周紅姿, 周方園, 趙曉燕, 吳翠霞, 張廣志,苑偉偉, 吳曉青, 謝雪迎, 范素素, 張新建*

(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生態(tài)研究所, 山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 濟(jì)南 250103；2.泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 山東 泰安 271000；3.山東蔚藍(lán)生物科技有限公司, 山東 濱州 251700)

小麥赤霉病(wheatFusariumhead blight)是我國(guó)小麥生產(chǎn)上的主要病害，也是世界性的小麥重要真菌病害之一，廣泛發(fā)生于世界濕潤(rùn)和半濕潤(rùn)地區(qū)。在我國(guó)赤霉病主要發(fā)生在長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)、東北春麥區(qū)東部及華南冬麥區(qū)。近年來隨著氣候和耕作制度的變化，該病害流行區(qū)域不斷擴(kuò)大，目前已經(jīng)發(fā)展到黃淮海麥區(qū)。2012年，我國(guó)小麥赤霉病爆發(fā)，受害面積達(dá)到1 000萬hm2，約占全國(guó)小麥總面積的二分之一。麥類赤霉病是由禾谷鐮刀菌復(fù)合種(Fusariumgraminearumspecies complex)引起的，在我國(guó)流行危害的主要是禾谷鐮刀菌(F.graminearum)和亞洲鐮刀菌(Fusariumasiaticum)，其中，黃河流域以北地區(qū)以禾谷鐮刀菌為主，長(zhǎng)江中下游地區(qū)以亞洲鐮刀菌為主[1-3]。赤霉病發(fā)生后，不僅會(huì)造成產(chǎn)量的巨大損失，還會(huì)造成籽粒皺縮，品質(zhì)下降，而且病菌在侵害作物的同時(shí)能產(chǎn)生多種毒素，如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)和玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)，可破壞人和動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，具有致癌、致畸作用，嚴(yán)重威脅人畜的健康安全[4-6]。

小麥赤霉病的防治技術(shù)包括培育抗病品種、加強(qiáng)田間管理、化學(xué)防治和生物防治等[7]。抗病育種是最經(jīng)濟(jì)有效的措施，但尚未發(fā)現(xiàn)非常理想的抗病種質(zhì)資源。而僅靠田間管理難以有效控制病害發(fā)生。目前，小麥赤霉病的防治主要依賴于化學(xué)防治，隨著用藥面積擴(kuò)大，用藥量和用藥頻率增加，病原菌的抗藥性也不斷增強(qiáng)[7-9]。隨著農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的需要和人們環(huán)保意識(shí)的提高，生物防治措施在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用越來越廣泛[10]。對(duì)小麥赤霉病進(jìn)行生物防治研究已有報(bào)道，研究發(fā)現(xiàn)拮抗微生物包括芽胞桿菌、假單胞桿菌、鏈霉菌、變形菌等種類，部分菌株表現(xiàn)出良好的生防效果[11-12]。但這些研究都是以禾谷鐮刀菌為防治對(duì)象，對(duì)于以亞洲鐮刀菌為防治對(duì)象的研究較少。本研究以近年來赤霉病發(fā)生嚴(yán)重的長(zhǎng)江中下游麥區(qū)的重要病原菌——亞洲鐮刀菌為防治對(duì)象，從大田小麥赤霉病病穗上分離到的細(xì)菌菌株中篩選到一株對(duì)該病原菌具有高效拮抗活性的細(xì)菌，通過小麥盆栽試驗(yàn)和田間試驗(yàn)檢測(cè)其菌體和發(fā)酵液對(duì)小麥赤霉病的防治效果，為該病害的生物防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試小麥病原菌為亞洲鐮刀菌(F.asiaticum)菌株P(guān)2，從江蘇省揚(yáng)州市邗江區(qū)郊外麥田赤霉病病穗上分離、鑒定并保存；試驗(yàn)用的175株細(xì)菌菌株分離自全國(guó)各地小麥赤霉病病穗，保存于山東省科學(xué)院生態(tài)研究所生態(tài)修復(fù)創(chuàng)新研究室。

1.2 試劑及儀器

主要試劑：Tryptone(Oxoid)、Yeast extract(Oxoid)、25%氰烯菌酯懸浮劑(江蘇省農(nóng)藥研究所股份有限公司)，引物由上海生工生物有限公司合成。

培養(yǎng)基配方及配置方法如下：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，去離子水定容至1 000 mL，115 ℃滅菌20 min。綠豆湯產(chǎn)孢培養(yǎng)基：綠豆30 g，去離子水定容至1 000 mL，煮沸去渣，121 ℃滅菌20 min。LB：NaCl 10 g，Tryptone 10 g，Yeast extract 5 g，瓊脂15 g，去離子水定容至1 000 mL，pH 7.0。121 ℃滅菌20 min。LB液體培養(yǎng)基：NaCl 10 g，Tryptone 10 g，Yeast extract 5 g，去離子水定容至1 000 mL，pH 7.0。121 ℃滅菌20 min。

儀器設(shè)備： DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏)、HZQ-Q全溫振蕩器(哈東聯(lián))、Q10超純水儀(Millipore)、Universal Hood Ⅲ核酸凝膠成像儀(Bio-Rad)、flexlid PCR儀(Eppendorf)、Centrifuge 5418臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorf)、CR22GⅢ低溫高速離心機(jī)(HITACHI)、XMTD-8222電熱恒溫水浴鍋(上海精宏)、Sub-Cell GT瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)(Bio-Rad)、Mini Vortex渦旋震蕩儀(北京東林昌盛)。

1.3 生防菌株的分離與篩選

1.3.1生防菌株的分離 選取小麥病穗上病健交界處的小穗，放到3%次氯酸鈉溶液中浸泡2 min，取出，用無菌鑷子扒開組織，露出麥粒，一起放到無菌水中渦旋振蕩2 min，靜置5 s，梯度稀釋5次后，取1 mL稀釋液涂布到LB固體培養(yǎng)基平板上，于28 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落進(jìn)行純化，保存。

取保存于-80 ℃超低溫冰箱中的病原菌亞洲鐮刀菌P2菌塊接種到PDA平板上，于28 ℃培養(yǎng)48 h后，轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用直徑2.5 mm的打孔器打成菌片，備用。

1.3.2拮抗菌的初篩 將分離獲得的細(xì)菌分別接種到LB固體培養(yǎng)基平板上，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h觀察1次菌落形態(tài)。將菌株按照菌落形態(tài)差異進(jìn)行分類，從每個(gè)地點(diǎn)采集的菌株中取生長(zhǎng)速度較快的菌株與亞洲鐮刀菌P2菌株進(jìn)行共培養(yǎng)試驗(yàn)。30 ℃培養(yǎng)6 d，觀察P2菌株菌落生長(zhǎng)速度和菌落半徑大小。各設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.3拮抗菌的復(fù)篩 挑取細(xì)菌單菌落，分別接種于PDA平板距中心2.5 cm處的對(duì)稱兩點(diǎn)。PDA平板中央接種P2菌片，每個(gè)培養(yǎng)皿作為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)拮抗菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)，以中心只接種P2菌片的PDA平板為對(duì)照。28 ℃培養(yǎng)5～7 d，當(dāng)對(duì)照病原菌菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿時(shí)，測(cè)定各處理中P2的菌絲直徑，計(jì)算細(xì)菌對(duì)P2菌絲的抑制率。

顯微鏡觀察亞洲鐮刀菌P2與拮抗菌Z54對(duì)峙區(qū)病原菌菌絲的變化情況。

1.4 拮抗菌的鑒定

1.4.1拮抗菌Z54的形態(tài)學(xué)鑒定 挑取活化培養(yǎng)的Z54單菌落，在LB平板上劃線，30 ℃恒溫培養(yǎng)16 h 和96 h，分別觀察單菌落顏色、形狀、大小、邊緣、表面、隆起形狀，透明度和菌體及芽胞的形態(tài)特征。用革蘭氏染色法對(duì)菌體和芽胞進(jìn)行染色觀察。

1.4.2高活性拮抗菌的16S rDNA、gyrB基因序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 將篩選出的11株拮抗活性好的細(xì)菌單菌落分別接種到LB液體培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)16 h 后，用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取DNA，以此DNA為模板進(jìn)行16S rDNA的 PCR擴(kuò)增。通用引物為：1492 R(5’-GGCTCGAGCGGCCGCCCGGGTTACCTTGTTACG-ACTT-3’)和8F(5’-GCGGATCCGCGGCCGCT-GCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)；擴(kuò)增條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52.3 ℃ 45 s，72 ℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min[13]。擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。

根據(jù)16S rDNA序列鑒定為芽胞桿菌的7株細(xì)菌，以基因組DNA為模板進(jìn)行g(shù)yrB基因的PCR擴(kuò)增。引物為：UP-1 (5’-GAAGT-CATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTT-YGA-3’)和UP-2r (5’-AGCAGGGTACGGATGTG-CGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTC-AT-3’)，擴(kuò)增條件為：95 ℃ 4 min；98 ℃ 10 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min[12]。擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工生物公司測(cè)序。

將測(cè)定的16S rDNA和gyrB基因序列，分別與GenBank和EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知16S rDNA和gyrB基因序列進(jìn)行同源性比較，選取屬內(nèi)同源性較高的細(xì)菌的基因序列進(jìn)行遺傳距離計(jì)算，使用MEGA7中的Muscle進(jìn)行比對(duì)，并采用Maximum Likelihood法[14-15]分別繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 Z54防治小麥赤霉病盆栽試驗(yàn)

1.5.1拮抗菌菌懸液的制備 取保存于-80 ℃的拮抗細(xì)菌菌株，在LB平板上劃線，30 ℃培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)液中，30 ℃ 180 r·min-1培養(yǎng)72 h，將發(fā)酵液分成2批，一批用無菌水調(diào)整菌液濃度至1×109CFU·mL-1，用于細(xì)菌發(fā)酵液噴霧；另一批在低溫條件下5 000 r·min-1離心10 min，獲得菌體，用無菌水將菌體重懸，調(diào)節(jié)菌體濃度至1×109CFU·mL-1，用于細(xì)菌菌體噴霧。

1.5.2病原菌菌懸液的制備 取保存于-80 ℃的病原菌亞洲鐮刀菌P2的菌塊接種到PDA平板上，于28 ℃培養(yǎng)48 h 后，轉(zhuǎn)接到PDB液體培養(yǎng)基里，28 ℃ 160 r·min-1震蕩培養(yǎng)7 d，用單層紗布過濾，獲得P2的分生孢子，調(diào)節(jié)孢懸液濃度至1×105CFU·mL-1，備用。

1.5.3小麥盆栽試驗(yàn) 小麥盆栽試驗(yàn)于2017—2018年在山東省科學(xué)院東院區(qū)進(jìn)行。試驗(yàn)采用直徑為33 cm、深度28 cm的塑料盆，土壤采自大田耕作層，過篩并摻入適量有機(jī)肥，每盆裝土14 kg，澆透水后于11月14日手工點(diǎn)播濟(jì)麥22麥種。出苗后每盆定苗13株，全生育期內(nèi)定量澆水，正常管理。設(shè)5個(gè)處理，每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每盆為1個(gè)重復(fù)，詳細(xì)設(shè)置見表1。于2018年4月24日(冬小麥揚(yáng)花初期)噴施病原菌P2孢子懸浮液，并于2018年4月24日(冬小麥揚(yáng)花初期)和2018年4月29日(揚(yáng)花盛期)兩次噴施拮抗菌Z54菌液。于第二次噴施拮抗菌液后第14和21 d分別調(diào)查病情，記錄病穗數(shù)和病級(jí)，并計(jì)算防治效果。

表1 小麥赤霉病防治試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Designation of experiments against wheat Fusarium head blight

依據(jù)《小麥赤霉病測(cè)報(bào)技術(shù)規(guī)范》[16]調(diào)查小麥赤霉病穗數(shù)和各穗病級(jí)，小麥赤霉病分5級(jí)：0級(jí)，不發(fā)??；1級(jí)，病小穗占全穗的1/4以下；2級(jí)，病小穗占全穗的1/4～1/2；3級(jí)，病小穗占全穗的1/2～3/4；4級(jí)，病小穗占全穗的3/4以上。

1.6 Z54防治小麥赤霉病田間試驗(yàn)

1.6.1試驗(yàn)田基本情況 試驗(yàn)地位于江蘇省揚(yáng)州市邗江區(qū)郊外農(nóng)田，為小麥赤霉病常發(fā)地塊，供試田塊基本苗密度均勻，肥力適中，植株生長(zhǎng)勢(shì)基本一致，供試小麥品種為寧麥13，常規(guī)肥水管理。

1.6.2試驗(yàn)設(shè)計(jì) 參照《殺菌劑防治小麥赤霉病》[17]進(jìn)行大田試驗(yàn)，對(duì)揚(yáng)花期的小麥田采用隨機(jī)區(qū)組法劃定小區(qū)，每小區(qū)20 m2，設(shè)4個(gè)處理(表1)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。于2018年4月25日(揚(yáng)花初期)和5月2日分兩次施用，每次用藥量為750 L·hm-2。

1.6.3試驗(yàn)安全性分析 第一次用藥后第3和7 d調(diào)查藥劑對(duì)作物是否有藥害，檢查植株葉片是否出現(xiàn)斑點(diǎn)、黃化、失綠、枯萎、卷葉、落葉等，植株是否出現(xiàn)縮節(jié)、簇生等癥狀。記錄藥害的類型和為害癥狀。

1.6.4試驗(yàn)結(jié)果調(diào)查 于小麥乳熟期(5月16日和5月23日)分別調(diào)查發(fā)病情況，每個(gè)處理五點(diǎn)取樣，每點(diǎn)100穗，記錄病穗數(shù)和病級(jí)，并計(jì)算防效。病情指數(shù)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及病指防效的計(jì)算方法參照1.5.3。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

在Microsoft Excel 2010中對(duì)平板抑菌率、病穗率、病情指數(shù)、病穗防效、病指防效等進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用軟件SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用單因素方差分析的Duncan法進(jìn)行多重檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌株的分離與篩選

從各地采集的小麥赤霉病病穗上共分離到175株細(xì)菌。將菌株按照菌落形態(tài)差異進(jìn)行分類，共分成5組(表2)。從各分組的各采集地中至少選取一株生長(zhǎng)速度最快的菌株進(jìn)行初篩，總共選出32株細(xì)菌，供后續(xù)試驗(yàn)用。

表2 試驗(yàn)菌株分類及其采集地點(diǎn)Table 2 Classification of tested strains and their collection localities

采用共培養(yǎng)法檢測(cè)32株細(xì)菌菌株發(fā)酵液對(duì)亞洲鐮刀菌P2的拮抗作用，進(jìn)行拮抗菌株的初篩，結(jié)果(圖1A)顯示，27株對(duì)P2均有不同程度的抑制作用，只有5株對(duì)P2沒有抑制作用。其中，11株對(duì)P2菌株的抑制作用明顯，含有Z54、Z53、CKJT1、Z3、B263-2、Z31、G11-14-2、Z38、Z6細(xì)菌菌液的PDA上P2菌株均未生長(zhǎng)，含有G8-5-4、G12-6-1細(xì)菌菌液的培養(yǎng)基上P2生長(zhǎng)嚴(yán)重受限(圖1B)。將11株拮抗細(xì)菌菌株分別與亞洲鐮刀菌P2菌株對(duì)峙培養(yǎng)，進(jìn)行拮抗細(xì)菌菌株的復(fù)篩，結(jié)果(圖1C)顯示，Z54、Z53、CKJT1、Z3、G8-5-4、B263-2、Z31、G11-14-2、Z38、Z6、G12-6-1共11個(gè)菌株對(duì)亞洲鐮刀菌P2均有明顯抑制作用，與P2對(duì)峙培養(yǎng)6 d后，Z54對(duì)P2菌絲的抑制率達(dá)到70.13%。

顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的亞洲鐮刀菌P2菌株的菌絲粗細(xì)均勻、纖長(zhǎng)，菌絲頂端尖細(xì)(圖2)。但在對(duì)峙平板上，Z54形成的抑菌圈處，亞洲鐮刀菌P2菌絲形態(tài)異常，菌絲前沿生長(zhǎng)明顯受到抑制，與CK菌絲相比，該處病原菌菌絲粗細(xì)不均勻，分支增加，頂端細(xì)胞發(fā)育受阻，生長(zhǎng)畸形，形似葫蘆狀(圖2)。

注：A:抑制率，不同小寫字母表示不同材料間差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；B：共培養(yǎng)；C:對(duì)峙培養(yǎng)。Note: A: Inhibition rate, different lowercase letters indicate statistically significant differences between different materials at P<0.05 level; B: Co-culture; C: Dual culture.圖1 拮抗細(xì)菌對(duì)亞洲鐮刀菌P2的拮抗作用Fig.1 Antifungal activities of antagonistic bacteria against P2 strain of F. asiaticum

圖2 不同處理的亞洲鐮刀菌P2菌絲前端形態(tài)Fig.2 Morphology of P2 strain of F. asiaticum in different treatments

2.2 拮抗菌Z54的形態(tài)學(xué)鑒定

拮抗菌Z54在LB平板上生長(zhǎng)的菌落呈白色，不規(guī)則圓形隆起，不透明，后期菌落呈奶黃色，菌落表面有褶皺，中間凹陷，邊緣粗糙(圖3)。顯微鏡油鏡觀察，發(fā)現(xiàn)菌體呈短桿狀。過夜培養(yǎng)16 h只有極少數(shù)菌體開始產(chǎn)芽胞，培養(yǎng)72 h后，部分菌體產(chǎn)芽胞(圖3)。

圖3 拮抗菌Z54菌落形態(tài)和菌體形態(tài)Fig.3 Colony morphology and microscopic morphology of Z54

2.3 高活性拮抗菌的基因序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

對(duì)菌株的16S rDNA保守序列測(cè)序結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析，并進(jìn)行16S rDNA序列的同源性比較，結(jié)果顯示拮抗菌CKJT1、Z3、Z6、Z31、Z38、Z53、Z54與B.subtilis同源性最高，為98%；拮抗菌G8-5-4、G11-14-2、B263-2與Enterobacterludwigii同源性最高，為100%；拮抗菌G12-6-1與Sphingobacteriumfaecium同源性最高，為99%。

由16S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)可知，拮抗菌G8-5-4、G11-14-2、B263-2與E.ludwigii親緣關(guān)系最近，相似性為100%，將其鑒定為E.ludwigii；拮抗菌G12-6-1與S.faecium親緣關(guān)系最近，相似性為99%，將其鑒定為S.faecium。7個(gè)拮抗菌CKJT1、Z3、Z6、Z31、Z38、Z53、Z54與B.subtilis親緣關(guān)系最近，相似性98%，初步鑒定為B.subtilis。gyrB基因是蛋白編碼基因的典型代表，不會(huì)發(fā)生頻繁的水平轉(zhuǎn)移，在不同蛋白及蛋白的不同位點(diǎn)，其氨基酸替代率也不同，這就使得gyrB基因序列在鑒定芽胞桿菌近緣種方面，比16S rDNA具有更高的分辨率。對(duì)7株芽胞桿菌的gyrB基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果(圖4)顯示，7個(gè)菌株與B.subtilis親緣關(guān)系最近，有100%的相似性，因此將其鑒定為B.subtilis。

注：圖中加粗黑體菌株表示本研究中分離并鑒定的菌株。Note: Strains in bold were isolated and identified in present research.圖4 基于16S rDNA和gyrB序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic trees based on 16S rDNA and gyrB sequence

2.4 拮抗菌Z54盆栽防治小麥赤霉病效果

從盆栽小麥接種亞洲鐮刀菌P2和拮抗菌Z54后結(jié)果(表3)可知，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理的病穗率和病情指數(shù)均有不同程度的增加。接種后第14 d，PCK2的病穗率達(dá)68.00%，PCK3的病穗率為17.32%，PT1和PT2處理的病穗率為19.26%、19.84%，比PCK2的病穗率降低48.74%、48.16%；病穗防效達(dá)到71.68%、70.82%，比PCK3低2.85%、3.71%。PT1和PT2的病情指數(shù)為9.63%、9.92%，比PCK2低29.77%、29.48%；病指防效達(dá)到75.56%、74.82%，比PCK3低4.46%、5.2%。接種后第21 d，PCK2的病穗率達(dá)84.80%，PCK3的病穗率為25.20%，PT1和PT2的病穗率為25.93%、26.19%，分別比PCK2的病穗率降低58.87%、58.61%，病穗防效達(dá)到69.43%、69.12%，分別比PCK3低0.86%、1.17%。PT1和PT2的病情指數(shù)分別為13.89%、14.29%，分別比PCK2低50.91%、50.51%，病指防效達(dá)到78.57%、77.95%，比PCK3低2.29%、2.91%。上述結(jié)果說明，拮抗菌Z54發(fā)酵液和菌體對(duì)小麥赤霉病原菌P2均具有較好的生防效果，可以降低赤霉病的發(fā)病率。

表3 Z54防治小麥赤霉病的盆栽試驗(yàn)效果Table 3 Pot experiment results of Z54 strain against wheat Fusarium head blight

2.5 生防菌Z54的田間防治效果

兩次生防菌使用之后，發(fā)現(xiàn)各處理區(qū)小麥長(zhǎng)勢(shì)正常，與清水對(duì)照區(qū)基本一致，小麥無明顯的藥害癥狀。說明生防菌和藥劑未對(duì)小麥的生長(zhǎng)產(chǎn)生不良影響，比較安全。

從表4可以看出，處理后14 d，F(xiàn)T1和FT2處理的病穗率和病情指數(shù)差異均不顯著(P>0.05,P>0.01)，但均與FCK1差異顯著(P<0.05，P<0.01)；FT1、FT2和FCK1的病穗率分別為1.20%、1.13%、3.80%，病情指數(shù)分別為0.33%、0.32%、1.02%。FT1和FT2的病穗防效和病指防效在P<0.05和P<0.01水平均差異顯著，F(xiàn)T2均優(yōu)于FT1，且與FCK2均差異顯著(P<0.05，P<0.01)；FT1、FT2和FCK2的病穗防效分別為68.42%、70.18%、78.95%，病指防效分別為67.21%、68.85%、80.33%。處理21 d后，F(xiàn)T1、FT2和FCK2處理之間病穗率和病情指數(shù)均差異不顯著(P>0.01)，均與FCK1差異顯著；處理FT1和FT2之間無顯著性差異，但與FCK2和FCK1在P<0.05水平差異顯著，F(xiàn)T1、FT2、FCK2和FCK1的病穗率分別為1.33%、1.27%、1.00%、4.87%，病情指數(shù)分別為0.40%、0.37%、0.27%、1.52%。FT1、FT2 的病穗防效和病指防效均與FCK2在P<0.05和P<0.01水平差異顯著，F(xiàn)T1、FT2和FCK2的病穗防效分別為72.60%、73.97%、79.45%，病指防效分別為73.63%、75.82%、82.42%。

綜上，隨著調(diào)查時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)T1、FT2和FCK2的防治效果均有不同程度的提高，其中FCK2的病穗防效和病指防效最好，F(xiàn)T2效果其次，F(xiàn)T1效果較差，三者在P<0.05和P<0.01水平均差異顯著。氰烯菌酯是目前大田中防治小麥赤霉病效果最好的化學(xué)藥劑。14 d時(shí)，Z54菌體和發(fā)酵液處理的病穗防效較氰烯菌酯處理低10.53%、8.77%，病指防效低13.12%、11.48%；21 d時(shí)，Z54菌體和發(fā)酵液處理的病穗防效較氰烯菌酯處理低6.85%、5.48%，病指防效低8.79%、6.60%。

表4 Z54防治小麥赤霉病的田間試驗(yàn)效果Table 4 Field experiment results of Z54 strain against wheat Fusarium head blight

3 討論

小麥赤霉病的生物防治研究已有一些報(bào)道，但尚未見到專門針對(duì)亞洲鐮刀菌的生防研究。Zhang等[1]研究發(fā)現(xiàn)亞洲鐮刀菌主要產(chǎn)生3-乙?；撗跹└牭毒┐?3-ADON)類毒素，而禾谷鐮刀菌只產(chǎn)生15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15-ADON)類毒素。Ward等[18]研究發(fā)現(xiàn)，與產(chǎn)生15-ADON毒素的鐮刀菌群體相比，產(chǎn)生3-ADON的鐮刀菌群體能產(chǎn)生更多的毒素，表現(xiàn)出更強(qiáng)的繁殖力和更快的生長(zhǎng)速率。盡管小麥赤霉病的種群組成和毒素化學(xué)型不是完全一一對(duì)應(yīng)的，但亞洲鐮刀菌的流行危害以及產(chǎn)生的毒素應(yīng)引起更多重視。本研究以亞洲鐮刀菌為防治對(duì)象，篩選出具有高拮抗活性的Z54菌株，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定結(jié)合形態(tài)學(xué)分析，將該菌株鑒定為枯草芽胞桿菌。共培養(yǎng)和平板對(duì)峙試驗(yàn)表明，Z54菌株能顯著抑制亞洲鐮刀菌菌絲的生長(zhǎng)。盆栽試驗(yàn)表明，Z54菌株的菌體與菌株發(fā)酵液對(duì)亞洲鐮刀菌的防效分別為78.57%和77.95%；田間小區(qū)試驗(yàn)顯示，菌體與菌株發(fā)酵液對(duì)小麥赤霉病的防效分別為73.63%和75.82%。說明Z54菌株的菌體和菌株發(fā)酵液對(duì)亞洲鐮刀菌的防治效果較好，具有良好的應(yīng)用前景。

在前期關(guān)于小麥赤霉病生物防治的研究中，已有枯草芽胞桿菌作為拮抗菌的報(bào)道。余桂容等[19]從小麥葉片和穗部分離篩選出兩株枯草芽胞桿菌B4、B6，對(duì)禾谷鐮刀菌引起的小麥赤霉病防效均能達(dá)到68%以上。劉偉成等[20]從小麥植株上分離篩選到8株拮抗性芽胞桿菌，有7株是枯草芽胞桿菌，其中抑菌活性最強(qiáng)的菌株B08對(duì)禾谷鐮刀菌的防治效果達(dá)到65%以上。本研究中，枯草芽胞桿菌Z54對(duì)亞洲鐮刀菌引起的小麥赤霉病防效達(dá)到69%以上，與上述研究的防效相近。田間小區(qū)試驗(yàn)結(jié)果顯示，Z54發(fā)酵液處理對(duì)小麥赤霉病的防效優(yōu)于菌體處理，可能是由于發(fā)酵液中產(chǎn)生的某些抑菌代謝產(chǎn)物也具有抑菌作用。因此，枯草芽胞桿菌Z54可作為小麥赤霉病防治的優(yōu)良生防菌資源。然而，枯草芽胞桿菌Z54拮抗禾谷鐮刀菌的作用機(jī)制，仍然不清楚，需要進(jìn)一步研究。

多菌靈曾經(jīng)是防治小麥赤霉病應(yīng)用最廣泛的化學(xué)藥劑，但是由于長(zhǎng)期使用導(dǎo)致病原菌抗藥性增加，多菌靈對(duì)小麥赤霉病的防治效果變差。氰烯菌酯是目前生產(chǎn)上防治小麥赤霉病效果較好的化學(xué)藥劑之一，盡管生防菌Z54的防治效果與其相比稍差，但是從減少化學(xué)農(nóng)藥使用、減緩病原菌抗藥性產(chǎn)生的角度出發(fā)，生物防治是更加理想的選擇。生防菌Z54屬于芽胞桿菌，繁殖力強(qiáng)，抗逆性強(qiáng)，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng)，易于定殖。因此，利用拮抗效果好的芽胞桿菌菌劑對(duì)小麥赤霉病進(jìn)行生物防治，對(duì)持續(xù)控制病害流行、保證小麥的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)具有重要意義。