張安潔,楊 勇,肖望成,徐孝青,曾邦權,肖 嘯,代飛燕?,秦 莉 (.云南農業(yè)大學 動物醫(yī)學院學院,云南 昆明6500;.云南省動物疫病預防控制中心,云南 昆明6500;3.昆明學院 農學院,云南 昆明6504)

馬來穿山甲(pangolin Malay)也稱爪哇鯪鯉、馬來鉆山甲,是鱗甲目物種,主要分布于中南亞國家。其嗅覺靈敏、視力弱、免疫器官不發(fā)達。是一種珍稀藥用動物。李時珍在《本草綱目》中就有記載:“鱗可治惡瘡、瘋癥、痛經、利乳[1]?！?007 年,國際自然與自然資源保護聯(lián)盟和保護國際經過評估,馬來穿山甲從低危調整為瀕危等級[2]。目前關于馬來穿山甲的報道僅30篇,多為研究其繁殖、年齡及種群結構,而對于疾病診斷方面僅有1例,即陶立等[3]發(fā)表的1起穿山甲疫情的病原分析。所以本試驗為我們了解馬來穿山甲及腸道致病菌提供了重要的臨床經驗,也為我們后期保護馬來穿山甲提供了及其重要的理論依據。

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是克雷伯菌屬中最為重要的一類細菌,致病性在克雷伯菌屬中最強,存在于人體的上呼吸道和腸道,可引起肺炎、呼吸道及泌尿道感染、腹瀉、敗血癥等[4];變形桿菌(Proteus species)屬腸道的正常菌群,是引起醫(yī)源感染的重要條件致病菌[5],廣泛分布于人和動物的體表、黏膜及消化道,其產生的毒素可引起中毒,是一種常見的條件性致病菌[6];弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter)屬腸桿菌科枸櫞酸桿菌屬,有11個基因種。其中,弗氏檸檬酸桿菌、布氏檸檬酸桿菌和科氏檸檬酸桿菌常與人和動物的感染有關[7],近年來,該菌引起魚、蝦、鱉、蟹等水產動物感染發(fā)病的報道較多[8]。另外,小鼠、爬行動物及鳥類也會發(fā)生檸檬酸桿菌感染,并可通過糞便將病原菌排出體外。感染其他動物,嚴重者死亡。大腸桿菌O83∶H1(Eheco83∶h1)是一種黏附性侵襲性大腸桿菌,主要定植并黏附于腸上皮細胞,引起腸道的某些慢性炎癥,腹瀉等癥狀。

1 材料與方法

1.1 樣品來源2017年9月云南省宜良某野生動物收容中心收容了5只馬來穿山甲,都有嚴重的腹瀉癥狀,糞便呈黑綠色、且?guī)в忻撀涞哪c黏膜,其中2只并發(fā)打噴嚏及呼吸困難等癥狀。本試驗無菌采集5只穿山甲的糞便棉試子及2份有呼吸道癥狀的鼻腔棉拭子。

1.2 主要試劑普通肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、血液營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、生化試劑盒購自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司、DNA 提取試劑盒購自云南晨綠生物科技有限公司、藥敏片購自杭州濱和微生物試劑有限公司、核酸染色劑購自大連寶生物有限公司。

1.3 試驗動物昆明SPF 小鼠,6 周齡,體質量18～25 g,購買自昆明醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.4 細菌分離鑒定采用三角區(qū)平板劃線法將細菌接種于普通瓊脂培養(yǎng)基和血液營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h。挑選出不同形態(tài)大小的菌落,分別混與裝有2 000～3 000μL肉湯的試管內培養(yǎng)。該試驗共挑選出5種形態(tài)不同的菌落,其中2種分離自鼻腔棉試子,標記為?-1、?-2;另外3種分離自糞便棉試子,標記為?-3、?-4、?-5。

1.5 生化試驗將純培養(yǎng)株菌分別接種于生化管內。觀察并記錄生化結果,參考《伯杰細菌鑒定手冊》進行比對。

1.6 菌株的16S rDNA PCR 鑒定參照所購試劑盒標準提取5株菌的核酸,將其作為PCR 模板。采用細菌16S r DNA 的通用引物(27 F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1 492 R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′),對 菌 株 的16S r DNA 進行PCR 擴增、瓊脂糖凝膠電泳、測序鑒定,測序結果在NCBI上進行比對,結果表明?-2與?-5為同一種菌,選擇?-2進行接下來的試驗。并獲取與分離菌株16S r DNA 序列最相近的序列。采用MEGA3.0軟件,鄰接法構建系統(tǒng)進化樹,重復取樣1 000次進行自展值分析[9]。

1.7 藥敏試驗在無菌操作臺內將擴增好的菌液分別吸取200μL注入普通瓊脂培養(yǎng)基內,用無菌三角棒將其涂布均勻,每種菌挑選10種藥敏片按標準紙片瓊脂擴散法(K-B法)對分離的4株細菌進行藥敏試驗[10]。

1.8 動物毒力試驗此次毒力試驗分為4 組,?-1為1組、?-2為2組、?-3為3組、?-4為4組。預試驗每個組分為4小組,每小組4只體質量相近的小鼠且雌雄各半,正式試驗每組分7個小組,每小組6只體質量相近的小鼠且雌雄各半。挑取經純化鑒定的?-1菌液至2 m L的肉湯中,37℃恒溫搖床培養(yǎng)12 h。利用微量分光光度計計算出菌液濃度為2.5×1012CFU/m L,將原菌液100 倍稀釋3 個梯度(2.5×1010,2.5×108,2.5×106CFU/m L)進行預試驗,將原菌液及稀釋3個梯度的菌液分別腹腔注射給1組預試驗的4組小鼠,每只小鼠0.5 m L,24 h觀察小鼠的死亡情況,得出引起動物0%和100%死亡的劑量分別為2.4×106,2.4×1010CFU/m L。正式試驗在預試驗的劑量范圍內5倍稀釋6個梯度,分別為1.20×107,6.00×107,3.00×108,1.50×109,1.25×1010,7.25×1010CFU/m L,將6個梯度的菌液分別注射給1 組正式試驗的6 組小鼠,每只小鼠0.5 m L,另外1組作為對照組每只小鼠腹腔注射0.5 m L生理鹽水,觀察1周內小鼠的死亡情況。以同樣的方法對?-2、?-3、?-4菌液進行預試驗得出?-2、?-3、?-4引起動物0%和100%死亡的劑量分別為7.2×105,7.2×109;8×106,8×1010;3.6×109,3.6×1013CFU/m L。正式試驗同上,在預試驗的劑量范圍內4倍稀釋6個梯度進行人工感染小鼠,觀察1周內小鼠死亡情況(表1)。

表1 梯度稀釋菌液濃度 CFU/m L

1.9 目的菌株的回收與鑒定將死亡小鼠進行解剖,取病變較為明顯的部位進行實驗室細菌分離鑒定培養(yǎng)和測序鑒定。

2 結果

2.1 細菌菌落形態(tài)參照常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊觀察菌株[11]。?-1在普通培養(yǎng)基上培養(yǎng)12～18 h的細菌,生長為灰白色凸起,挑之易拉成絲的菌落;?-2在血平板上有溶血現象;?-3在普通培養(yǎng)基上生長為低突、灰色半透明、邊緣整齊而光滑的菌落;?-4在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長為平滑、乳白色菌落。

2.2 鏡檢結果?-1為革蘭陰性粗短桿菌,單獨、成雙或短列狀排列;?-2為革蘭陰性兩端鈍圓的小桿菌;?-3為革蘭陰性橢圓形短桿菌;?-4為革蘭陰性長桿菌(圖1～4)。

圖1 ?-1鏡檢結果(100×)

圖2 ?-2鏡檢結果(100×)

圖3 ?-3鏡檢結果(100×)

圖4 ?-4鏡檢結果(100×)

2.3 生化試驗結果?-1與葡萄糖、甘露醇、H2S等反應為陽性,與鳥氨酸脫氫酶、甲基紅等反應為陰性;?-2與葡萄糖、H2S、乳糖等反應為陽性,與鳥氨酸脫氫酶、甘露醇等反應為陰性;?-3與葡萄糖、鳥氨酸脫氫酶、甘露醇等反應為陽性,與氧化酶、吲哚等反應為陰性;?-4與氧化酶、吲哚乳糖等反應為陽性,與甲基紅、H2S等反應為陰性(表2)。

表2 生化試驗結果

2.4 16S r DNA 擴增及系統(tǒng)發(fā)育分析通過PCR擴增菌株的16S r DNA 片段,與預期片段一致(圖5)。將?-1、?-2、?-3、?-4的序列分別提交到NCBI的GenBank數據庫,獲得的序列號依次為KF974479.1,HQ259933.1,MF148471.1,NC_017634.1,采 用BLAST 進行比對,得出?-1的序列與肺炎克雷伯菌的相似性最高、?-2與變形桿菌Z2株的相似性最高、?-3與弗氏檸檬酸桿菌的相似性最高、?-4與大腸桿菌O83∶H1的相似性最高,且同源性都在99%;每種菌選擇3～4株相關菌株,以鏈球菌作為外群,構建系統(tǒng)進化樹(圖6)。?-1與肺炎克雷伯菌聚為一簇,?-2與變形桿菌聚一簇,?-3與檸檬酸桿菌聚一簇且與弗氏檸檬酸桿菌最接近,?-4與大腸桿菌聚一簇且與大腸桿菌O83∶H1最接近,由此確定?-1為肺炎克雷伯菌、?-2為變形桿菌、?-3為弗氏檸檬酸桿菌、?-4為大腸桿菌O83∶H1。

2.5 藥敏結果肺炎克雷伯菌和變形桿菌對頭孢三代及鏈霉素的敏感性較高,對喹諾酮類耐藥;大腸桿菌O83∶H1對喹諾酮類及新霉素敏感性好,對慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素耐藥;弗氏檸檬酸桿菌對大觀霉素及頭孢三代敏感性較好,對喹諾酮類和青霉素類耐藥(表3)。

圖5 4株菌株PCR 擴增結果 M.DL2000 DNA Marker;1.?-1;2.?-2;3.?-3;4.?-4

2.6 動物試驗肺炎克雷伯菌人工感染小鼠結果顯示,在感染后8 h,小鼠開始出現精神沉郁、不愿走路、畏寒、喜蜷縮,10 h后出現呼吸困難呈憋喘狀,12 h后出現1只死亡,16 h后出現4只死亡,24 h后1.500×109CFU/m L 及以上組別6只小鼠全部死亡。變形桿菌在感染后8 h小鼠出現背毛粗亂、顫抖扎堆,12 h后出現腹瀉癥狀,16 h后1只小鼠死亡,24 h 后3 只 小 鼠 死 亡,48 h 后2.250×109CFU/m L 及以上組別6只小鼠全部死亡。弗氏檸檬酸桿菌在感染8 h后小鼠出現精神萎靡、采食下降,18 h后出現腹瀉,24 h后1只死亡,36 h后4只死亡,48 h后2.500×1010CFU/m L及以上組別6只小鼠全部死亡。大腸桿菌O83∶H1在感染12 h后小鼠出現精神萎靡、背毛粗亂、扎堆等現象,24 h后出現1死亡,36 h后出現3只死亡,48 h后出現4只死亡,60 h后6.125×1013CFU/m L 組別6只小鼠全部死亡,通過改良寇法:log LD50＝X K-i(∑P-0.5)(X K為最高對數劑量,i為相鄰兩對數劑量的差值,∑P為個劑量組的死亡率之和)計算出肺炎克雷伯菌、變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌及大腸桿菌O83∶H1的LD50 分別為4.37×108,1.15×108,1.29×109,4.15×1012CFU/m L(表4,5)。

圖6 16s r DNA 與相關細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

表3 菌株藥敏試驗結果 mm

2.7 發(fā)病小鼠病理剖檢與細菌分離鑒定剖解死亡小鼠,可見第1組小鼠肺臟、脾臟淤血腫脹、肝臟有壞死灶;第2組小鼠脾臟淤血腫大,腸系膜脫落、腸管變薄、有大量黃色透明的黏液性內容物;第3組小鼠肝臟和脾臟出現壞死;第4組小鼠腸系膜出現一定程度的炎癥且充血。取上述病變組織分別進行細菌的分離培養(yǎng)及測序鑒定,結果與人工感染小鼠所使用的菌液相符。第1組為肺炎克雷伯菌、第2組為變形桿菌、第3組為弗氏檸檬酸桿菌、第4組為大腸桿菌O83∶H1。

3 討論

目前有關馬來穿山甲的報道極少,其腸道細菌分離鑒定未見報道。本次試驗對于了解這4種菌在馬來穿山甲上的致病性表現提供了科學依據。

相關報道表明,肺炎克雷伯菌主要存在于機體的呼吸道及痰液中,導致咳嗽、嘔吐、腹瀉、呼吸困難等癥狀,感染羊表現為眼睛紅腫、咳嗽[13-15,23-24]。此次毒力試驗感染昆明小鼠,表現出畏寒、喜蜷縮、呼吸困難呈憋喘狀,說明該菌是導致馬來穿山甲出現呼吸困難等癥狀的主要致病菌;變形桿菌感染豬導致食欲減少、體溫升高、下痢等癥狀;感染揚子鱷引發(fā)尿酸鹽沉積、腎病變等癥狀;感染水貂引發(fā)氣喘、血沫、下痢等癥狀[16-18]。毒力試驗感染小鼠剖解見腸系膜脫落、腸管變薄有漿液性滲出,說明該菌是引起馬來穿山甲出現腹瀉、腸黏膜脫落等癥狀的主要致病菌;弗氏檸檬酸桿菌是導致人和動物出現腹瀉癥狀的病菌之一。據報道該菌可引發(fā)魚類皮膚潰爛、腐敗,肛門紅腫出血等癥狀,引發(fā)獼猴、仔豬、東北虎腹瀉,導致小寒尾羊急性敗血癥死亡,因為較強的菌株可穿過腸黏膜到達全身各個組織器官,導致機體廣泛出血至敗血癥死亡[19-21]。該菌感染小鼠臨床癥狀為精神萎靡、采食下降,剖解見脾臟、肝臟出現不同程度的壞死;大腸桿菌O83∶H1 主要定植并黏附于腸上皮細胞,引起腸道的某些慢性炎癥,腹瀉等癥狀。動物毒力試驗剖解小鼠見腸系膜充血伴有炎癥。

表4 肺炎克雷伯菌和變形桿菌人工感染小鼠死亡情況

表5 弗氏檸檬酸桿菌和大腸桿菌人工感染小鼠死亡情況

動物毒力試驗結果表明,在此次細菌感染中,變形桿菌的致病性最強,其次是肺炎克雷伯菌、弗氏檸檬酸桿菌,大腸桿菌O83∶H1 的毒力相對要弱一些,且變形桿菌是導致馬來穿山甲出現腹瀉、腸黏膜脫落等癥狀的主要致病菌,肺炎克雷伯菌是導致馬來穿山甲出現呼吸困難等癥狀的主要致病菌,弗氏檸檬酸桿菌和大腸桿菌O83∶H1是導致馬來穿山甲出現腹瀉癥狀的主要致病菌,在2種菌的混合感染下穿山甲體內正常菌群失調,引起呼吸道和消化道的臨床癥狀。

藥敏結果,肺炎克雷伯菌和變形桿菌對頭孢三代及鏈霉素的敏感性高,與楊小敏等[22]對肺炎克雷伯菌的藥敏試驗結果一致,與鄧晶榮[25]對變形桿菌的藥敏試驗結果相比敏感性更高。弗氏檸檬酸桿菌對大觀霉素及頭孢三代敏感性較好,對喹諾酮類和青霉素類耐藥,與ZONG 等[26]對弗氏檸檬酸桿菌的藥敏試驗結果相比敏感性低。大腸桿菌O83∶H1對喹諾酮類及新霉素敏感性好,目前未見有相關藥敏報道。綜上所述,本次藥敏試驗結果敏感性比報道中的高,推斷可能是因為在馬來穿山甲之前的生活中用藥少或在發(fā)病時還未及時用藥就被我們救助,機體未對抗生素產生廣泛的耐藥性。