)果與國外相關(guān)報(bào)道相一致。在實(shí)驗(yàn)性臨床試驗(yàn)中，國產(chǎn)烯丙孕素內(nèi)服溶液高、中、低劑量組的母豬與空白對照組母豬自然發(fā)情相比，發(fā)情間隔時間顯著縮短(P<0.05)，且中、高劑量組母豬的發(fā)情時間較低劑量組則更為集中，均在停藥一周內(nèi)發(fā)情，從而將中劑量(20 mg·d-1)作為臨床推薦劑量。擴(kuò)大臨床試驗(yàn)中，國產(chǎn)烯丙孕素內(nèi)服溶液組和進(jìn)口藥物對照組的母豬在藥物調(diào)控下表現(xiàn)出良好的同期發(fā)情效果，停藥后至出現(xiàn)發(fā)情反應(yīng)的間隔時間、發(fā)情率、發(fā)情集中度、妊娠率、窩產(chǎn)仔數(shù)等均無顯著差異(P>0.05)，說明國產(chǎn)烯丙孕素內(nèi)服溶液調(diào)控母豬同期發(fā)情的臨床效果與法國進(jìn)口產(chǎn)品相當(dāng)。

靶動物安全性試驗(yàn)是新獸藥臨床研究的重要內(nèi)容，臨床體征是從整體上反映藥物對靶動物的影響；血細(xì)胞的數(shù)量及形態(tài)變化是判斷該藥物對血液系統(tǒng)有無毒性的重要依據(jù)；血液生化指標(biāo)反映動物機(jī)體總體代謝、營養(yǎng)和健康狀態(tài)，對確定藥物臨床潛在的毒性病理學(xué)靶器官具有重要的參考價值[28]。本研究通過比較給藥前后的臨床體征、血常規(guī)指標(biāo)、血清生化指標(biāo)及組織病理學(xué)變化，評價了烯丙孕素內(nèi)服溶液對靶動物后備母豬的安全性。后備母豬分別按1倍、3倍、5倍推薦劑量給予國產(chǎn)烯丙孕素內(nèi)服溶液，連續(xù)用藥18 d，試驗(yàn)期間所有動物臨床表現(xiàn)正常，血常規(guī)和血清生化指標(biāo)均在正常參考范圍之內(nèi)，試驗(yàn)結(jié)束后所有動物剖檢均未發(fā)現(xiàn)異常病變，5倍推薦劑量組動物的主要臟器組織鏡檢未發(fā)現(xiàn)明顯病理改變；給藥至第9 d和停藥后24 h，受試藥物各劑量組的少數(shù)血液生理生化指標(biāo)與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)，但與給藥劑量無明顯相關(guān)性，且均在母豬正常范圍值內(nèi)波動。由此可見，國產(chǎn)烯丙孕素內(nèi)服溶液在5倍推薦劑量(100 mg·d-1)范圍內(nèi)連續(xù)給藥18 d，對母豬的血液生理生化功能和主要臟器未造成明顯的不良影響。

綜上所述，國產(chǎn)烯丙孕素內(nèi)服溶液通過噴灑在飼料上內(nèi)服給藥，一次量，母豬20 mg，每日1次，連用18 d，可以調(diào)控母豬達(dá)到良好的同期發(fā)情效果，臨床應(yīng)用安全，可以現(xiàn)代生豬養(yǎng)殖中推廣應(yīng)用，對母豬批次化生產(chǎn)管理具有重要意義。