龍云鑄 賀蕭瑾 李丹 周娟 周青 譚英征

肝細胞癌(HCC)是臨床上常見的惡性腫瘤，我國HCC的發(fā)生與HBV感染關(guān)系密切[1]。HBV是由雙鏈DNA構(gòu)成的病毒，包含四個重疊的編碼基因區(qū)域，其中，HBV X基因(HBx基因)可通過抑制抑癌基因的表達而導致HCC的發(fā)生[2]，但HBx基因發(fā)揮作用的具體機制仍不清楚。在多種抑癌基因中，細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制蛋白-1(SOCS-1)基因發(fā)揮重要的調(diào)控作用，SOCS-1基因啟動子區(qū)域甲基化可促進多種腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[3]。我們推測HBx基因可能通過抑制SOCS-1基因表達而起作用。本研究主要利用細胞轉(zhuǎn)染及甲基化PCR技術(shù)，探究HBx介導SOCS-1基因甲基化致HCC發(fā)生的機制。

資料與方法

一、材料

(一)細胞系 人正常肝細胞系L-02，購于通派生物科技有限公司。

(二)主要試劑 胎牛血清、MEM培養(yǎng)基(Gibco Life Technologies)；HBx質(zhì)粒(上海吉瑪制藥有限公司)；MTT細胞活力檢測試劑盒、SYBR Green qPCR Mix試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Transwell小室(美國康寧公司)；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SOCS-1基因甲基化擴增試劑盒、引物序列合成(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)，見表1；小鼠抗人HBX單抗、小鼠抗人SOCS-1單抗、兔抗小鼠二抗(圣克魯斯生物技術(shù)有限公司)。

(三)主要儀器 細胞培養(yǎng)箱(上海培因?qū)嶒瀮x器有限公司)；酶標儀(Thermo Scientific MultiSkan Go)；實時熒光定量PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。

二、方法

(一)細胞培養(yǎng) 將L-02細胞使用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，放置在無菌培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37 ℃，CO2濃度為5%，每4天傳代一次。

(二)細胞分組及細胞轉(zhuǎn)染 (1)細胞分組：在進行轉(zhuǎn)染前，將培養(yǎng)在96孔板或6孔板的細胞分為對照組、空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。(2)細胞轉(zhuǎn)染：當L-02細胞匯合度達到60%時，取2個2 mL無菌EP管，加入250 μL MEM培養(yǎng)基，再加入7 μL Lipofectamine 2 000，輕輕混勻。在這兩個EP管中分別加入3 μL空載質(zhì)粒、3 μL HBx質(zhì)粒，輕輕混勻，靜置20 min。將含有3 μL空載質(zhì)粒的混合液加入空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，將含有3 μL HBx質(zhì)粒的混合液加入HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，對照組細胞中只加入與其他兩組體積相同的MEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)6 h后，將培養(yǎng)液換成含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h后進行相關(guān)實驗。

(三)MTT法檢測細胞增殖能力[4](1)將L-02細胞按5×103個/孔的數(shù)目接種于96孔板中，24 h后，按方法(二)步驟進行處理。(2)將96孔板中的細胞培養(yǎng)液吸取干凈，每孔加入20 μL MTT溶液，放置在培養(yǎng)箱中孵育4 h。(3)將96孔板中液體倒掉，每孔加入150 μL DMSO溶液，震蕩5 min，使紫色反應(yīng)產(chǎn)物徹底溶解。(4)將酶標儀檢測波長設(shè)置為490 nm，上機測定各組細胞的吸光度(OD)，細胞OD值越大，細胞增殖能力越強，實驗重復6次。

(四)Transwell小室法檢測各組細胞遷移能力[5](1)將L-02細胞按3×104個/孔的數(shù)目接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，按方法(二)步驟對細胞進行處理。(2)取出6孔板，加入0.25%胰酶消化細胞，各組細胞經(jīng)離心后，加入MEM培養(yǎng)基重懸細胞。(3)對離心管中的細胞計數(shù)，并調(diào)整離心管中的細胞濃度(細胞濃度為1.5×105個/mL)。(4)從離心管中吸取100 μL細胞懸液，加入Transwell小室中，置入培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。(5)固定：取出小室后，使用95%乙醇溶液將細胞固定15 min。(6)染色：將0.1%的結(jié)晶紫溶液滴加在細胞表面，使細胞全部浸在染液中，10 min后，使用PBS對細胞清洗3次，晾干。(7)觀察計數(shù)：用倒置顯微鏡進行觀察，隨機選取5個視野計算穿過膜的細胞數(shù)，穿過膜的細胞數(shù)越多，細胞遷移能力越強，重復6次。

表1 引物序列

(五)RT-qPCR法檢測各組細胞HBX mRNA及SOCS-1 mRNA水平 (1)將L-02細胞接種于6孔板中，按方法(二)步驟進行轉(zhuǎn)染。(2)收集各組細胞，添加TRIzol試劑提取各組細胞的總RNA，隨后對總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。(3)按照試劑盒方法配制Mix及反應(yīng)體系。(4)對cDNA進行擴增，擴增條件為：95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共計50個循環(huán)反應(yīng)。(5)采用2-ΔΔCt法計算相對表達量，實驗重復6次。

(六)Western blot法檢測各組細胞中HBX及SOCS-1蛋白水平 (1)將L-02細胞接種于6孔板中，按方法(二)步驟進行轉(zhuǎn)染。(2)收集各組細胞，加入細胞裂解液，使用超聲破碎儀裂解細胞，經(jīng)低溫高速離心后，使用BCA蛋白定量試劑盒調(diào)整蛋白濃度。(3)上樣，進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，使用2% BSA溶液封閉。(4)在4 ℃條件下孵育小鼠抗人HBx單抗(1∶1 000)及小鼠抗人SOCS-1單抗(1∶1 000)。(5)12 h后，在室溫條件下，孵育兔抗小鼠二抗(1∶5 000)，孵育2 h。(6)在凝膠成像儀中成像拍照，使用Image J軟件進行分析，實驗重復6次。

(七)甲基化PCR法檢測各組細胞SOCS-1基因甲基化水平[6](1)將L-02細胞接種于6孔板中，按方法(二)步驟進行轉(zhuǎn)染。(2)收集并提取各組細胞總DNA。(3)使用甲基化擴增試劑對SOCS-1基因的甲基化(M)引物及非甲基化(U)引物進行擴增。擴增條件：95 ℃變性45 s， 60 ℃退火50 s， 72 ℃延伸60 s，共計40個循環(huán)反應(yīng)。(4)配制2%瓊脂糖凝膠，對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳，使用UVP凝膠成像儀拍照。(5)使用Image J軟件分析SOCS-1基因甲基化水平，實驗重復6次。(6)按照下列公式計算SOCS-1基因甲基化水平。公式：SOCS-1基因甲基化水平=灰度值M/(灰度值M+灰度值U)。

三、統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料均服從正態(tài)分布，結(jié)果以均數(shù)±標準差表示。多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用S-N-K檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、各組細胞增殖能力比較

對照組、空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞的OD值分別為0.48±0.12、0.50±0.14、0.88±0.13，差異具有統(tǒng)計學意義(F=21.07，P<0.001)?？蛰d質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與對照組細胞OD值比較，差異無統(tǒng)計學意義(q=0.4073，P>0.05)。HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞OD值高于空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(q=7.7388，P<0.05)。

二、各組細胞遷移能力比較結(jié)果

對照組、空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組穿過小室膜的細胞數(shù)目分別為148.31±6.92、151.27±8.22、229.18±11.37，差異具有統(tǒng)計學意義(F=154.68，P<0.001)。其中，空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與對照組穿過小室膜的細胞數(shù)目相比，差異無統(tǒng)計學意義(q=0.8028，P>0.05)。HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組穿過小室膜的細胞數(shù)目多于空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(q=21.1293，P<0.05)。

三、各組細胞HBx mRNA及SOCS-1 mRNA水平比較結(jié)果

對照組、空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞HBx mRNA及SOCS-1 mRNA水平比較，差異具有統(tǒng)計學意義(F=95.29、26.95，P<0.01)?？蛰d質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與對照組細胞中HBx mRNA及SOCS-1 mRNA水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(q=0.304 6、0.315 4，P>0.05)。HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞中HBx mRNA水平高于空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(q=17.057 8，P<0.05)，HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞中SOCS-1 mRNA水平低于空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(q=9.145 2，P<0.05)。

A：對照組，B：空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，C：HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組

圖1各組細胞遷移能力(×100)

表2 各組細胞HBx mRNA及SOCS-1 mRNA水平比較結(jié)果(n=6)

注：與對照組相比，aP<0.05；與空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，bP<0.05

四、各組細胞中HBX及SOCS-1蛋白水平比較

各組細胞HBX及SOCS-1蛋白水平比較，差異具有統(tǒng)計學意義(F=149.88、154.74，P<0.01)。空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞內(nèi)HBX及SOCS-1蛋白水平與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(q=0.226 8、1.923 7，P>0.05)。HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞內(nèi)HBX蛋白水平高于空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學意義(q=21.090 4，P<0.05)。HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞內(nèi)SOCS-1蛋白水平低于空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(q=22.442 8，P<0.05)。

A：對照組，B：空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，C：HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組

圖3各組細胞中HBX及SOCS-1蛋白水平

表3 各組細胞中HBX及SOCS-1蛋白水平比較結(jié)果(±s, n=6)

注：與對照組相比，aP<0.05；與空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，bP<0.05

五、各組細胞SOCS-1基因甲基化水平比較

對照組、空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞SOCS-1基因甲基化水平分別為0.23±0.09、0.21±0.08、0.88±0.11，差異具有統(tǒng)計學意義(F=98.32，P<0.001)?？蛰d質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與對照組細胞SOCS-1甲基化水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(q=0.520 3，P>0.05)。HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞SOCS-1甲基化水平高于空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學意義(q=17.428 9，P<0.05)。

A：對照組；B：空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；C：HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組

圖4各組細胞SOCS-1基因甲基化水平比較結(jié)果

討 論

本研究將HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)入L-02細胞內(nèi)后，L-02細胞的增殖、遷移能力均明顯增強。HBx基因?qū)-02細胞增殖遷移能力的影響與HBx基因?qū)CC細胞的影響一致。研究者繼續(xù)對L-02細胞中SOCS-1基因的表達水平進行檢測。RT-qPCR結(jié)果顯示，經(jīng)HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的L-02細胞內(nèi)HBx mRNA水平升高、SOCS-1 mRNA水平降低。Western blot實驗表明，經(jīng)HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的L-02細胞內(nèi)HBX蛋白水平上升、SOCS-1蛋白水平降低，HBX及SOCS-1蛋白水平的變化與HBx mRNA及SOCS-1 mRNA水平變化情況一致。上述結(jié)果表明，HBx基因可以通過促進SOCS-1基因啟動子發(fā)生甲基化，抑制L-02細胞內(nèi)SOCS-1基因的表達。本研究通過甲基化PCR法檢測了各組細胞中SOCS-1基因啟動子甲基化水平，結(jié)果顯示，經(jīng)HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的L-02細胞中SOCS-1基因啟動子甲基化水平明顯升高。

綜上所述，L-02細胞經(jīng)HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，細胞中HBx mRNA水平和SOCS-1基因啟動子甲基化水平升高，SOCS-1 mRNA及SOCS-1蛋白表達水平降低，L-02細胞增殖、遷移能力異常增強，從而導致HCC發(fā)生。但本研究僅從細胞水平進行了相關(guān)研究，在未來的研究中，我們將會利用動物實驗對HBx基因、SOCS-1基因甲基化及HCC三者的關(guān)系進行研究。