張梅，邢永澤，甄毓*，米鐵柱，于志剛

( 1. 中國海洋大學(xué) 海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100；2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237；3. 中國海洋大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100；4. 中國海洋大學(xué) 海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100)

1 引言

骨條藻（Skeletonema spp.）屬于海鏈藻目（Thalassiosirales）、骨條藻科（Skeletonemataceae），是我國近海海域常見、數(shù)量多、分布范圍極廣的一類海洋浮游硅藻，有時(shí)會引發(fā)赤潮。由于不同骨條藻種類之間的形態(tài)學(xué)差異十分細(xì)微，準(zhǔn)確鑒定的難度相對較大。因此，前些年國內(nèi)的研究者通常將我國近海海域的骨條藻都定名為中肋骨條藻（Skeletonema costatum）并對其進(jìn)行研究[1]。近些年來，分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展為骨條藻的種類鑒定和遺傳多樣性研究提供了可靠的技術(shù)保證。到目前為止，我國近海海域共發(fā)現(xiàn)10 種骨條藻，分別為瑪氏骨條藻（S. marinoi）、中肋骨條藻（S. costatum）、擬中肋骨條藻（S. pseudocostatum）、熱帶骨條藻（S. tropicum）、曼式骨條藻（S. menzelii）、江河骨條藻（S. potamos）、多恩骨條藻（S. dohrnii）、敏鹽骨條藻（S. subsalsum）、桂氏骨條藻（S. grevillei）和亞當(dāng)斯骨條藻（S. Ardens）[2]。隨著分子鑒定技術(shù)的發(fā)展，研究者逐漸將目光聚焦在了單種骨條藻的研究上。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）是定量分析基因表達(dá)的一種有效、精確的方法，具有重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)[3–4]。然而，在其分析過程中，RNA 的質(zhì)量和完整性、反轉(zhuǎn)錄效率、引物的特異性和擴(kuò)增效率以及其他阻礙因素都會對目的基因的相對表達(dá)結(jié)果的準(zhǔn)確定量產(chǎn)生影響[5]。因此，需要選擇合適的內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化，從而保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性[6–7]。目前，常用的內(nèi)參基因有很多，包括細(xì)胞色素b（cytochrome b,Cyt b）、轉(zhuǎn)錄延伸因子（elongation factor 1 alpha, EF-1α）、次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（hypoxanthine phosphoribosyltransferase, HPRT）、泛素結(jié)合酶（ubiquitin C,UBC）、甘油醛磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate, GAPDH）、β-肌動蛋白（actin beta, β-actin）、β-微管蛋白（tubulin beta, β-tubulin）、18S 核糖體RNA（18S rRNA）和25S 核糖體RNA（25S rRNA）等。一個理想的內(nèi)參基因應(yīng)該在任何細(xì)胞類型或?qū)嶒?yàn)條件下均能穩(wěn)定表達(dá)，但是迄今為止，并沒有發(fā)現(xiàn)任何一個內(nèi)參基因在所有實(shí)驗(yàn)條件下的表達(dá)都是穩(wěn)定的。所研究的物種類型、組織結(jié)構(gòu)、生長發(fā)育階段以及實(shí)驗(yàn)條件都會對內(nèi)參基因的表達(dá)產(chǎn)生影響[8–10]，因此，需要對不同實(shí)驗(yàn)體系中內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)與鑒定，以便篩選出合適的內(nèi)參基因。

研究者分析了兩種擬菱形藻Pseudo-nitzschia multistriata 和Pseudo-nitzschia arenysensis 的9 個內(nèi)參基因（RPS、H4、TUB A、TUB B、TBP、CDK A、GAPDH、ACT、COPA）在不同樣本（不同生長時(shí)期、氮脅迫以及不同菌株）中的表達(dá)穩(wěn)定性，結(jié)果表明，TUB A、TUB B 和CDK A 在所有樣本中的表達(dá)比較穩(wěn)定。就物種本身而言，TUB A、TUB B、CDK A、ACT 和COPA 在P. multistriata 中的表達(dá)穩(wěn)定性較好，而TUB A、TUB B、CDK A、GAPDH、H4 以及 RPS 則在P.arenysensis 的表達(dá)穩(wěn)定性較高[11]。在評估低溫、不同光照強(qiáng)度以及不同晝夜周期培養(yǎng)條件下微擬球藻（Nannochloropsis sp.）的內(nèi)參基因（ACT1、ACT2、

TUA、TUB、EF1-α、GAPDH、UBQ、HIS、CYP、UBCE、18S、rbcL）時(shí)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)條件的差異會造成最佳內(nèi)參基因的不同。該研究還發(fā)現(xiàn)ACT2 在所有樣品中的表達(dá)最為穩(wěn)定，但在單獨(dú)處理組中卻并不穩(wěn)定，而18S 在所有樣品中的表達(dá)最不穩(wěn)定，但在低溫處理組中的表達(dá)最為穩(wěn)定[12]。另有研究分析了綠潮原因種緣管滸苔（Ulva linza）的10 個內(nèi)參基因（ACT1、

ACT2、H2、H3、TUB1、TUB2、UBQ、EF1α、GAPDH、18S）在不同培養(yǎng)條件下的表達(dá)穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)不同鹽度和紫外線處理組的最佳內(nèi)參基因?yàn)門UB2，H2 在不同溫度和干燥脅迫下均能穩(wěn)定表達(dá)，而18S 在不同光照強(qiáng)度處理組表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定表達(dá)性。值得一提的是，在上述基因中并沒有發(fā)現(xiàn)適用于分析所有樣本的內(nèi)參基因[13]。綜上所述，內(nèi)參基因在不同實(shí)驗(yàn)體系中的表達(dá)穩(wěn)定性不同，根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的內(nèi)參基因十分重要。

鐵元素是葉綠體電子傳遞系統(tǒng)一個重要的輔助因子[14]，它會影響細(xì)胞內(nèi)功能基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而對光合器官碳固定、電子傳遞以及光利用的能力產(chǎn)生影響[15–17]。研究發(fā)現(xiàn)，高鐵濃度條件下小球藻Chlorella sorokiniana 的細(xì)胞密度顯著高于低鐵組，且參與細(xì)胞生長的碳酸酐酶（carbonic anhydrase, CA）以及與脂質(zhì)合成相關(guān)的乙酰輔酶A 羧化酶（acetyl CoA carboxylase,ACCase）和膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)體（choline transporter, CT）基因的表達(dá)量均有所增加，這說明鐵離子濃度的增加不僅會影響細(xì)胞的碳固定，還可能會影響碳的流向[18]。目前，關(guān)于鐵培養(yǎng)條件下微藻內(nèi)參基因篩選的研究較少，Actin 和泛素連接酶（ubiquitin ligase, UBL）基因是較為常見的內(nèi)參基因[19–20]。為了研究不同鐵離子濃度培養(yǎng)條件下瑪氏骨條藻碳固定相關(guān)功能基因的表達(dá)情況，十分有必要對內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行分析。為此，本研究選取7 個候選內(nèi)參基因，包括Cytb、EF-1α、HPRT、UBC、GAPDH、β-actin 以及β-tubulin，采用qRT-PCR 技術(shù)，結(jié)合geNorm[21]、NormFinder[22]和BestKeeper[23]3 個統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對它們在不同鐵處理?xiàng)l件下的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評估，同時(shí)，以磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC1、PEPC2）基因?yàn)槟康幕颍捎??ΔΔCt法[24]來驗(yàn)證評估結(jié)果的準(zhǔn)確性，以期篩選出合適的內(nèi)參基因，為后續(xù)瑪氏骨條藻碳固定相關(guān)功能基因的研究提供參考。

2 材料與方法

2.1 瑪氏骨條藻的培養(yǎng)

瑪氏骨條藻（Skeletonema marinoi）保存于中國海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藻種室，以f/2 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，光照周期為12 h/12 h，光照強(qiáng)度為80～100 μmol/ (m2·s)，培養(yǎng)溫度為(20±1)℃。實(shí)驗(yàn)時(shí)，取少量處于指數(shù)生長中期的瑪氏骨條藻，離心去除培養(yǎng)液，將收集得到的藻細(xì)胞轉(zhuǎn)接于不同濃度Fe3+（用FeCl3·6H2O 配制）的培養(yǎng)基中，共設(shè)5 個處理組，添加的Fe3+濃度分別為：1.5 μmol/L、3.0 μmol/L、6.0 μmol/L、12.0 μmol/L、24.0 μmol/L，每個處理組設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)。其中，培養(yǎng)容器為500 mL 容量瓶，培養(yǎng)體積為400 mL。為了保證無菌環(huán)境，在培養(yǎng)起始時(shí)加入終濃度為50 mg/L 的氨芐青霉素。每天定時(shí)取樣監(jiān)測藻細(xì)胞密度，細(xì)胞密度的測定利用光密度法（680 nm）來完成，根據(jù)測定的吸光度值，結(jié)合已經(jīng)繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）來計(jì)算。待細(xì)胞生長進(jìn)入穩(wěn)定期后（培養(yǎng)第11 天），離心收集藻細(xì)胞，液氮速凍后?80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 樣品總RNA 的提取和cDNA 的合成

參照Trizol reagent（Invitrogen，美國）試劑說明書對不同鐵離子濃度培養(yǎng)條件下瑪氏骨條藻的總RNA進(jìn)行提取。利用DS-11 超微量紫外可見分光光度計(jì)（DeNovix, 美國）和1%的瓊脂糖凝膠電泳對RNA 的質(zhì)量和濃度進(jìn)行檢測，待檢測質(zhì)量合格后，每個樣品選取400 ng 總RNA，使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，中國）進(jìn)行基因組DNA 的去除和cDNA 的反轉(zhuǎn)錄合成，獲得的cDNA 樣品保存于?20℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 引物的設(shè)計(jì)和驗(yàn)證

根據(jù)瑪氏骨條藻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（原始序列已提交至https://www.ncbi.nlm.nih.gov/，登陸號為：GSE77468），獲取Cytb、EF-1α、PEPC1 以及PEPC2 等9 個基因的序列，利用Primer Premier 5 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)好的引物交由北京六合華大基因有限公司合成，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析。

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，采用20 μL 體系：1 μL 模板cDNA，正、反向引物（10 μmol/L）各1 μL，10 μL 2×Easy TaqPCR super mix（北京全式金生物技術(shù)有限公司，中國），7 μL 無菌水。每個樣本設(shè)置2 個平行，反應(yīng)設(shè)置陰性對照。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72℃延伸5 min。反應(yīng)完成后，取3 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖（2%）凝膠電泳檢測，觀察電泳條帶是否單一，如若單一，將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物和其對應(yīng)的引物送至北京六合華大基因有限公司進(jìn)行測序，檢測PCR 產(chǎn)物是否為目的片段。

2.4 qRT-PCR 的反應(yīng)條件的設(shè)置

采用SYBR GreenⅠ染料法，在7500 Real-Time PCR system（Applied Biosystems，美國）上進(jìn)行qRTPCR 擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析。采用20 μL 體系：10 μL Fast-Start Universal SYBR Green Master（Roche, 瑞士），正、反向引物（10 μmol/L）各0.6 μL，0.2 μL BSA（20 mg/mL），2 μL cDNA，6.6 μL 的滅菌水。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s，53℃（56℃，60℃）退火延伸1 min，40 個循環(huán)。每個反應(yīng)設(shè)置3 個技術(shù)重復(fù)，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對照。引物的退火溫度根據(jù)熔解溫度（Tm值）來進(jìn)行設(shè)置，其中，Cytb 的退火溫度為53℃，UBC、GAPDH、HPRT 以及PEPC2 的退火溫度為56℃，其余4 個基因的退火溫度為60℃。

2.5 引物擴(kuò)增效率的計(jì)算

利用稀釋模板cDNA 的方法，通過qRT-PCR 反應(yīng)獲得不同濃度梯度下各個反應(yīng)的Ct 值，計(jì)算引物的擴(kuò)增效率。具體的實(shí)驗(yàn)方法如下：等量移取15 個樣品的cDNA，充分混合后依次稀釋7 個梯度，每個梯度稀釋2 倍，則濃度分別為原液的1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32 和1/64。每個反應(yīng)設(shè)置3 個技術(shù)重復(fù)，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對照。以稀釋倍數(shù)的對數(shù)值和樣本的平均Ct 值分別作為橫、縱坐標(biāo)做直線擬合分析，得到斜率k 和確定系數(shù)R2。根據(jù)公式A=10?1/k?1，計(jì)算出引物的擴(kuò)增效率A。

2.6 數(shù)據(jù)的處理與分析

讀取每個反應(yīng)的Ct 值，計(jì)算出單個候選內(nèi)參基因在每個樣品中的平均值（Ct′），利用GeNorm、NormFinder 和BestKeeper 軟件分析7 個候選內(nèi)參基因在不同鐵濃度培養(yǎng)條件下的穩(wěn)定表達(dá)系數(shù)。其中，BestKeeper 軟件可以直接對Ct′值進(jìn)行分析，而GeNorm 和NormFinder 兩個軟件需要將Ct′值轉(zhuǎn)化為Q 值（基因的相對表達(dá)量）后，才可進(jìn)行分析。轉(zhuǎn)化公式為Q=EΔCt′，其中，ΔCt′為該基因在所有處理組中的最小值減去該基因在各個處理組樣品中的Ct′值，E=2A，當(dāng)引物的擴(kuò)增效率（A）接近100%時(shí)，E 通常默認(rèn)為2。

3 結(jié)果與討論

3.1 不同濃度Fe3+培養(yǎng)條件下瑪氏骨條藻的生長狀況分析

不同濃度Fe3+培養(yǎng)條件下瑪氏骨條藻的生長曲線如圖2 所示，培養(yǎng)11 d 后，5 個處理組的細(xì)胞生長均已進(jìn)入穩(wěn)定期，離心收集瑪氏骨條藻細(xì)胞樣品，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要。由圖2 可知，各組在前5 d 的細(xì)胞密度差異較小，表明此時(shí)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)鹽較為充足，適合瑪氏骨條藻的生長。從培養(yǎng)第6 天開始，各組細(xì)胞密度開始出現(xiàn)不同，基本表現(xiàn)為培養(yǎng)液中初始Fe3+濃度越高，細(xì)胞的最終密度則越大。通過計(jì)算發(fā)現(xiàn)，1.5 μmol/L、3.0 μmol/L、6.0 μmol/L、12.0 μmol/L、24.0 μmol/L Fe3+處理組的平均生長速率分別為0.319 d?1、0.324 d?1、0.327 d?1、0.330 d?1以及0.335 d?1，其中，1.5 μmol/L Fe3+處理組的平均生長速率顯著低于6 μmol/L、12 μmol/L以及24 μmol/L 處理組（p＜ 0.05），而與3 μmol/L 處理組的平均生長速率并無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。同時(shí)，3 μmol/L、6 μmol/L 和12 μmol/L 處理組的平均生長率并無顯著差別，但前兩者的平均生長率卻顯著低于24 μmol/L 處理組，而后者與24 μmol/L 處理組并無顯著差別。簡而言之，F(xiàn)e3+濃度的升高從一定程度上可以促進(jìn)瑪氏骨條藻的生長。

圖 1 吸光度值與瑪氏骨條藻細(xì)胞密度的線性關(guān)系Fig. 1 The linear relationship between absorbance value and cell density of Skeletonema marinoi

3.2 總RNA 的質(zhì)量檢測

在qRT-PCR 分析中，檢測RNA 的純度和完整性是十分必要的。使用DS-11 超微量紫外可見分光光度計(jì)（DeNovix，美國）檢測總RNA 的濃度和純度。檢測結(jié)果表明，15 個樣品的A260/A280在1.85～1.98 之間，說明RNA 的純度較高；其中260 nm 是核酸的最高吸收峰的吸收波長，280 nm 是蛋白質(zhì)的最高吸收峰的吸收波長。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性，發(fā)現(xiàn)能夠較為清晰的顯示3 個條帶，由上到下分別為28SRNA、18SRNA 以及small RNAs 條帶，這說明RNA 的質(zhì)量較好，基本沒有發(fā)生降解，可滿足后續(xù)qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)的要求。

3.3 引物特異性驗(yàn)證和擴(kuò)增效率的測定

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，同時(shí)對9 對引物分別設(shè)置陰性對照，利用2%瓊脂糖凝膠電泳對上述PCR 的結(jié)果進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)各對引物的擴(kuò)增片段電泳條帶單一且清晰，無彌散現(xiàn)象，且所有的陰性對照結(jié)果均為陰性，圖3a、圖3b 中展示的分別是Cytb、PEPC1 基因的陰性對照結(jié)果。將PCR產(chǎn)物和其對應(yīng)的引物進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與原基因序列BLAST 比對發(fā)現(xiàn)，PCR 產(chǎn)物與原基因序列高度一致，表明這些引物均能成功進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增。

以2 倍濃度梯度稀釋的cDNA 為模板，進(jìn)行qRTPCR 擴(kuò)增，根據(jù)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合分析，從而獲得9 個基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示上述9 個基因的確定系數(shù)R2≥0.984。將標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率k 帶入公式A=10?1/k?1，獲得引物的擴(kuò)增效率，結(jié)果顯示引物的擴(kuò)增效率在99.0%～104.0%之間，符合qRT-PCR 對擴(kuò)增效率的要求（表1）。同時(shí)，分析各個基因的熔解曲線發(fā)現(xiàn)，都只產(chǎn)生單一峰，技術(shù)重復(fù)樣品間的曲線重疊性好，陰性對照組無對應(yīng)的信號。上述結(jié)果表明所設(shè)計(jì)的引物特異性較強(qiáng)，qRT-PCR 反應(yīng)的結(jié)果準(zhǔn)確可信。

3.4 內(nèi)參基因的表達(dá)分析

qRT-PCR 分析了7 個候選內(nèi)參基因在5 個不同鐵離子濃度處理組的表達(dá)豐度（圖4），結(jié)果顯示，所有候選內(nèi)參基因的Ct 值在19.0～32.3 之間，其中，Cytb、EF-1α 和β-actin 基因的Ct 值較低，分別在19.0～21.0、19.7～21.8 和20.6～22.4 之間；GAPDH 和U B C 基因的C t 值較高，分別在2 6.4 ～3 0.9 和28.9～32.3 之間；而HPRT 和β-tubulin 的Ct 值則分別在23.6～28.5 和24.3～27.1 之間，上述這些結(jié)果說明上述內(nèi)參基因不僅在表達(dá)豐度上存在一定的差異，而且表達(dá)穩(wěn)定性也有所不同。

圖 2 不同濃度Fe3+培養(yǎng)條件下瑪氏骨條藻的生長曲線Fig. 2 Growth curves of Skeletonema marinoi in different concentration of Fe3+ conditions

圖 3 9 個基因的PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of PCR product of seven reference genes

3.5 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析

3.5.1 GeNorm 分析

GeNorm 通過對內(nèi)參基因在不同處理組中的平均表達(dá)穩(wěn)定指數(shù)（average expression stability value, M）進(jìn)行排序來確定最穩(wěn)定表達(dá)的基因，M 值越大，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越低，反之，穩(wěn)定性越好。在分析過程中，逐步排除掉M 值高的基因，然后再重新計(jì)算剩余內(nèi)參基因的M 值，直至篩選出最穩(wěn)定的兩個內(nèi)參基因。通常認(rèn)為M＜1.5 的內(nèi)參基因表達(dá)相對穩(wěn)定。GeNorm軟件的分析結(jié)果表明，7 個候選內(nèi)參基因的M 值均小于1.5，說明上述7 個基因的表達(dá)都較為穩(wěn)定。在7 個候選內(nèi)參基因中，Cytb 和EF-1α 的M 值最低（0.252），說明這兩個基因的穩(wěn)定性最好；HPRT 的M 值最高（0.786），說明它是所選內(nèi)參基因中最不穩(wěn)定的。根據(jù)M 值的大小對7 個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行排序，穩(wěn)定性由強(qiáng)到弱的順序?yàn)椋篍F-1α=Cytb＞β-tubulin＞β-actin＞UBC＞GAPDH＞HPRT（圖5）。

GeNorm 還可通過引入一個新的內(nèi)參基因計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化因子（normalization factor）的配對變異（pairwise variation）V 值來確定合適的內(nèi)參基因數(shù)目。GeNorm 默認(rèn)的V 值為0.15，即當(dāng)Vn/（n+1）＜0.15 時(shí)，則最適的內(nèi)參基因數(shù)目是n 個，反之，最適的內(nèi)參基因數(shù)目是(n+1)個。在本實(shí)驗(yàn)中，V2/3=0.110＜0.15，所以本實(shí)驗(yàn)應(yīng)該選擇2 個內(nèi)參基因?qū)δ康幕虻膓RT-PCR 反應(yīng)進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化（圖6）。

表 1 qRT-PCR 檢測中9 個基因的引物序列及其他相關(guān)信息Table 1 Primer sequences and other relevant information of nine genes in qRT-PCR

圖 4 不同濃度Fe3+處理組中各個內(nèi)參基因的表達(dá)豐度Fig. 4 The expression abundance of each reference gene in the treatment group with different concentration of Fe3+ conditions

圖 5 GeNorm 分析7 個候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性指數(shù)Fig. 5 The average expression stability value (M) of seven candidate reference genes calculated by GeNorm

3.5.2 NormFinder 分析

NormFinder 的計(jì)算原理與GeNorm 相似，也是先獲得內(nèi)參基因的M 值，再根據(jù)M 值的大小來篩選出最穩(wěn)定表達(dá)的一個內(nèi)參基因。結(jié)果表明（表2）：不同濃度Fe3+培養(yǎng)條件下，EF-1α 的M 值最低（0.084），說明它的穩(wěn)定性是所選內(nèi)參基因中最好的；HPRT 的M 值最高（0.800），說明它的穩(wěn)定性最差。7 個候選內(nèi)參基因按照穩(wěn)定性從強(qiáng)到弱排序依次為：EF-1α＞β-tubulin＞Cytb＞UBC＞β-actin＞GAPDH＞HPRT。值得注意的是，NormFinder 和GeNorm 兩個軟件篩選出來的最穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因均為EF-1α，而穩(wěn)定性最差的均為

HPRT。

3.5.3 BestKeeper 分析

BestKeeper 程序是一個內(nèi)置公式的Excel 表格，通過輸入Ct 值對各個內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行分析。在BestKeeper 的輸出結(jié)果中，標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）和變異系數(shù)（CV）是表征內(nèi)參基因在樣品中表達(dá)穩(wěn)定性的指標(biāo)。內(nèi)參基因穩(wěn)定性的判定原則為：SD 和CV 越小，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越好，反之，穩(wěn)定性越差，通常認(rèn)為SD＜1 的內(nèi)參基因表達(dá)相對穩(wěn)定。相關(guān)系數(shù)（r）則表征的是候選內(nèi)參基因與其余內(nèi)參基因的相關(guān)性，是選擇內(nèi)參組合的重要指標(biāo)，r 越大，說明該基因與其他基因的相關(guān)性越高，適合同其他內(nèi)參基因協(xié)同作為內(nèi)參組合。BestKeeper 的分析結(jié)果（表3）顯示：βactin 在不同濃度Fe3+培養(yǎng)條件下瑪氏骨條藻樣品中的表達(dá)比較穩(wěn)定（SD 為0.23），適合作為qRT-PCR 反應(yīng)的內(nèi)參基因，而GAPDH 的SD 值為1.03，其穩(wěn)定性較差，不適合被用作內(nèi)參基因。7 個內(nèi)參基因按照穩(wěn)定性從強(qiáng)到弱排序依次為：β-actin＞Cytb＞EF-1α＞β-tubulin＞UBC＞HPRT＞GAPDH。相關(guān)系數(shù)的分析結(jié)果顯示，EF-1α 和β-tubulin 最適合與其他內(nèi)參基因協(xié)同作為內(nèi)參組合，隨后是UBC、Cytb、GAPDH 和HPRT，而β-actin 最不適合。

3.6 內(nèi)參基因的確定

利用GeNorm、NormFinder 和BestKeeper 軟件對不同濃度Fe3+培養(yǎng)條件下瑪氏骨條藻7 個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行評估，結(jié)果表明這些候選內(nèi)參基因的排序結(jié)果略有差異，這可能是由于軟件的統(tǒng)計(jì)學(xué)算法不同導(dǎo)致的。這種現(xiàn)象在黃瓜（Cucumis sativus）[25]、亞麻（Linum usitatissimum）[26]以及柑橘（Citrus genotypes）[27]等植物的研究中也曾出現(xiàn)過?；谏鲜鼋Y(jié)果，我們對每種軟件分析得到的內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行排序并給予賦值，表達(dá)穩(wěn)定性由強(qiáng)到弱依次賦值為1、2、3、4、5、6 和7，然后對3 種軟件的分析結(jié)果（表4）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示EF-1α 得分最低，Cytb次之，隨后是β-tubulin、β-actin、UBC 以及GAPDH，而HPRT 的得分最高。因此，可以認(rèn)為在不同濃度Fe3+培養(yǎng)條件下，瑪氏骨條藻7 個候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性的排序?yàn)椋篍F-1α＞Cytb＞β-tubulin＞β-actin＞UBC＞GAPDH＞HPRT。綜合來看，EF-1α 和Cytb 基因的穩(wěn)定性較好。

表 2 NormFinder 分析7 個內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性指數(shù)Table 2 The average expression stability value (M) of seven reference genes calculated by NormFinder

表 3 BestKeeper 分析7 個內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性指數(shù)Table 3 The average expression stability value（M）of seven reference genes calculated by BestKeeper

圖 6 內(nèi)參基因的配對變異分析Fig. 6 Analysis pairwise variations of reference genes

在qRT-PCR 分析中，使用不理想的內(nèi)參基因會給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來偏差[28]，同時(shí)，只使用單一內(nèi)參基因進(jìn)行校準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)化，也會給結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確度帶來影響[29]。為了消除單一內(nèi)參基因所帶來的定量偏差，Schmid 等[30]建議在標(biāo)準(zhǔn)化過程中至少使用2 個內(nèi)參基因?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行校正。前已述及，GeNorm軟件的配對變異（pairwise variation）V 值結(jié)果表明最佳的內(nèi)參基因數(shù)為2，通過上述分析發(fā)現(xiàn)最穩(wěn)定表達(dá)的兩個基因?yàn)镋F-1α 和Cytb。同時(shí)，EF-1α 和Cytb 的相關(guān)系數(shù)（分別為0.97 和0.88）均較大，適合同其他基因協(xié)同作為內(nèi)參基因。因此，建議選擇（EF-1α+Cytb）的內(nèi)參組合進(jìn)行不同濃度Fe3+培養(yǎng)條件下目的基因的校正。

3.7 內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗(yàn)證

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）廣泛存在于植物中，是一種細(xì)胞質(zhì)酶，其催化C4光合作用固定CO2的起始反應(yīng)。我們在瑪氏骨條藻轉(zhuǎn)錄組里發(fā)現(xiàn)了2 個PEPC 基因，分別命名為PEPC1 和PEPC2。為了驗(yàn)證不同內(nèi)參基因?qū)RT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，采用2?ΔΔCt法，分別以7 個內(nèi)參基因和穩(wěn)定性最佳的組合（EF-1α+Cytb）為內(nèi)參基因，分析PEPC1 和PEPC2 在不同鐵濃度處理組中的表達(dá)模式。由圖8可知，以（EF-1α+Cytb）、Cytb 或EF-1α 為內(nèi)參基因時(shí)，目的基因在不同濃度鐵離子處理組的表達(dá)趨勢基本一致，表明Cytb 和EF-1α 這兩個基因的表達(dá)穩(wěn)定性較好，而以GADPH、HPRT 等基因?yàn)閮?nèi)參基因時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)目的基因的相對表達(dá)量與前三者存在明顯的差別，表明這些基因在不同鐵離子處理組的表達(dá)穩(wěn)定性較差，不適合作為內(nèi)參基因?qū)δ康幕虻南鄬Ρ磉_(dá)量進(jìn)行準(zhǔn)確校正。上述結(jié)果說明，運(yùn)用qRT-PCR 分析目的基因時(shí)選用不恰當(dāng)?shù)膬?nèi)參基因會錯誤估計(jì)目的基因的相對表達(dá)量，由此可見，篩選合適的內(nèi)參基因至關(guān)重要。

4 結(jié)論

本研究中，Cytb 和EF-1α 基因的穩(wěn)定性最好。Cytb 是線粒體自身編碼的為數(shù)不多的功能蛋白之一，其參與呼吸鏈的電子傳遞，在細(xì)胞的能量代謝中發(fā)揮著重要的作用[31]。何閃英等[32]在研究增殖細(xì)胞核抗原基因表達(dá)量與中肋骨條藻生長時(shí)發(fā)現(xiàn)，Cytb 基因表達(dá)量變化較小，可以作為內(nèi)參基因?qū)δ康幕蜻M(jìn)行校正。EF-1α 是一種多功能蛋白，其與多種重要的細(xì)胞學(xué)過程密切相關(guān)，包括細(xì)胞骨架組成、信號傳導(dǎo)、翻譯控制及細(xì)胞凋亡等[33]。研究發(fā)現(xiàn)，在梧桐（Firmiana simplex）種子[34]和黑麥草（Lolium perenne）[35]的不同發(fā)育階段、楊樹（Populus L.）[36]和黃瓜（Cucumis sativus）[25]不同組織中EF-1α 基因的表達(dá)較為穩(wěn)定，這說明在某些特定條件下，EF-1α 基金適合作為基因表達(dá)研究中的內(nèi)參基因。本研究中β-tubulin、β-actin、UBC、GADPH 等基因的穩(wěn)定性較差，在其他研究中既發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，也發(fā)現(xiàn)了相反的結(jié)果。輻射條件下，β-tubulin、β-actin 以及GADPH 在萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）中的表達(dá)比較穩(wěn)定，而UBC 的穩(wěn)定性較差[37]，但在對短柄草（Brachypodium distachyon）的研究中卻發(fā)現(xiàn)UBC 的穩(wěn)定性較好[38]。對毛果楊（Populus trichocapra）而言，β-tubulin 在不同組織中穩(wěn)定性最差，GADPH 在鋅脅迫的組織中表達(dá)最不穩(wěn)定，不適合作為內(nèi)參基因[39]。可見，同樣的內(nèi)參基因在不同物種或?qū)嶒?yàn)條件下的表達(dá)穩(wěn)定性存在顯著差異。因此，應(yīng)該根據(jù)樣品的類型篩選合適的內(nèi)參基因進(jìn)行目的基因的標(biāo)準(zhǔn)化。

近些年來的研究表明，傳統(tǒng)的單一內(nèi)參基因會給結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確度帶來不良影響，因此建議選擇內(nèi)參基因組合對目的基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化[21]。吳文凱等[40]研究發(fā)現(xiàn)，以不同看家基因構(gòu)成的多內(nèi)參基因組合可能更有利于單細(xì)胞綠藻目的基因的相對表達(dá)分析。Shim 等[41]分析了紅藻Bostrychia moritziana 的11 個內(nèi)參基因（EF-1α、GAPDH、ACTB、PUB、30S、60S、TUBB、TUBA、TIF、UbCE、cdH）在不同生活史階段（雄性、雌性、果孢子體和四分孢子體）的表達(dá)穩(wěn)定性，結(jié)果表明，GAPDH 和30S 的組合更能保證目的基因相對表達(dá)的準(zhǔn)確性。Liu 等[42]為冰凍脅迫條件下南極冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L 篩選內(nèi)參基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，使用RPL19 和GAPDH 的內(nèi)參基因組合有助于獲得更加精確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。類似的現(xiàn)象也出現(xiàn)在了湛江等邊金藻（Isochrysis zhangjiangensis）的分析結(jié)果中，研究發(fā)現(xiàn)在氮脅迫條件下，ACT 和TUB 的內(nèi)參基因組合是研究目的基因表達(dá)最可行的內(nèi)控方法[43]。上述結(jié)果表明，使用內(nèi)參基因組合有助于獲得更加精確的分析結(jié)果。從本研究的結(jié)果來看，HPRT、UBC、GAPDH、β-actin 以及β-tubulin 的穩(wěn)定性較差，不適合用作鐵處理?xiàng)l件下的內(nèi)參基因，而EF-1α 和Cytb 的表達(dá)比較穩(wěn)定，適合用作內(nèi)參基因。同時(shí)，GeNorm 配對變異分析結(jié)果表明最佳內(nèi)參基因個數(shù)為2，且EF-1α 和Cytb 的相關(guān)系數(shù)均較大（分別為0.97 和0.88），適合作為內(nèi)參基因組合對目的進(jìn)行進(jìn)行校正。因此，本研究建議選擇EF-1α+Cytb 組合進(jìn)行不同F(xiàn)e3+濃度處理下目的基因的校正。

表 4 7 個內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性的統(tǒng)計(jì)分析Table 4 Statistical analysis of the expression stability of seven reference genes

圖 7 不同內(nèi)參基因條件下PEPC1 和PEPC2 基因的相對表達(dá)量分析Fig. 7 Analysis of relative expression of PEPC1 and PEPC2 genes in different reference genes conditions