張宇辰,李文杰,袁建彬,臧樹成,王立鵬,朗立敏,陳 妍,楊煥民 (黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,

黑龍江大慶163319)

籽鵝(zi-goose)是我國(guó)北方特有的家禽品種,其主要分布于我國(guó)黑龍江省松嫩平原,該品種能在寒冷和粗放的飼養(yǎng)條件下,仍能保持優(yōu)良的產(chǎn)蛋性能。在禽類品種改良中,為理想的雜交母本品種。而在實(shí)際生產(chǎn)中,發(fā)現(xiàn)籽鵝出生時(shí)在其頭頂有一簇明顯的絨羽,該性狀類似于水禽中的羽冠性狀。但在觀測(cè)中,籽鵝該性狀較前者從形態(tài)、大小、絨羽密度上略有差異,在這里暫定為羽束性狀。該性狀在公、母鵝個(gè)體中均有,隨著個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育逐漸濃密而明顯,通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn),該性狀具有3種表型,片狀羽束、簇狀羽束、球狀羽束,在相關(guān)研究鵝的文獻(xiàn)中并未見(jiàn)報(bào)道。同時(shí),在禽類相關(guān)頭部表型修飾性狀中,如雞冠、纓頭等性狀與家禽社會(huì)等級(jí)、配偶選擇、產(chǎn)蛋性能等均有著關(guān)聯(lián)性[1]。因此,通過(guò)對(duì)鵝羽束性狀遺傳規(guī)律的研究,也為后續(xù)鵝類在品種改良、性狀選育等方面研究奠定基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)調(diào)控禽類頭部表型性狀的主效基因(eomes、hoxc8、sox5、mnr2)[2-5],以及引入可能在同一信號(hào)通路中的相關(guān)基因(wnt5a、bmp2、gh)[6-9],分析各時(shí)期肝臟組織中基因相對(duì)表達(dá)量,并結(jié)合禽類常見(jiàn)生物信息學(xué)分析方法,推測(cè)其對(duì)羽束性狀起到的相關(guān)作用,同時(shí)進(jìn)行相關(guān)機(jī)制探討。從而進(jìn)一步拓寬禽類表型修飾性狀與調(diào)控基因的關(guān)聯(lián)性,為后續(xù)禽類基因性狀研究、分子遺傳育種等提供理論基礎(chǔ)[10-11]。

1 材料與方法

1.1 資源群體構(gòu)建本試驗(yàn)選取同家系同世代1日齡籽鵝作為試驗(yàn)樣本,構(gòu)建2個(gè)資源群體,每群體60只。1號(hào)群體均為有羽束公雛,簡(jiǎn)稱為有羽束鵝群(crest population,C);2號(hào)群體均為無(wú)羽束公雛,簡(jiǎn)稱無(wú)羽束鵝群(non-crest,NC),將2個(gè)資源群體于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)鵝業(yè)研究所科研基地進(jìn)行試驗(yàn)。同時(shí),在試驗(yàn)基地隨機(jī)選取11月齡有羽束公鵝(crest)和三花公鵝(non-crest)各15只。(三花鵝為我國(guó)南方品種,該鵝頭部不具有羽束類型的表型修飾性狀。)同舍分欄飼養(yǎng),自由采食、飲水,雛鵝飼養(yǎng)周期為21 d,11月齡鵝飼養(yǎng)周期為7 d。

1.2 組織樣本采集經(jīng)上述條件進(jìn)行試驗(yàn)后,在1,7,14,21日齡4個(gè)時(shí)期,在2個(gè)資源群體中,每次分別隨機(jī)選取3 只雛鵝為試驗(yàn)樣本,樣本總量為24只。在11月齡有羽束鵝和三花鵝2個(gè)群體中,分別隨機(jī)選取3只公鵝為試驗(yàn)樣本。進(jìn)行放血屠宰,迅速采取肝臟組織,并用DEPC 處理水洗凈,放于液氮罐中凍存過(guò)夜,然后置于－80℃待測(cè)。

1.3 組織總RNA 提取將各時(shí)期肝臟組織,分別放入球磨儀(Retsch MM 400)型中研磨,然后加入TRIzol(Ambion公司)從組織中提取總RNA,并用核酸蛋白分析儀(NanoDrop 2000型)對(duì)所提RNA進(jìn)行濃度測(cè)定,并保證各樣本RNA 提取后D值(260/280 nm)在1.8～2.0之間。

1.4 cDNA 合成應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ta KaRa公司),結(jié)合PCR 擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司9700型)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,取5×gDNA Eraser Buffer 2.0μL,g DNA Eraser 1.0μL,樣本RNA 加量按1/總RNA 相對(duì)濃度(mg/L)添加,然后用RNase Free d H2O 補(bǔ)齊10.0μL體系,隨后置于PCR 擴(kuò)增儀中,反應(yīng)條件為42℃,2 min。再加入5×PrimeScript Buffer 4.0μL,PrimeScript RT Enzyme MixⅠ1.0μL,RT Primer Mix 1.0μL,RNA Free d H2O 4.0μL,組成20.0μL體系。反應(yīng)條件為37℃,15 min;85℃,4℃循環(huán)保存。

1.5 q RT-PCR應(yīng)用Primer Premier 5.0 軟件,結(jié)合NCBI 網(wǎng)站中GenBank 系統(tǒng),將本試驗(yàn)鵝的sox5、eomes、hoxc8、wnt5a、bmp2、gh基 因CDS區(qū)序列在線下載。而鵝的mnr2基因序列在NCBI網(wǎng)站中并沒(méi)有發(fā)布,則本試驗(yàn)以雞的mnr2基因CDS區(qū)作為序列模板,進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。設(shè)計(jì)引物交由上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成,引物序列見(jiàn)表1。通過(guò)Real-time PCR 儀(Bio-rad CFX96型)進(jìn)行基因表達(dá)量檢測(cè),應(yīng)用25 μL 反應(yīng)體系,其中SYBR?Premix ExTaqⅡ12.5μL,d H2O 9.5μL,模板cDNA 1.0μL Forward Primer 1.0μL,Reverse Primer 1.0μL。以β-actin作為內(nèi)參基因,將有羽束鵝群和無(wú)羽束鵝群分別設(shè)為2組,分別是C、NC組,每個(gè)樣本2個(gè)重復(fù)。同時(shí),設(shè)2個(gè)空白重復(fù),模板為1.0μL d H2O,其他條件不變,排除試驗(yàn)d H2O 污染現(xiàn)象。

表1 候選基因及內(nèi)參基因引物序列

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及生物信息學(xué)分析應(yīng)用CFX96自帶分析軟件及生物學(xué)分析方法計(jì)算2－△△Ct值,采用SPSS19.0軟件的t檢驗(yàn)的方法,對(duì)樣本的相對(duì)表達(dá)量顯著性進(jìn)行分析(P＜0.05為差異顯著,P＜0.01為差異極顯著),同時(shí)結(jié)合Graphpad Prism7進(jìn)行作圖直觀分析?；诤蜻x基因各時(shí)期在肝臟組織中相對(duì)表達(dá)量,結(jié)合Multiexperiment Viewer軟件對(duì)候選基因在各時(shí)期肝臟組織中表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析,并繪制聚類熱圖,進(jìn)行基因關(guān)聯(lián)性分析。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR分析結(jié)果

2.1.1 雛鵝期在肝臟中基因不同時(shí)期相對(duì)表達(dá)量

如圖1所示,圖1A 為eomes基因在肝臟組織中1,7,14,21日齡C、NC 組相對(duì)表達(dá)量,各時(shí)期2個(gè)組相對(duì)表達(dá)量均不顯著(P＞0.05),并且各組相對(duì)表達(dá)量成不規(guī)律變化趨勢(shì);圖1B 為sox5基因在肝臟組織中1,7,14,21日齡C、NC 組相對(duì)表達(dá)量,在1日齡時(shí),肝臟組織中C與NC 組sox5相對(duì)表達(dá)量差異極顯著,P值為0.001 7(P＜0.01),而在其他時(shí)期差異并不顯著(P＞0.05),但在各時(shí)期sox5基因相對(duì)表達(dá)量C 組均高于NC 組。圖1C 為mnr2基因在肝臟組織中相對(duì)表達(dá)量分析,各時(shí)期C、NC 組相對(duì)表達(dá)量均無(wú)顯著性差異,并且C、NC 組各時(shí)期相對(duì)表達(dá)量呈無(wú)規(guī)律變化。圖1D 為wnt5a基因在肝臟組織中1,7,14,21日齡C、NC 組相對(duì)表達(dá)量,在1日齡時(shí),肝臟組織中C 與NC 組wnt5a基因相對(duì)表達(dá)量差異極顯著(P＜0.01),而其他時(shí)期差異并不顯著(P＞0.05),在7,14日齡時(shí)C 組相對(duì)表達(dá)量均高于NC組,而在21日齡時(shí)C組相對(duì)表達(dá)量低于NC組,差異不顯著。同時(shí),C組wnt5a基因該時(shí)期相對(duì)表達(dá)量均低于其1,7,14日齡時(shí)期。圖1E為bmp2基因在肝臟組織中1,7,14,21日齡C、NC 組相對(duì)表達(dá)量,2個(gè)組在各時(shí)期均無(wú)顯著性差異(P＞0.05),但在1,7,14日齡時(shí)C 組相對(duì)表達(dá)量均高于NC組,而在21日齡時(shí)C 組表達(dá)量低于NC 組,同時(shí)C組bmp2基因該時(shí)期相對(duì)表達(dá)量均低于其1,7,14日齡時(shí)期。圖1F為gh基因在肝臟組織中1,7,14,21日齡C、NC組相對(duì)表達(dá)量,2個(gè)組在各時(shí)期均無(wú)顯著性差異(P＞0.05),變化趨勢(shì)無(wú)規(guī)律。經(jīng)試驗(yàn)分析,hoxc8基因在肝臟中未表達(dá)。

2.1.2 11月齡籽鵝、三花鵝在肝臟組織中基因相對(duì)表達(dá)量 如圖2所示,A～F圖分別為eomes、sox5、wnt5a、bmp2、mnr2、gh在11 月齡籽鵝、三花 鵝肝臟組織中基因相對(duì)表達(dá)量,sox5、wnt5a、bmp2基因在肝臟組中相對(duì)表達(dá)量籽鵝高于三花鵝,差異極顯著(P＜0.01)。hoxc8基因在籽鵝、三花鵝肝臟組織中未表達(dá)。eomes、mnr2、gh基因在籽鵝、三花鵝肝臟組織中均有表達(dá),mnr2基因相對(duì)表達(dá)量籽鵝高于三花鵝,差異不顯著(P＞0.05)。eomes、gh基因相對(duì)表達(dá)量三花鵝高于籽鵝,均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

圖1 籽鵝肝臟中不同時(shí)期基因相對(duì)表達(dá)量 A.eomes 在肝臟中不同時(shí)期相對(duì)表達(dá)量;B.sox 5在肝臟中不同時(shí)期相對(duì)表達(dá)量;C.mnr 2在肝臟中不同時(shí)期相對(duì)表達(dá)量;D.wnt 5a在肝臟中不同時(shí)期相對(duì)表達(dá)量;E.bmp 2在肝臟中不同時(shí)期相對(duì)表達(dá)量;F.gh在肝臟中不同時(shí)期相對(duì)表達(dá)量;?.P＜0.05;??.P＜0.01;???.P＜0.001。下同

2.2 基因表達(dá)數(shù)據(jù)的聚類分析結(jié)果如圖3所示,圖3A 為羽束籽鵝肝臟中基因表達(dá)數(shù)據(jù)的聚類熱圖。將基因根據(jù)可能在同信號(hào)通路中分類,可分為2大類,eomes、sox5基因在同一信號(hào)通路中,mnr2、wnt5a、bmp2、gh基因在另一信號(hào)通路中。結(jié)合圖可知,sox5基因在各日齡時(shí)期表達(dá)量較高,bmp2基因在1,7日齡時(shí)期表達(dá)量較高,隨后逐漸降低。其他基因在肝臟組織中各日齡表達(dá)量均低于較sox5基因。圖3B為無(wú)羽束籽鵝肝臟中基因表達(dá)數(shù)據(jù)的聚類熱圖。將基因根據(jù)可能在同信號(hào)通路中分類,可分為2大類,eomes、sox5、wnt5a基因在同一信號(hào)通路中,mnr2、bmp2、gh在另一信號(hào)通路中。結(jié)合圖可知,sox5基因在各日齡時(shí)期表達(dá)量較高,同羽束鵝在肝臟中表達(dá)量結(jié)果相似,bmp2基因在1,7,21日齡時(shí)期表達(dá)量較高,在14 日齡表達(dá)量較低。其他基因在肝臟組織中各日齡表達(dá)量均較低。

3 討論

wnt5a基因禽類在皮膚生長(zhǎng)、毛囊發(fā)育、羽毛形成過(guò)程有著重要的調(diào)控作用[2],而在本研究中,發(fā)現(xiàn)1日齡時(shí)期(圖1D),該基因在肝臟組織中,C組相對(duì)表達(dá)量高于NC組,差異極顯著(P＜0.01)。同時(shí),在成年鵝中,該基因在有羽束籽鵝肝臟組織中相對(duì)表達(dá)量高于三花鵝(non-crest)差異極顯著(P＜0.01)。由此推測(cè)wnt5a基因在籽鵝生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程起到相關(guān)調(diào)控作用[6]。同時(shí),結(jié)合在羽束鵝基因聚類分析中(圖3A),在羽束性狀形成過(guò)程起到一定促進(jìn)作用,該基因可能同sox5 基因在同一信號(hào)通路中[12-13],而該基因的表達(dá),可能對(duì)羽束性狀形成后的表型具有一定修飾作用[14-15]。2014年,李瑤等[16]在鵝胚胎期的表皮研究中發(fā)現(xiàn),wnt5a基因前期主要在表皮和真皮中表達(dá),在毛囊發(fā)育初期短暫推遲毛囊生長(zhǎng),而后期沒(méi)有影響,在wnt5a相對(duì)表達(dá)量較低時(shí),毛囊深快速發(fā)育。由此推斷,在鵝毛囊生長(zhǎng)前期,有羽束鵝該基因表達(dá)量高于無(wú)羽束鵝,此時(shí),短暫抑制頭部毛囊生長(zhǎng)發(fā)育,在表皮及真皮部位相對(duì)表達(dá)量升高,從而影響有羽束鵝頭部皮膚異位表達(dá),隨日齡增加該基因抑制不再明顯,而通過(guò)與sox5基因互作[17-18],使有羽束性狀個(gè)體呈現(xiàn)出不同形態(tài),在無(wú)羽束鵝群中,該基因前期既沒(méi)有抑制毛囊發(fā)育,促使頭部異位表達(dá),同時(shí),在后期該基因促使毛囊深發(fā)育加快,使其頭部羽毛正常生長(zhǎng),沒(méi)有出現(xiàn)異位表達(dá)現(xiàn)象。

圖3 籽鵝在肝臟中各時(shí)期基因表達(dá)聚類分析 A.羽束籽鵝肝臟中各時(shí)期基因表達(dá)聚類分析結(jié)果;B.無(wú)羽束籽鵝肝臟中各時(shí)期基因表達(dá)聚類分析結(jié)果;紅色代表高表達(dá)基因,綠色表示低表達(dá)基因。顏色由紅到綠,表示表達(dá)量由高到低

bmp2基因在禽類骨骼生長(zhǎng),軟骨發(fā)育中起到重要作用[8,19],該基因在各時(shí)期肝臟組織中相對(duì)表達(dá)量C 組與NC 組比較均無(wú)顯著性差異(P＞0.05),但在成年鵝中,該基因在肝臟組織中相對(duì)表達(dá)量有羽束籽鵝高于三花鵝(non-crest),差異極顯著(P＜0.01)。同時(shí),在無(wú)羽束鵝基因聚類分析中(圖3B),發(fā)現(xiàn)該基因可能在肝臟發(fā)育、代謝過(guò)程中起到調(diào)控作用,與sox5基因關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)。由此推測(cè)該基因在羽束性狀發(fā)育前期并未起到主要調(diào)控作用,而在羽束性狀成型后期,間接參與調(diào)控過(guò)程,使該性狀具有不同表型[7,20]。2012年,WANG 等[2]通過(guò)研究烏骨雞纓頭性狀發(fā)現(xiàn),BMPs家族中bmp7基因與hoxc8基因?qū)Τ赡隇豕请u纓頭性狀具有互作效應(yīng),參與調(diào)控纓頭性狀的形成過(guò)程,這一結(jié)果也間接表明,bmp2作為BMPs家族中重要基因,可能在羽束性狀形成過(guò)程具有關(guān)聯(lián)性[8]。結(jié)合以上研究,均表明sox5、wnt5a、bmp2基因在羽束性狀形成中具有一定關(guān)聯(lián)性[6,17],通過(guò)在同信號(hào)通路中互作,或通過(guò)間接調(diào)控[21-22],在羽束性狀生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起到重要作用[23]。