郭 霞， 黃丹慜， 茍志輝， 田 蜜

(海南省林業(yè)科學(xué)研究所， ?？?571100)

三葉魚藤(Derristrifoliata)屬豆科(Leguminosae)魚藤屬(Derris)多年生藤本植物[1-2]，產(chǎn)于熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國(guó)海南、廣西、廣州、臺(tái)灣等紅樹林生長(zhǎng)地廣泛分布.該植物富含黃酮類物質(zhì)，尤其以魚藤酮最為特殊[3-4].該物質(zhì)有毒，民間最早用作殺魚劑[5].后來發(fā)現(xiàn)魚藤酮的殺蟲活性，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到實(shí)際應(yīng)用[6-8].近來，在醫(yī)藥方面研究發(fā)現(xiàn)，魚藤酮對(duì)帕金森病有一定的預(yù)防和治療作用[9-10].目前有大量文獻(xiàn)和專利報(bào)道提取魚藤屬中的魚藤酮.使用的溶劑有甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、苯、氯仿等[11-12].其中丙酮和氯仿為管制溶劑，苯的毒性較大，這些溶劑危險(xiǎn)性較高，環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)較大，越來越不適合實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)生產(chǎn)使用.甲醇沸點(diǎn)低、正丁醇沸點(diǎn)太高，為此，本研究選擇乙醇為提取溶劑.提取方法有加熱提取法[12]、微波提取法[13]、超臨界CO2萃取法[14-17]等.2016年9月18日，海南對(duì)東寨港國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局三葉魚藤種群進(jìn)行招標(biāo)防控；2016年10月26日，海南日?qǐng)?bào)以“魚藤瘋長(zhǎng)，紅樹林告急”為題，報(bào)道了儋州新英灣紅樹林生態(tài)系統(tǒng)受三葉魚藤的威脅，需要引起足夠重視，導(dǎo)致三葉魚藤成為有害生物[18].因此，為了變廢為寶，充分挖掘三葉魚藤的價(jià)值，提取其中魚藤酮活性物質(zhì).本實(shí)驗(yàn)采用滲漉法常溫提取，避免浪費(fèi)熱能，安全系數(shù)較高.同時(shí)選擇乙醇濃度和提取時(shí)間，采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取魚藤酮，為工業(yè)生產(chǎn)服務(wù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

三葉魚藤(DerristrifoliateLour.)根莖采自?？跂|寨港國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)(110°34′E，19°51′N)，海南東寨港國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)位于海南省東北部，屬熱帶季風(fēng)區(qū)海洋性氣候，土壤有機(jī)質(zhì)含量豐富，pH值在3.5～7.5之間.采樣區(qū)內(nèi)平均海拔為2 m，主要為海蓮、桐花樹、角果木、秋茄等植物群落.三葉魚藤根莖采摘之后切成1 cm片段，晾干、粉碎，過60目篩，備用.

1.2 單因素試驗(yàn)

采用室溫(25 ℃)滲漉法提取[19]，溶劑選擇乙醇，濃度為50%、60%、70%、80%、90%、100%，提取時(shí)間為1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d，過濾，溶液進(jìn)行減壓濃縮，真空減壓干燥，得到粗提物樣品，備用.

1.3 魚藤酮含量測(cè)定

以魚藤酮標(biāo)準(zhǔn)樣品(Sigma公司，含量99%)為參照(圖1)，采用美國(guó)Agilent 6890N公司的高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行檢測(cè)[20].檢測(cè)條件：C18色譜柱，色譜柱：250 mm×4.0 mm不銹鋼柱， 流動(dòng)相V(乙腈)∶V(水)=60∶40，柱溫30 ℃，流速為1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為294 nm，進(jìn)樣量10 μL.根據(jù)魚藤酮標(biāo)樣的吸收峰面積和樣品魚藤酮吸收峰面積，參照黃繼光等方法[11]，計(jì)算三葉魚藤中魚藤酮的含量.

圖1 魚藤酮標(biāo)樣和三葉魚藤的HPLC圖譜Fig.1 HPLC spectrum of rotenone standard sample and Derris trifoliate

1.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用雙因素，五水平的中心旋轉(zhuǎn)復(fù)合設(shè)計(jì)方法[21].選取因素分別為乙醇濃度和提取時(shí)間，根據(jù)單因素試驗(yàn)確定雙因素的水平，軸距為±1.414.利用Design-Expert 8.0.6軟件，經(jīng)多元線性回歸分析建立經(jīng)驗(yàn)二階多項(xiàng)式模型.

1.5 數(shù)據(jù)分析

響應(yīng)曲面數(shù)據(jù)由Design-Expert 8.0.6軟件分析，所有統(tǒng)計(jì)分析采用SAS 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行ANOVA方差分析(p< 0.05).

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

分別選擇乙醇濃度(時(shí)間固定為4 d)與提取時(shí)間(乙醇濃度固定為80%)優(yōu)化三葉魚藤中魚藤酮的提取結(jié)果如圖2所示.

A) 乙醇濃度; B)提取時(shí)間A) Ethanol concentration (Time=4 d); B) Extraction time (Ethanol concentration=80%)圖2 單因素優(yōu)化魚藤酮含量 Fig.2 Optimization of rotenone content by single factor

2.1.1 乙醇濃度的影響 固定提取時(shí)間為4 d，當(dāng)乙醇濃度增加，三葉魚藤中魚藤酮的含量快速增加，隨后緩慢降低，結(jié)果如圖2A所示.當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí)，魚藤酮的含量達(dá)到最高，為1.93%；原因是：當(dāng)乙醇濃度增加時(shí)，魚藤酮的溶解性增加；當(dāng)溶解達(dá)到飽和后，乙醇濃度的增加，雜質(zhì)被進(jìn)一步提取，從而導(dǎo)致魚藤酮含量降低.綜合考慮，70%、80%和90%三個(gè)濃度被挑選出進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì).

2.1.2 提取時(shí)間的影響 固定乙醇濃度為80%，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，魚藤酮含量不斷增加；當(dāng)提取時(shí)間為4 d時(shí)，魚藤酮含量達(dá)到最大值，1.97%；隨后含量下降.由于時(shí)間延長(zhǎng)，三葉魚藤中的其他成分也被提取，導(dǎo)致魚藤酮總含量下降.綜合考慮，3 d、4 d和5 d三個(gè)時(shí)間被挑選出進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì).

2.2 模型的建立

根據(jù)上述試驗(yàn)篩選的結(jié)果，選擇乙醇濃度為70%、80%、90%，提取時(shí)間為3 d、4 d、5 d；每個(gè)因素軸距為±1.414，模型設(shè)計(jì)見表1.由表1可知，當(dāng)乙醇濃度為80%，提取時(shí)間為4 d時(shí)(編號(hào)1)，魚藤酮的含量最高，為2.01%.

表1 雙因素的中心復(fù)合旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)及考察指標(biāo)值

續(xù)表1

注：X1=乙醇濃度(Ethanol concentration)/%;X2=提取時(shí)間(Extraction Time)/d.

通過Design-Expert 8.0.6軟件計(jì)算，方差分析結(jié)果見表2.由表2可知，模型的p值< 0.0001，表明該二次模型極顯著.同時(shí)，乙醇濃度、提取時(shí)間兩個(gè)因素及其組合的p值都小于0.05，表明因素自身及因素之間達(dá)到顯著水平.失擬項(xiàng)值為0.210 7(>0.05)，說明所得方程與實(shí)際擬合中非正常誤差所占比例小，多項(xiàng)式方差具有較好的回歸關(guān)系.

表2 二次模型響應(yīng)面的方差分析結(jié)果

注：X1=乙醇濃度(Ethanol concentration)/%;X2=提取時(shí)間(Extraction Time)/d.

對(duì)上述試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到魚藤酮的二階多項(xiàng)式模型，結(jié)果見表3.由表3可知，模型方程相關(guān)系數(shù)顯著，而失擬項(xiàng)概率不顯著(>0.05)，表明擬合形成的經(jīng)驗(yàn)二階多項(xiàng)式模型可用于響應(yīng)面分析.

表3 魚藤酮含量的二階多項(xiàng)式模型

注：X1=乙醇濃度(Ethanol concentration)/%;X2=提取時(shí)間(Extraction Time)/d.

2.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)表3擬合的二階多項(xiàng)式模型，利用響應(yīng)面構(gòu)建的軟件分析，模擬出乙醇濃度、提取時(shí)間與魚藤酮含量的響應(yīng)曲面如圖3所示.由圖3可知，隨乙醇濃度、提取時(shí)間的增加，魚藤酮含量先增加，達(dá)到頂點(diǎn)后緩慢降低.形成的三維圖形有明顯的弧面，表明乙醇濃度和提取時(shí)間對(duì)魚藤酮含量有顯著影響.響應(yīng)面底面的等高線反映了各因素之間的相關(guān)性.由圖3可知，曲面的等高線在底面形成明顯的橢圓形圓心，表明兩個(gè)因素之間有很好的相關(guān)性.

2.4 最優(yōu)條件的驗(yàn)證

根據(jù)中心旋轉(zhuǎn)復(fù)合設(shè)計(jì)方法優(yōu)化出最佳提取條件見表4.當(dāng)乙醇濃度為84%，提取時(shí)間為4.1 d時(shí)，魚藤酮的預(yù)測(cè)最佳值為2.02%；為此，在此條件下，進(jìn)行試驗(yàn)提取魚藤酮，通過色譜分析，得到魚藤酮的含量為1.97%.與試驗(yàn)值相比較，相對(duì)誤差為2.48%(小于5%)，由此表明得到的二階多項(xiàng)式模型可行.

圖3 魚藤酮含量的響應(yīng)曲面.Fig.3 Response surface of rotenone content

考察指標(biāo)evaluation indices乙醇濃度EtOH/%提取時(shí)間Time/d預(yù)測(cè)值Predicted value/%試驗(yàn)值Experimental value/%相對(duì)誤差Relative error/%魚藤酮含量/%844.12.021.972.48

3 結(jié)論與討論

提取后的溶液進(jìn)行減壓濃縮，為了避免高溫造成物質(zhì)變化，本實(shí)驗(yàn)減壓濃縮的溫度控制在45 ℃以下，真空度為0.1個(gè)大氣壓.得到的浸膏為墨綠色，顏色較深，會(huì)干擾液相色譜檢測(cè)的準(zhǔn)確性.為此，本實(shí)驗(yàn)采用前處理方法，統(tǒng)一使用活性炭脫色處理，然后進(jìn)行檢測(cè).乙腈為溶劑測(cè)試魚藤酮標(biāo)樣時(shí)，扣除了乙腈溶劑峰.乙醇濃度大小對(duì)三葉魚藤中活性物質(zhì)的提取有較大關(guān)系，濃度過大，三葉魚藤中雜質(zhì)將進(jìn)一步被提取出來，濃度過小，魚藤酮提取不充分，因此，根據(jù)優(yōu)化以及HPLC檢測(cè)，確定其提取最佳濃度.提取時(shí)間對(duì)魚藤酮含量也有類似結(jié)果，時(shí)間過長(zhǎng)，各種物質(zhì)被提取出來，魚藤酮含量降低；提取時(shí)間較短，魚藤酮提取不充分等.

由此，根據(jù)二階多項(xiàng)式模型，得出最佳乙醇濃度為84%，提取時(shí)間為4.1 d.在此條件下驗(yàn)證值為1.97%，如若提取時(shí)間延長(zhǎng)，將有更多的雜質(zhì)進(jìn)入，導(dǎo)致魚藤酮含量下降，進(jìn)一步純化魚藤酮難度加大；如若提取時(shí)間較短，將浪費(fèi)三葉魚藤材料.因此該結(jié)果為實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化提取三葉魚藤中的活性成分提供了較好的理論依據(jù).