張石磊,包佳鷺,史萬(wàn)玉?,鐘秀會(huì)? (1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,河北 保定071001;.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)學(xué)院,河北 保定071001)

雙酚A(bisphenol A,BPA)是苯酚和丙酮的重要衍生物,多用于生產(chǎn)聚碳酸酯、環(huán)氧樹(shù)脂、聚砜樹(shù)脂、聚苯醚樹(shù)脂、不飽和聚酯樹(shù)脂等高分子材料。還可用于生產(chǎn)增塑劑、阻燃劑、抗氧劑、熱穩(wěn)劑、橡膠防老劑、農(nóng)藥、涂料等精細(xì)化工產(chǎn)品中[1]。據(jù)估計(jì),全世界每年BPA 生產(chǎn)量在680 萬(wàn)t以上[2],而中國(guó)2016年BPA 的年生產(chǎn)量就達(dá)到141 萬(wàn)t[1]。BPA是普遍存在的一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物,具有擬雌激素、拮抗雄激素的作用[3]。研究發(fā)現(xiàn),一定濃度的BPA 暴露會(huì)嚴(yán)重影響動(dòng)物生殖系統(tǒng)的發(fā)育和功能[4-6]。BPA 在環(huán)境污水,河流中均有存在[7-8],牛奶[9],輸液用膜制袋中[10],桶裝水的水桶中[11],易拉罐啤酒[12]和塑料桶裝白酒中[13]均有BPA 檢出。而且,BPA 也存在于人體體液樣本如血液、尿液、唾液、羊水和母乳中[14-15]。有資料指出,室內(nèi)灰塵中便含有BPA,辦公室內(nèi)BPA 的含量是居室的5～10倍[16]?？梢?jiàn)BPA 幾乎無(wú)處不在。

關(guān)于BPA 對(duì)人和動(dòng)物生殖危害性的研究已有報(bào)道[3,17-18]。已知BPA 可引起雄性動(dòng)物睪丸萎縮[19],生殖細(xì)胞核DNA 斷裂[20],導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[21]。鄭劼[22]報(bào)告,BPA 暴露降低雄性小鼠精子數(shù)量和活性,增加精子的畸形率。雄激素受體(androgen receptor,AR)作為調(diào)節(jié)基因表達(dá)的DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子[23],對(duì)于維持雄性動(dòng)物的性表型和促進(jìn)其發(fā)育發(fā)揮重要作用[24],而B(niǎo)PA 可以通過(guò)干擾AR 而擾亂雄性動(dòng)物睪丸發(fā)育和正常功能[25]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序常應(yīng)用于差異基因篩選及功能注釋[26],目前研究轉(zhuǎn)錄組的方法主要基于測(cè)序技術(shù)[27]。與傳統(tǒng)的分析技術(shù)相比,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析可以獲得更全面的數(shù)據(jù)[28]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)常通過(guò)基因功能數(shù)據(jù)庫(kù)(gene ontology,GO)[29]和基因代謝通路數(shù)據(jù)庫(kù)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)進(jìn)行注釋分析[30]。本研究令雌鼠孕期和哺乳期飲水染毒BPA,并在子代雄鼠21日齡斷奶至45日齡性成熟[31]一直飲水染毒BPA,檢測(cè)睪丸組織學(xué)和雄激素受體變化,精子質(zhì)量,以及睪丸細(xì)胞中DNA 損傷等指標(biāo),以分析胚胎期至雄鼠性成熟期長(zhǎng)期暴露BPA 對(duì)睪丸發(fā)育的影響,為進(jìn)一步研究環(huán)境激素BPA 損傷雄性生殖提供基礎(chǔ)資料,為環(huán)境安全研究提供有價(jià)值的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組與BPA處理8周齡SPF 級(jí)昆明小鼠雌性200只,雄性100只,體質(zhì)量25～30 g,購(gòu)于北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SCXK(京)2016-0002。經(jīng)環(huán)境適應(yīng)1周,雌雄2∶1合籠過(guò)夜,次日早晨檢出陰栓為孕0 d。將孕0 d母鼠隨機(jī)分為7組,每組20 只。A 組為空白對(duì)照組,B 組為0.05 mg·kg－1·d－1BPA處理組,C組為0.50 mg·kg－1·d－1BPA 組,D 組為5.00 mg·kg－1·d－1BPA 組,E 組 為10.00 mg·kg－1·d－1BPA 組,F 組為20.00 mg·kg－1·d－1BPA組,G組為50.00 mg·kg－1·d－1BPA 組。自F0母鼠孕0 d起至哺乳期結(jié)束,母鼠飲水染毒BPA,仔鼠21 日齡斷奶后繼續(xù)飲水染毒BPA 至45 日齡性成熟期,共染毒63 d。取BPA(純度≥99%,Sigma,美國(guó))配成50.00 g/L的BPA 母液,置于4℃保存,使用時(shí)按所需濃度用自來(lái)水配稀釋,加入防漏水的專用小鼠飲水瓶以確保飲水量的準(zhǔn)確。每3 d稱量小鼠體質(zhì)量,測(cè)量飲水量,準(zhǔn)確計(jì)算飲水給藥(BPA)的劑量。

1.2 樣品采集與檢測(cè)分析在子代雄鼠性成熟時(shí)(45日齡)眼眶靜脈叢采血,脫頸處死。分離血清樣品置于－80℃保存。摘取睪丸,稱重,按雙側(cè)睪丸質(zhì)量(mg)占體質(zhì)量(g)的百分比計(jì)算睪丸器官指數(shù)。摘取新鮮附睪100 mg置于400μL 生理鹽水(37℃恒溫)中剪碎并輕輕震蕩,得到精子懸濁液,用于檢測(cè)精子活力、精子密度和畸形率。取部分睪丸樣品勻漿后用于BPA 含量測(cè)定。使用小鼠BPA檢測(cè)試劑盒(上海潤(rùn)裕生物科技有限公司,Lot No,RY-12919),按照說(shuō)明書(shū)操作,檢測(cè)子代雄鼠血清及睪丸勻漿中BPA 的含量;一部分睪丸樣品置于4%多聚甲醛固定,制備石蠟切片。一部分切片進(jìn)行H&E染色,觀察不同劑量BPA 對(duì)睪丸組織的病理?yè)p傷情況。一部分切片用于檢測(cè)小鼠睪丸組織AR表達(dá)變化(一抗為兔抗鼠 AR 單克隆抗體,ab133273,Abcam 公司,美國(guó);二抗為羊抗兔多克隆抗體,SV0001,博士德生物技術(shù)有限公司,中國(guó));取部分新鮮睪丸立刻進(jìn)行單細(xì)胞凝膠電泳(彗星試驗(yàn)),檢測(cè)睪丸DNA 損傷。將睪丸組織剪碎后加入RMPI 1640培養(yǎng)基,震蕩得到細(xì)胞懸液,細(xì)胞懸液加入低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液中,混勻后涂抹至載玻片上進(jìn)行電泳,電泳結(jié)束后使用溴化乙錠染色,通過(guò)圖像分析系統(tǒng)CASP量化DNA 損傷[32];取部分睪丸樣品置于液氮冷凍保存,用于提取總RNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,總RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega。使用Illumina測(cè)序平臺(tái)Illumina HiSeq,對(duì)空白對(duì)照組和50.00 mg·kg－1·d－1組小鼠睪丸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)得到差異基因后將差異基因?qū)隚O 數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋分析,對(duì)差異基因進(jìn)行熒光定量PCR 驗(yàn)證。熒光定量PCR 采用兩步法,體系為20μL,其中熒光定量PCR Mix 10μL,上、下游引物各1μL,引物序列如表1所示,cDNA 模板2μL,dd H2O 6μL。擴(kuò)增程序?yàn)?95℃600 s;95℃30 s,60℃10 s,45個(gè)循環(huán)。熔解曲線程序?yàn)?95.0℃10 s,65.0℃60 s然后以0.2℃/s的速度升溫至97.0℃,最后37.0℃30 s冷卻。

表1 熒光定量PCR 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用Image J對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行灰度值分析,使用CASP 軟件對(duì)彗星試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入SPSS 19.0 軟件進(jìn)行分析,結(jié)果以±s x表示。數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和卡方檢驗(yàn)(χ2)與空白對(duì)照進(jìn)行比較,P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 血清和睪丸組織BPA 含量根據(jù)試劑盒所含的標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸系數(shù)R2和回歸方程,當(dāng)R2≥0.920 0時(shí),測(cè)量結(jié)果可信。本次試驗(yàn)中R2＝0.998 5。測(cè)定結(jié)果顯示,BPA 暴露劑量不低于10.00 mg·kg－1·d－1時(shí),子代雄鼠血清BPA含量顯著高于(P＜0.05)空白對(duì)照組,BPA 暴露劑量不低于20.00 mg·kg－1·d－1時(shí),子代雄鼠睪丸組織BPA含量顯著高于(P＜0.05)空白對(duì)照組(表2)。

表2 子代雄鼠血清和睪丸中BPA 的含量

2.2 睪丸器官指數(shù)從睪丸器官指數(shù)的結(jié)果可以看出,G 組睪丸器官指數(shù)與A 組相比顯著增加(P＜0.05),即BPA 暴露劑量在50.00 mg·kg－1·d－1時(shí),會(huì)導(dǎo)致子代雄鼠睪丸指數(shù)顯著增大(表3)。

表3 睪丸器官指數(shù)

2.3 睪丸組織病理學(xué)變化H&E染色結(jié)果可以看出(圖1),A 組睪丸生精小管幾乎無(wú)空隙。而B(niǎo)PA暴露各組生精小管均不同程度地出現(xiàn)裂隙或空腔。當(dāng)BPA 暴露劑量在10.00 mg·kg－1·d－1以上時(shí),會(huì)導(dǎo)致睪丸生精小管萎縮,小管間隙明顯變大(圖1E)。

圖1 睪丸組織病理學(xué)變化 A.空白對(duì)照組;B.0.05 mg·kg－1·d－1組;C.0.50 mg·kg－1·d－1組;D.5.00 mg·kg－1·d－1組;E.10.00 mg·kg－1·d－1組;F.20.00 mg·kg－1·d－1組;G.50.00 mg·kg－1·d－1組;箭頭1所指位置為生精小管間隙;箭頭2所指位置為生精小管空腔。圖中標(biāo)尺長(zhǎng)度為50μm

2.4 雄鼠精子指標(biāo)BPA 暴露0.05 mg·kg－1·d－1劑量組小鼠的精子活力和精子密度與空白對(duì)照組無(wú)顯著性差異,BPA 在0.50 mg·kg－1·d－1以上劑量組的精子活力均顯著減少,精子密度亦顯著減少。各BPA暴露組精子畸形率均顯著大于空白對(duì)照組(圖2,表4)。

2.5 睪丸生殖細(xì)胞DNA 損傷結(jié)果結(jié)果可見(jiàn)C～G 組睪丸生殖細(xì)胞損傷顯著大于空白對(duì)照組(P＜0.05),這 表 明BPA 暴 露 劑 量 為0.50,5.00,10.00,20.00,50.00 mg·kg－1·d－1時(shí),子代小鼠睪丸生殖細(xì)胞損傷顯著大于空白對(duì)照組(圖3,表5)。

2.6 睪丸AR 表達(dá)變化由免疫組化結(jié)果可以看出AR 主要表達(dá)于睪丸間質(zhì)細(xì)胞(圖4箭頭所指)。B、C、D、E、F 和G 組AR 表 達(dá) 量 顯 著 低 于A 組(P＜0.05),即BPA 暴露劑量在大于等于0.05 mg·kg－1·d－1即可導(dǎo)致子代雄鼠睪丸AR 表達(dá)量顯著減少(圖4,表6)。

2.7 睪丸基因表達(dá)變化

2.7.1 睪丸顯著性差異表達(dá)基因 將BPA 50.00 mg·kg－1·d－1組和空白對(duì)照組2組的子代雄鼠睪丸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較,結(jié)果顯示,雌鼠染毒BPA,其子代雄鼠相較于空白對(duì)照組共有28個(gè)顯著性差異表達(dá)基因,其中16 個(gè)基因上調(diào),12 個(gè)基因下調(diào)(圖5)。

圖2 雄鼠附睪精子伊紅染色 A.空白對(duì)照組;B.0.05 mg·kg－1·d－1組;C.0.50 mg·kg－1·d－1組;D.5.00 mg·kg－1·d－1組;E.10.00 mg·kg－1·d－1組;F.20.00 mg·kg－1·d－1組;G.50.00 mg·kg－1·d－1組。箭頭所指為精子

表4 精子活力指標(biāo)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖3 睪丸中生殖細(xì)胞核DNA 損傷結(jié)果 A.空白對(duì)照組;B.0.05 mg·kg－1·d－1組;C.0.50 mg·kg－1·d－1組;D.5.00 mg·kg－1·d－1組;E.10.00 mg·kg－1·d－1組;F.20.00 mg·kg－1·d－1組;G.50.00 mg·kg－1·d－1組;箭頭所指為熒光染色的生殖細(xì)胞的DNA

2.7.2 BPA 影響睪丸顯著性差異表達(dá)基因功能的注釋 差異基因功能按照生物進(jìn)程、細(xì)胞組分和分子功能3個(gè)基因功能分類。結(jié)果顯示BPA 暴露后雄鼠睪丸差異基因均與生物合成代謝過(guò)程有關(guān)(圖6)。

2.7.3 差異基因KEGG 富集 差異基因KEGG 富集結(jié)果顯示剪切體代謝通路顯著富集。其中剪切體U1亞基蛋白質(zhì)C合成基因Snrpc和剪切體通用載體組件編碼基因Hnrnpu均顯著下調(diào)(圖7)。

2.7.4 熒光定量PCR 驗(yàn)證 熒光定量PCR 檢測(cè)了全部7組睪丸組織Snrpc和Hnrnpu表達(dá)水平,并以β-actin為內(nèi)參基因校正不同組織RNA 得率的誤差。結(jié)果顯示Snrpc和Hnrnpu隨BPA 染毒劑量增加而減少(圖8),與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致,但從熒光定量PCR 結(jié)果我們可以發(fā)現(xiàn)Hnrnpu對(duì)BPA 更加敏感,在BPA 染毒劑量0.50 mg·kg－1·d－1以上時(shí),Hnrnpu表達(dá)量減少為空白對(duì)照的1/2以下,而Snrpc在BPA 染毒劑量20.00 mg·kg－1·d－1以上時(shí)表達(dá)量減少為空白對(duì)照的1/2以下。

表5 睪丸生殖細(xì)胞DNA 損傷結(jié)果

3 討論

BPA 通常被認(rèn)為是環(huán)境雌激素,但對(duì)雄性生殖亦能產(chǎn)生影響[33]。小鼠雄性性成熟時(shí)間為40～60 d,平均45 d[31]。為了探究雄鼠連續(xù)接觸BPA對(duì)其發(fā)育的影響,本試驗(yàn)自F0雌鼠孕0 d起至哺乳期結(jié)束,雌鼠飲水染毒BPA,仔鼠21 d斷奶后以雌鼠染毒劑量飲水染毒子代雄鼠至45 d性成熟期,共染毒63 d,探究BPA 對(duì)雄鼠生殖發(fā)育的影響。在胚胎發(fā)育時(shí)期BPA 可穿過(guò)胎盤(pán)影響胎兒發(fā)育[34],BPA 亦可穿過(guò)血睪屏障,影響睪丸發(fā)育[35]。BPA在組織中的含量與暴露劑量成正比[36],本研究發(fā)現(xiàn)較高劑量BPA(≥20.00 mg·kg－1·d－1)可使45 d雄鼠睪丸BPA含量顯著升高(表1),這證明BPA 可通過(guò)血睪屏障。

圖4 睪丸AR 表達(dá)量 A.空白對(duì)照組;B.0.05 mg·kg－1·d－1組;C.0.50 mg·kg－1·d－1組;D.5.00 mg·kg－1·d－1組;E.10.00 mg·kg－1·d－1組;F.20.00 mg·kg－1·d－1組;G.50.00 mg·kg－1·d－1組;箭頭所指為AR 陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞

表6 睪丸AR 表達(dá)量

睪丸器官指數(shù)和石蠟切片H&E染色的結(jié)果顯示在雄鼠的性成熟期,染毒BPA 劑量在50.00 mg·kg－1·d－1時(shí)可導(dǎo)致睪丸器官指數(shù)顯著增大(P＜0.05),而10.00 mg·kg－1·d－1以 上 劑 量 的BPA導(dǎo)致睪丸生精小管間隙變大,這表明只有較高劑量的BPA 才會(huì)引起睪丸組織的病理變化。精子活力指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果顯示0.50 mg·kg－1·d－1以上劑量BPA 可使得精子密度、精子活率顯著下降(P＜0.05),0.05 mg·kg－1·d－1以上劑量BPA 可使精子畸形率顯著上升(P＜0.05),這意味著極低的BPA 接觸劑量即可導(dǎo)致精子質(zhì)量下降。韓茂之等[37]研究了哺乳期染毒BPA 對(duì)后代成年小鼠睪丸發(fā)育和精子生成的影響,證明了BPA 對(duì)雄鼠睪丸發(fā)育具有明顯影響,會(huì)導(dǎo)致精子畸形率增加,曲細(xì)精管直徑減小,生精上皮變薄,與本研究結(jié)果一致。有研究顯示BPA 可導(dǎo)致睪丸細(xì)胞生殖凋亡[38],而彗星試驗(yàn)可以靈敏的檢測(cè)細(xì)胞核DNA 的損傷[39]。本研究中使用彗星試驗(yàn)的方法檢測(cè)了不同劑量染毒BPA 對(duì)后代小鼠睪丸中生殖細(xì)胞的影響,結(jié)果顯示0.50 mg·kg－1·d－1以上劑量染毒會(huì)導(dǎo)致生殖細(xì)胞核DNA 的損傷顯著大于空白對(duì)照(P＜0.05),與精子活力的測(cè)定結(jié)果一致。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出極低劑量BPA 即可引起精子異常,而較高劑量BPA才能引發(fā)睪丸發(fā)育異常,這也說(shuō)明了精子發(fā)生的異常并非由睪丸發(fā)育異常引起的,而是BPA 直接引起的。同時(shí)也證明了低劑量BPA 的毒性是確實(shí)存在的,最新的研究也顯示了低劑量的BPA 暴露影響精子發(fā)生[40]。

圖5 差異表達(dá)基因火山圖 有顯著性差異表達(dá)的基因用紅色點(diǎn)(上調(diào))和藍(lán)色點(diǎn)(下調(diào))表示,無(wú)顯著性差異表達(dá)的基因用藍(lán)色點(diǎn)表示

圖6 差異基因GO 富集

圖7 差異基因KEGG 富集

圖8 Snrpc 和Hnrnpu 基因相對(duì)表達(dá)量 A.空白對(duì)照組;B.0.05 mg·kg－1·d－1組;C.0.50 mg·kg－1·d－1組;D.5.00 mg·kg－1·d－1 組;E.10.00 mg·kg－1·d－1組;F.20.00 mg·kg－1·d－1組;G.50.00 mg·kg－1·d－1組

AR 通過(guò)與睪酮結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄因子功能,促進(jìn)雄性性分化和成熟[41],BPA 可以阻止睪酮與AR 結(jié)合,抑制AR 轉(zhuǎn)錄活性[42]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)染毒BPA 0.05 mg·kg－1·d－1以上,睪丸AR 表達(dá)量顯著減少。這證明BPA 在低劑量(≥0.05 mg·kg－1·d－1)就可以通過(guò)抑制睪丸AR 表達(dá)。

低劑量染毒BPA一般指經(jīng)口染毒劑量在0.05～50.00 mg·kg－1·d－1之間[43]。為了探究持續(xù)染毒BPA 對(duì)雄鼠睪丸發(fā)育的影響機(jī)制,本試驗(yàn)對(duì)空白對(duì)照組和50.00 mg·kg－1·d－1BPA 組子代睪丸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,結(jié)果顯示子代雄鼠睪丸共有28個(gè)顯著性差異表達(dá)基因,其中16個(gè)基因上調(diào),12個(gè)基因下調(diào)。我們將差異基因與GO 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),發(fā)現(xiàn)差異基因富集于生物合成代謝過(guò)程。差異基因與KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),剪切體代謝通路顯著富集。剪接體是真核生物m RNA 前體去內(nèi)含子轉(zhuǎn)變成熟工具,由5個(gè)亞基(U1,U2,U4,U5和U6)和150多種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白復(fù)合物(sn RNP)[44]。本試驗(yàn)中剪切體U1亞基蛋白質(zhì)C合成基因Snrpc和剪切體通用載體組件編碼基因Hnrnpu均顯著下調(diào)。剪接的最初步驟是將U1 snRNP 及通用蛋白組件與未成熟的m RNA 的5′剪接端結(jié)合[45],Snrpc和Hnrnpu的顯著下調(diào)使得m RNA 的轉(zhuǎn)錄后修飾第1步即無(wú)法進(jìn)行,剪切體功能受阻可能是BPA 影響睪丸發(fā)育的重要原因。熒光定量PCR 結(jié)果顯示持續(xù)染毒BPA 可降低子代睪丸Snrpc和Hnrnpu的表達(dá)量,且Hnrnpu對(duì)BPA 的敏感性大于Snrpc。