陳曉, 石巍

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所, 北京 100093)

我國是養(yǎng)蜂大國，蜂產(chǎn)品產(chǎn)量居世界前列。同時(shí)，蜜蜂也是維持生態(tài)環(huán)境持續(xù)發(fā)展不可或缺的物種，是植物、特別是新興設(shè)施作物的主要授粉昆蟲。蜜蜂養(yǎng)殖業(yè)的關(guān)鍵是種蜂王，其優(yōu)劣直接影響?zhàn)B蜂經(jīng)濟(jì)效益。繁殖性狀是蜂王直接展現(xiàn)出的重要經(jīng)濟(jì)性狀，同時(shí)也是蜂群產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益的重要基礎(chǔ)性狀。因此，研究蜂王繁殖性狀的遺傳和調(diào)控機(jī)制是蜜蜂遺傳育種領(lǐng)域的重要課題。

蜜蜂繁殖性狀RNA的研究對于闡明蜜蜂繁殖性狀的分子遺傳機(jī)制意義重大，也為挖掘繁殖性狀分子標(biāo)記基因、開展分子育種工作，進(jìn)而提高蜜蜂繁殖性能、增加養(yǎng)蜂經(jīng)濟(jì)效益奠定基礎(chǔ)。伴隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，研究人員對蜂王繁殖性狀分子遺傳機(jī)制的研究從單個(gè)編碼基因開始，到后來的高通量測序，從未停止過[1-5]。近幾年，研究人員也加強(qiáng)了非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)在蜜蜂繁殖活動(dòng)中作用的研究[6-10]。非編碼RNA是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA，研究發(fā)現(xiàn)生物體越復(fù)雜，非編碼RNA所占的比例就越大，說明非編碼RNA在生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[7-8]。在蜜蜂繁殖過程中編碼RNA(coding RNA，cRNA)和非編碼RNA發(fā)揮了重要作用，近幾年,研究人員通過高通量測序的方法獲得了蜜蜂工蜂、處女蜂王和產(chǎn)卵蜂王卵巢和腦部組織的編碼RNA和非編碼RNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)RNA的表達(dá)量與蜜蜂卵巢的激活狀態(tài)緊密相關(guān)。本文詳細(xì)闡述了蜜蜂繁殖性狀相關(guān)的編碼RNA和非編碼RNA的研究進(jìn)展，介紹了信使RNA(messenger RNA，mRNA)、小RNA(microRNA，miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)以及近幾年才發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)在蜜蜂卵巢激活、產(chǎn)卵等繁殖性狀中取得的研究進(jìn)展情況，以期為蜜蜂繁殖性狀的分子遺傳機(jī)制研究提供參考。

1 編碼與非編碼RNA

基因組DNA經(jīng)過轉(zhuǎn)錄可以產(chǎn)生兩大類RNA，一類是可以被翻譯成蛋白質(zhì)的編碼RNA，即mRNA；另一類是不具有或具有較低編碼能力的非編碼RNA。許多物種的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，基因組中只有很小一部分基因編碼蛋白，例如人類中僅有小于2%的基因組編碼蛋白，因此,轉(zhuǎn)錄組中有很多非編碼RNA序列。非編碼RNA包括普遍存在的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(transfer RNA， tRNA)、核糖體RNA(ribosome RNA，rRNA)，以及具有組織表達(dá)特異性和時(shí)間表達(dá)特異性的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)、miRNA、circRNA、lncRNA等。

2 蜜蜂繁殖性狀相關(guān)的編碼RNA及非編碼RNA

2.1 與蜜蜂繁殖性狀相關(guān)的mRNA

關(guān)于mRNA在蜜蜂繁殖活動(dòng)中的作用，多集中在保幼激素(juvenile hormones，JH)、蛻皮激素(ecdysteroids，Ec)和卵黃原蛋白(vitellogenin，Vg)上，或者是JH、Ec和Vg的下游基因[1]。JH和Ec是蜜蜂繁殖活動(dòng)中最重要的激素[1-3]，而Vg是卵黃蛋白的前體，卵黃蛋白是蜜蜂卵的主要成分。

2008年以后，研究人員逐漸開始采用高通量方法研究蜜蜂繁殖相關(guān)過程中大規(guī)?；虻谋磉_(dá)變化,結(jié)果表明，蜂王在卵巢激活過程中，其腦部和卵巢轉(zhuǎn)錄組水平發(fā)生了大規(guī)模的改變[4-6]。Kocher等[5]利用基因芯片的方法,比較了相同日齡的處女王、交尾一次但未開始產(chǎn)卵蜂王，以及交尾一次開始產(chǎn)卵蜂王的腦和卵巢的基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)有971個(gè)轉(zhuǎn)錄本在3組樣本腦部差異表達(dá)，366個(gè)轉(zhuǎn)錄本在卵巢差異表達(dá)。還有研究人員利用基因芯片分析同齡處女王、不育工蜂和產(chǎn)卵工蜂腦部基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)蜂王和不育工蜂約有2 000個(gè)基因差異表達(dá)，產(chǎn)卵工蜂和不育工蜂有221個(gè)基因差異表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)產(chǎn)卵工蜂基因的表達(dá)模式與蜂王更為類似[7]。mRNA表達(dá)發(fā)生了顯著變化，說明其在蜜蜂繁殖活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。

根據(jù)前人的研究結(jié)果，對已知與蜜蜂繁殖性狀相關(guān)的mRNA進(jìn)行整理發(fā)現(xiàn)，一些基因與蜜蜂繁殖重要激素Ec及其受體、JH相互作用，從而影響蜜蜂的繁殖過程。例如，多巴胺受體2(dopamine receptor 2,Dopr2)、蛻皮激素受體(ecdysone receptor，Ecr)、蛻皮激素誘導(dǎo)蛋白75(ecdysone-induced protein 75,E75)、蛻皮激素調(diào)節(jié)基因(ecdysteroid-regulated gene E74，E74)、蜂王漿主蛋白3(major royal jelly protein 3,Mrjp3)等基因是Ec的下游基因，參與Ec引導(dǎo)的信號通路。E75、Kruppel 同系物1(Kruppel homolog 1,Kr-h1)和核激素受體Ftz-f1(nuclear hormone receptor Ftz-f1)是JH下游基因，參與JH介導(dǎo)的信號通路。E75連接了蜜蜂繁殖兩大重要激素，Ec和JH的信號能相互協(xié)調(diào)共同作用于蜜蜂的繁殖過程。另外，還有一些基因雖沒有直接參與Ec和JH信號通路，但依然在蜜蜂繁殖活動(dòng)中發(fā)生了表達(dá)水平的顯著變化，例如,細(xì)胞色素家族的多個(gè)基因，它們在蜜蜂繁殖活動(dòng)的作用有待進(jìn)一步挖掘。各mRNA在蜜蜂繁殖過程中潛在的功能作用見表1。

表1 蜜蜂繁殖性狀相關(guān)的mRNATable 1 mRNAs related to honey bees reproductive traits

2.2 與蜜蜂繁殖性狀相關(guān)的miRNA

miRNA是目前研究最廣泛的非編碼RNA，它是一類長度為19～25 nt的內(nèi)源非編碼RNA，廣泛參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控活動(dòng)。其中，多數(shù)miRNA具有高度保守性、表達(dá)時(shí)序性和組織特異性[13]。2018年3月，Sanger microRNA序列數(shù)據(jù)庫(miRBase)中具有發(fā)夾前體序列蜜蜂miRNA 259條，成熟miRNA產(chǎn)物262條，關(guān)于蜜蜂miRNA的相關(guān)參考文獻(xiàn)報(bào)道有1 482條。最新研究發(fā)現(xiàn)，蜜蜂卵巢組織的miRNA長度主要集中在20～23 nt，但是在蜂王和工蜂中又存在差別，蜂王卵巢組織的miRNA長度集中在20～22 nt，工蜂卵巢組織的miRNA長度集中在20～23 nt[13-17]。蜜蜂卵巢組織miRNA在每條染色體都有分布，在蜂王中，1號染色體miRNA分布最多；在工蜂中，15號染色體miRNA分布最多[13-17]。

最近的研究表明，miRNA參與各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等，具有重要的基因表達(dá)調(diào)控作用[13-14]。目前，研究人員已經(jīng)在蜜蜂中發(fā)現(xiàn)一些與繁殖性狀相關(guān)的重要miRNA，例如， Macedo等[10]和Ashby等[15]研究發(fā)現(xiàn),ame-miR-bantam、ame-miR-184和ame-miR-315參與蜜蜂的組織結(jié)構(gòu)重塑、細(xì)胞分化、卵巢發(fā)育和級型分化。此外，ame-miR-14和ame-miR-8與JH和Ec密切相關(guān)[8,15-16]，而JH和Ec是蜜蜂繁殖活動(dòng)中最重要的激素[2-3]。以上研究說明，miRNA在蜜蜂繁殖活動(dòng)中可能發(fā)揮著重要作用。與蜜蜂繁殖性狀相關(guān)的miRNA見表2。

表2 蜜蜂繁殖性狀相關(guān)的miRNATable 2 miRNAs related to honey bees reproductive traits

2.3 與蜜蜂繁殖性狀相關(guān)的lncRNA

lncRNA是另一類重要的非編碼RNA。它是長度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其表達(dá)具有組織特異性和時(shí)序性，在細(xì)胞分化、發(fā)育、免疫等方面發(fā)揮重要作用[18-20]。蜜蜂卵巢組織的lncRNA長度范圍從96 nt到20 674 nt不等，平均長度約為1 881 nt；lncRNA在每條染色體都有分布，其中在1號染色體分布最多，13號染色體分布最少；>93%的lncRNA包含2～5個(gè)外顯子[21]。

2014年,Necsulea等[22]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA具有在動(dòng)物中卵巢組織表達(dá)的偏好性；2015年,Jayakodi等[23]在蜜蜂的卵巢組織中發(fā)現(xiàn)了特異表達(dá)的基因間長鏈非編碼RNA；2017年,Chen等[21]通過高通量測序和生物信息學(xué)方法鑒定和分析了蜜蜂卵巢組織特異表達(dá)的lncRNA。但是關(guān)于特定lncRNA在蜜蜂繁殖活動(dòng)中的作用，還需要相關(guān)的分子實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。2011年,Graham等[24]鑒定了蜜蜂卵巢大小相關(guān)的QTL區(qū)間，這個(gè)QTL區(qū)間位于蜜蜂基因組11號染色體8.9～12.2 Mb，其對鑒定蜜蜂繁殖活動(dòng)相關(guān)RNA具有重要參考價(jià)值。物理位置在蜜蜂卵巢大小相關(guān)的QTL區(qū)間內(nèi)的，并且在蜜蜂卵巢組織特異表達(dá)的lncRNA見表3。

表3 分布在蜜蜂卵巢大小相關(guān)的QTL區(qū)間內(nèi)且在蜜蜂卵巢組織特異表達(dá)的lncRNA[21]Table 3 lncRNAs located in the QTL region for ovary size in honey bees’ ovary[21]

2.4 與蜜蜂繁殖性狀相關(guān)的circRNA

circRNA是一類新發(fā)現(xiàn)的重要調(diào)控因子，具有組織表達(dá)特異性、時(shí)序性等特點(diǎn)，能夠吸附miRNA，對基因具有表達(dá)調(diào)控作用。circRNA與傳統(tǒng)的線性RNA不同，是特殊非編碼RNA分子，呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受RNA外切酶的影響，表達(dá)更穩(wěn)定，不易降解[25-28]。2012年,斯坦福大學(xué)和霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所的科學(xué)家首次證實(shí)，人體細(xì)胞的基因表達(dá)時(shí)，circRNA分子比線性RNA分子是更普遍的現(xiàn)象[26]。circRNA已成為RNA領(lǐng)域的最新研究熱點(diǎn)[27,29-31]。

蜜蜂卵巢組織circRNA的類型主要包括外顯子circRNA、內(nèi)含子circRNA、外顯子-內(nèi)含子circRNA、反義鏈circRNA、基因間circRNA。其中，外顯子circRNA占80%以上，>57% circRNA包含2～3個(gè)外顯子[32]。蜜蜂卵巢組織circRNA在每條染色體上都有分布，其中1號染色體分布最多，有超過2 000個(gè)circRNA，其他染色體各分布800～1 500個(gè)circRNA[32]。

circRNA的生物學(xué)功能主要是根據(jù)其來源基因的功能進(jìn)行預(yù)測，如果circRNA來源于繁殖相關(guān)的基因，那么該circRNA在蜜蜂繁殖活動(dòng)中就可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。來源于蜜蜂繁殖性狀相關(guān)的circRNA見表4。

表4 來源于蜜蜂繁殖性狀相關(guān)基因的circRNA[32]Table 4 circRNAs produced by genes with known or suspected roles of in reproductive related processes in honey bees[32]

3 編碼RNA與非編碼RNA之間的相互作用

目前，對編碼RNA與非編碼RNA之間的相互作用研究較多的是miRNA與基因之間的相互作用。miRNA能夠通過與靶基因相結(jié)合，影響基因的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后翻譯，從而影響各種生物過程。在蜜蜂中，研究人員發(fā)現(xiàn)miR-14在卵巢激活和產(chǎn)卵啟動(dòng)時(shí)表達(dá)均顯著下調(diào)[10]；而miR-14與Ecr的表達(dá)顯著相關(guān)，并且Ecr的基因序列中含有miR-14的序列結(jié)合位點(diǎn)[11]，同時(shí)Ecr能夠影響蜜蜂蛻皮激素含量和產(chǎn)卵[16-19]。因此，可以推斷miR-14可能通過序列結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合Ecr，通過調(diào)節(jié)Ecr的表達(dá)，而影響蜜蜂蛻皮激的素含量，進(jìn)而影響蜂王產(chǎn)卵。2018年,研究人員對蜜蜂circRNA進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA circ_16640含有miR-14序列結(jié)合位點(diǎn)，能夠競爭性地吸附miR-14[32]。研究推測，環(huán)狀RNA circ_16640可能通過序列結(jié)合位點(diǎn)吸附miR-14，解除miR-14對Ecr的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)蛻皮激素的合成、促進(jìn)蜂王的卵巢激活和產(chǎn)卵啟動(dòng)[32]。3種RNA形成circRNA-miRNA-mRNA的互作網(wǎng)絡(luò)，對生物過程發(fā)揮作用。關(guān)于lncRNA與編碼RNA的相互作用，有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA XLOC_073978能夠與Ecr下游基因Obp10相互作用，進(jìn)而影響蜜蜂繁殖相關(guān)過程。更多關(guān)于編碼RNA與非編碼RNA之間的相互作用有待進(jìn)一步的研究。

4 展望

本文綜述了mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA在蜜蜂卵巢激活、產(chǎn)卵等繁殖活動(dòng)中的作用，這些RNA表達(dá)的升高或降低與蜜蜂卵巢激活、產(chǎn)卵調(diào)控等過程密切相關(guān)。通過基因標(biāo)記、調(diào)節(jié)RNA的表達(dá)水平等，可實(shí)現(xiàn)調(diào)控或影響蜜蜂的繁殖活動(dòng)。但是目前仍有許多問題亟待解決，例如，如何應(yīng)用載體增加蜜蜂繁殖組織mRNA和ncRNA的表達(dá)，外源性補(bǔ)充的ncRNA與內(nèi)源性ncRNA發(fā)揮作用的方式是否相同，如何針對特異性的細(xì)胞調(diào)控mRNA和ncRNA的表達(dá)等，這些問題都需要分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)探索解決。蜜蜂繁殖組織mRNA和ncRNA的研究對于闡明蜜蜂繁殖性狀的分子遺傳機(jī)制意義重大，也為提高蜜蜂繁殖性能、進(jìn)而提高養(yǎng)蜂經(jīng)濟(jì)效益奠定基礎(chǔ)。蜜蜂繁殖性狀相關(guān)RNA的研究中，關(guān)于mRNA和miRNA對蜜蜂卵巢激活的研究最多，但是關(guān)于lncRNA和circRNA在蜜蜂繁殖性狀中的研究才剛剛起步，更多在蜜蜂繁殖活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的lncRNA和circRNA亟需被發(fā)掘與研究。不管是編碼RNA還是非編碼RNA，其在蜜蜂繁殖過程中的功能研究都還有很長的路要走。