高陽，李海濤*，姜重臣，陳志云，李宏俊

( 1. 國家海洋局南海環(huán)境監(jiān)測中心，廣東 廣州 510300；2. 中國科學院南海海洋研究所 熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室，廣東 廣州 510301；3. 國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心，遼寧 大連 116023)

1 引言

海洋浮游軟體動物是一類終生營浮游生活的類群，一般屬于腹足綱(Gastropoda)。據估計，終生浮游腹足類僅有約140 種[1]。浮游腹足類大多棲息于上層200 m 水體，并有明顯的晝夜垂直遷移現象[2–3]。作為初級消費者、被捕食者及鈣化生物，浮游腹足類在海洋生態(tài)系統(tǒng)的生物地球化學過程中扮演著十分關鍵的作用[4–5]。此外，由于對海洋酸化的極度敏感性，浮游腹足類成為良好的指示物種[6–7]。

自半個多世紀前張福綏[8]開展中國海的浮游軟體動物分類以來，迄今鮮見其他分類報道，其研究結果影響深遠。由于研究的匱乏，我國浮游腹足類的分類嚴重滯后，一些分類錯誤延續(xù)至今，無法得到訂正，如：歸在螔螺科(Limacinidae)下的強卷螺屬(Agadina)種類實際上是成體營底棲生活的輪螺科(Architectonicidae) 的面盤幼蟲[9–10]；厚唇螺屬(Diacria) 由D.trispinosa 復合群和D. quadridentata 復合群組成，其中D. trispinosa 復合群中的種類根據殼面花紋的分布來區(qū)分[11]，我國記錄的D. trispinosa 缺乏殼面花紋分布這一關鍵分類特征的描述，實際上無法確定其為何種[8]。此外，一些物種的形態(tài)描述和圖示與實物有一定出入；基于形態(tài)變化的考慮而提出的一些亞種或變種， 尚無后續(xù)研究的證實。

大多數浮游腹足類的貝殼缺乏雕刻或生長紋等特征，其形態(tài)鑒定主要依據一些簡單的分類性狀，單純依靠形態(tài)特征很難進行準確的種類鑒定。基于mt-COI 基因的DNA 條形碼技術[12]目前已被廣泛應用于浮游腹足類的種類鑒定和多樣性分析[13–15]。浮游軟體動物分布廣泛，很多種類為接近全球分布或環(huán)球分布[13,16]，是開展生物地理學或譜系地理學研究的良好材料[16–17]。本研究以長角螺屬(Clio)物種為材料，通過對mtCOI 基因和核18S rRNA 基因序列的分析，結合數據庫中已有的數據，對其進行了分類學和譜系地理學研究，以期了解該屬種類的地理遺傳分化和分布狀況，同時為其他浮游軟體動物的多樣性研究提供參考。

2 材料與方法

2.1 樣品采集

實驗樣品于2016 年5 月至2019 年1 月采自西北太平洋(含南海、呂宋海峽及其周邊海域和新幾內亞島以北海域) 及北印度洋海域。使用大型浮游生物網(網目0.505 mm)采用垂直拖網和水平拖網相結合的方式采集浮游動物樣品。為增加樣品的采獲幾率，西北太平洋海域的采樣均在夜間進行。浮游動物樣品經無水酒精固定后冰凍保存帶回實驗室，體視鏡下分選出長角螺屬動物樣品，對其進行初步的形態(tài)鑒定，并編號拍照。除呂宋海峽的樣品為部分測序外，其余采樣點的樣品全部用于測序，共計55 個標本用于DNA 序列的分析，測序標本的采樣信息見表1。

2.2 DNA 提取、PCR 擴增和測序

剪取長角螺游泳鰭，采用堿裂解法[18]提取DNA。使用引物LCO-1490(5′-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3′)和HCO-2198 (5′-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3′)[19]擴增mt-COI 基因片段；使用引物18A1 (5′- CTG GTT GAT CCT GCC AGT CAT ATG C-3′)和1800 (5′-GAT CCT TCC GCA GGT TCA CCT ACG-3′)[20]擴增18S rRNA 基因。

PCR 反應體系總體積為50 μL，包括：2×buffer 25 μL，dNTP 400 μmol/L，引物各0.3 μmol/L，KOD FX 高保真PCR 酶(TOYOBO 公司)1.0 U，模板DNA1 μL，加去離子水補足至50 μL。PCR 反應條件為：94℃預變性2 min；98℃變性15 s，52℃退火30 s，68℃延伸60 s (mtCOI)或120 s (18S rRNA)，共30 個循環(huán)；最后68℃延伸10 min。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送廣州艾基生物技術有限公司進行回收純化和測序，測序引物與擴增引物相同。為保證18S rRNA基因片段測通，中間引物1155R (5′-CCG TCA ATTCCT TTA AGT TTC AG-3′)也被用于測序[20]。

表 1 測序標本的采樣信息Table 1 Collection information for specimens analyzed in this study

2.3 系統(tǒng)學分析

拼接、校對后的測序結果，連同GenBank 中下載的序列，在BioEdit 軟件中進行多重序列比對。使用MEGA 7.0 計算堿基的組成，基于Kimura 2-Parameter(K2P)參數模型計算遺傳距離，并采用鄰接法(Neighbor-joining，NJ)構建系統(tǒng)進化樹，可靠性經過1 000 次自展(Bootstrap, BS)檢驗。采用MrBayes 3.2[21]構建貝葉斯樹(Bayesian Inference, BI)，分子進化模型使用jModelTest 2.1[22]根據Bayesian Information Criteria(BIC)標準計算得出。mtCOI 和18S rRNA 基因的最佳進化模型分別為HKY+I+G 和K80+I。在馬爾可夫鏈蒙特卡羅(Markov Chain Monte Carlo，MCMC)參數下運行300 萬代，每100 代抽樣一次，前2 500 代作為老化樣本舍去。BI 樹各分支置信度以后驗概率(Posterior Probabilities, PP)表示。使用FigTree 1.4.3 顯示BI 樹的拓撲結構圖。

從GenBank 中下載的長角螺屬COI 基因序列包括C. pyramidata(MH101647～55、FJ876874～75、MF048921～22、KC774065～68、KP292791、KC788279、GQ861823)、C. pyramidata lanceolate (FJ876872～73、FJ876877～79)、C. pyramidata antarctica (FJ876876、MF048919)、C. cuspidata (FJ876869～71、KP292789、KC774064)、C. convexa (KC774062～63、KC774069)、C.recurva (FJ876880～86、KP292790、MF048923)、Clio sp.(FJ876887)。

2.4 分子可操作分類單元估計

采用GMYC（Generalized Mixed Yule Coalescent）模型[23]、ABGD（Automatic Barcoding Gap Discovery）方法[24]和3%K2P 遺傳距離閾值進行分子可操作分類單元（Molecular Operational Taxonomic Units, MOTUs）估計。

GMYC 模型：利用BEAST v1.10.1[25]構建超度量系統(tǒng)發(fā)育樹；采用uncorrelated log-normal clock 模型，1×108次MCMC 分析，1 000 次burn in；利用BEAST 軟件包中的TreeAnnotator 分析超度量系統(tǒng)發(fā)育樹，并生成最大譜系置信樹；隨后用FigTree 1.4.3 將最大譜系置信樹轉化為APE 識別的格式(Newick)；最后利用R 環(huán)境中的“SPLITS”軟件包進行單閾值GMYC 物種界定[23]，利用gmyc 函數獲得零模型與GMYC 模型之間的似然比值、種?種群的轉折點，以及轉折點對應的MOTU 的數量。

ABGD 方法：樣本在線提交至ABGD 網站(http://wwwabi.snv.Jussieu.fr./pubilc/abgd/abgdweb.html)，采用K2P 模型計算遺傳距離，其他參數均使用網絡版本的默認值，基于遺傳距離對樣本進行劃分。

3%K2P 遺傳距離閾值：將K2P 遺傳距離小于或等于3%(0.03)的序列劃分為同一MOTU，遺傳距離大于3%的序列劃分為不同的MOTU。

3 結果

3.1 形態(tài)鑒定結果

西北太平洋和印度洋海域采集的長角螺屬標本，經形態(tài)鑒定，屬于矛頭長角螺(C. pyramidata)(圖1a–c)、尖棘長角螺(C. cuspidata) (圖1d–f)和膨凸長角螺(C. convexa) (圖1g)3 個形態(tài)種，以及個別通過形態(tài)難以定種的幼體(圖1h)。在采樣過程中，較大個體的標本極易破損，棘刺發(fā)達的尖棘長角螺很難得到完整的標本。呂宋海峽采集到的尖棘長角螺(圖1d–e)明顯較新幾內亞島以北海域采集到的個體(圖1f)寬大，后者殼體明顯纖細。

3.2 序列分析

測序共獲得55 條mtCOI 序列(GenBank 登錄號MK749610～64，表1) 和9 條18S rRNA 基因序列(GenBank 登錄號MK749665～73，表1)，其中55 條mt-COI 序列定義了51 種單倍型。mtCOI 序列長658 bp，A、T、G、C 含量分別為22.4%、44.3%、19.0% 和14.3%，A+T 的含量明顯高于G+C 的含量。mtCOI 序列共有變異位點154 個，簡約信息位點113 個。

對18S rRNA 基因序列兩端做截齊處理后，序列長1 728～1 740 bp，存在兩段分別為8 bp（TTTCGGGG）和5 bp（TGAAG）的插入/缺失片段，以及1 個堿基（T）的插入/缺失位點。A、T、G、C 含量分別為24.0%、25.2%、27.7%和23.2%，A+T 和G+C 的含量大體相當。3 個形態(tài)種均分別測定了3 個個體的18S rRNA 基因序列，其中尖棘長角螺和膨凸長角螺在種內沒有變異位點，矛頭長角螺在種內有3 個變異位點。

3.3 系統(tǒng)發(fā)育和譜系地理結構

mtCOI 和核18S rRNA 基因的BI 樹和NJ 樹有大體一致的拓撲結構，本文只顯示BI 樹(圖2，圖3)。mtCOI 基因系統(tǒng)分析顯示，矛頭長角螺和尖棘長角螺存在明顯的譜系地理結構，分別形成4 個明顯分化的支系；膨凸長角螺(含印度洋、紅海和西太平洋樣品)和曲形長角螺(C. recurva，含南大西洋、北大西洋和南大洋樣品)形成單系群，無地理遺傳分化。矛頭長角螺的4 個支系(A–D)均獲得較高的支持率(PP≥95%，BS≥90%)，本文測序的標本分屬2 個不同的支系(A 和C)。支系A 基本上呈全球分布，支系B 目前僅見于大西洋(含加勒比海)和印度洋，支系C 目前僅見于西太平洋和東印度洋，支系D(C. pyramidata antarctica)目前僅見于南大洋的高緯度地區(qū)(圖4)。

尖棘長角螺的4 個支系(E–H)也獲得較高的支持率(PP≥99%，BS＞85%)，本文測序的標本分屬支系E 和F。不同支系的地域性十分明顯，支系E 分布于呂宋海峽，支系F 分布于西太平洋和印度洋，支系G分布于大西洋，支系H 分布于南大洋(圖5)。

18S rRNA 基因系統(tǒng)樹中(圖3)，矛頭長角螺的支系A、B 和C 形成一個獨立的分支，與支系D 區(qū)分開來。膨凸長角螺和尖棘長角螺的個體形成單系群，尖棘長角螺的支系E 和F 在18S rRNA 基因系統(tǒng)樹中無法得到顯現。

3.4 遺傳距離分析

K2P 遺傳距離分析表明(因C. pyramidata（GQ861823）、C. recurva（MF048923）和Clio sp.（FJ876887）可能存在種類誤定或序列太少，未參與分析)，形態(tài)種的種內遺傳距離在0～0.089 之間，種間遺傳距離在0.070～0.185 之間，兩者發(fā)生較大范圍重疊(表2)。矛頭長角螺支系內的遺傳距離為0～0.026，支系間的遺傳距離為0.031～0.089；尖棘長角螺支系內的遺傳距離為0～0.014，支系間的遺傳距離為0.048～0.079。

3.5 MOTUs 估計

ABGD 比較穩(wěn)定的初始劃分結果與GMYC 和3%K2P 遺傳距離閾值的MOTUs 估計結果完全相同(圖2, GMYC 和ABGD 原始劃分結果未給出)，矛頭長角螺和尖棘長角螺的4 個支系均被劃分為獨立的MOTU。

4 討論

4.1 長角螺屬的分類學

圖 1 長角螺屬種類的貝殼形態(tài)(比例尺=5 mm)Fig. 1 Shell morphology of Clio species (scale bars=5 mm)

由于長角螺外殼薄脆，在采樣過程中極易造成破損，相當部分的標本為非完整的個體，如尖棘長角螺發(fā)達的棘刺很難完整保留(圖1)，給形態(tài)鑒定帶來很大的難度。外形上的相似性，也難以區(qū)分不同大小的個體是種間差異還是同種不同發(fā)育階段的個體，如矛頭長角螺支系C 中2 個不同大小的個體在形態(tài)上有較大的差異(圖2)，支系A 和C 的成體在形態(tài)上則難以區(qū)分。張福綏[8]描述了中國近海長角螺屬3 個種(含變種)，其中包括一新變種小尾長角螺(C. pyramidata var. microcaudata，原文Euclio pyramidata var. microcaudata)，該變種僅采集到1 個個體。該變種能否被視為一個有效的分類單元，尚需進一步的研究證實。我們檢視了采集到的大量長角螺標本，未發(fā)現類似個體。新幾內亞島以北海域采集到的尖棘長角螺與呂宋海峽分布的尖棘長角螺在形態(tài)上有一定的差異，且兩者的mtCOI 基因序列也有明顯分化。然而由于前者僅采集到一個不太完整的標本，尚無法判斷這種形態(tài)差異是種間的差異還是同種個體間的差異。

相比膨凸長角螺和曲形長角螺兩個種的種內遺傳距離，矛頭長角螺和尖棘長角螺兩個形態(tài)種各支系間的遺傳距離已經達到種間的分化水平。矛頭長角螺的支系D(C. pyramidata antarctica)與其他3 個支系在18S rRNA 基因序列上也存在明顯的差異，并在系統(tǒng)樹上與其他支系區(qū)別開來。因此，C. pyramidata antarctica 這一亞種應提升為種，該亞種(或變種)的形態(tài)[2,26]也明顯有別于典型的矛頭長角螺，前者明顯修長。18S rRNA 基因系統(tǒng)樹并不支持其他支系的劃分，這可能是由于18S rRNA 基因較為保守的緣故。矛頭長角螺和尖棘長角螺是否為隱存種還需要進一步研究的證實(如ITS 序列)。

4.2 長角螺屬的譜系地理學

圖 2 基于mtCOI 基因構建的長角螺屬貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Bayesian inference phylogenetic tree of genus Clio based on mtCOI gene sequences

海洋生物，無論是終生浮游生物還是其他海洋生物的浮游幼體，可以借助洋流進行擴散，開放的海洋環(huán)境也沒有阻礙基因交流的屏障，因而通常認為海洋生物會在很大的地理尺度內表現出較低的遺傳分化[27]。目前，越來越多的證據改變了我們這種傳統(tǒng)的觀點，即使在開放海域，海洋學和生態(tài)學過程也會對海洋生物的基因流產生阻礙作用，從而導致在不同尺度上產生遺傳分化[28–30]。

圖 3 基于18S rRNA 基因構建的長角螺屬貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Bayesian inference phylogenetic tree of genus Clio based on nuclear18S rRNA gene sequences

圖 4 矛頭長角螺4 個mtCOI 支系的地理分布Fig. 4 Geographical distributions of four mtCOI lineages for C. pyramidata

結合本文和數據庫中已有的數據分析表明，矛頭長角螺和尖棘長角螺存在較為明顯的地理群體遺傳分化，中國海及其鄰近海域可能只有矛頭長角螺支系A 的存在，分布于呂宋海峽的尖棘長角螺支系E為一新的譜系分支。從全球尺度來講，尖棘長角螺的采樣范圍和采樣數量較為有限，其譜系地理結構還需更廣泛的采樣進行研究。南海–呂宋海峽及其周邊海域與新幾內亞島以北海域具有完全不同的長角螺種類和支系組成，除分布著矛頭長角螺和尖棘長角螺完全不同的支系外，新幾內亞島以北海域分布的膨凸長角螺在南海–呂宋海峽及其周邊海域(10 余航次調查)未有發(fā)現。北赤道流到達菲律賓群島東岸后發(fā)生分叉，形成南、北流向的棉蘭老流和黑潮[31]，相反的流向可能阻礙了兩海域間的物種擴布及群體間的基因交流?？梢酝茰y，不同遺傳背景的浮游軟體動物群體可能對海洋酸化等環(huán)境變化產生不一樣的響應[32]。

4.3 海洋生物的DNA 條形碼鑒定需要建立本地數據庫

我們分析了印度洋和西北太平洋海域數百個浮游軟體動物的mtCOI 基因序列和核18S、28S 基因序列，并通過與其他海域序列的比較，發(fā)現浮游軟體動物中普遍存在mtCOI 基因的地理遺傳分化現象(結果另文發(fā)表)。如按照DNA 條形碼遺傳距離的10 倍法則[33]或3%閾值[12]標準，這些具有地理遺傳分化的形態(tài)種會被認為存在隱存種。

DNA 條形碼技術是一種基于種內及種間DNA序列變異程度的距離法(Distance-Based Method)，它要求種間遺傳距離明顯大于種內遺傳距離，形成“條形碼間隙(Barcoding Gap)”[34–35]。然而，DNA 條形碼技術也受到一些質疑和批判。如單獨的線粒體DNA 序列不足以識別物種，因為這種遺傳分化并非是劃定物種界限的必要條件[36–37]；“條形碼間隙”是人為的不充分取樣造成的[38]。顯然，取樣范圍的擴大(全球取樣)、測序樣本數量的增加會使種內遺傳距離增大，測序物種數量的增加會使種間遺傳距離縮小。取樣數量和地理尺度的大小有時會顯著影響DNA 條形碼的分析結果，甚至可能得出錯誤的結論。單純依據mtCOI 基因序列來揭示隱存種，證據可能不夠充分，還需要核基因證據的支持。

表 2 基于mtCOI 基因的長角螺屬4 個形態(tài)種的K2P 遺傳距離Table 2 The K2P distances of four Clio morphospecies based on mtCOI sequences

圖 5 尖棘長角螺4 個mtCOI 支系的地理分布Fig. 5 Geographical distributions of four mtCOI lineages for C. cuspidata

形態(tài)種內的遺傳分化廣泛存在于海洋動物中，除浮游軟體動物[16]外，還有如水母[39–40]、甲殼類[41–43]、毛顎類[44]和魚類[45]等。這種遺傳分化不僅存在于大的地理尺度，也存在于小的區(qū)域尺度。

現有公共數據庫(如GenBank、BOLD 等)中的參考序列缺乏相對應的物種形態(tài)照片，并且數據庫中還存在誤定的種類。來自不同海域的序列，即使與數據庫中已有的序列屬于同一形態(tài)種，由于不同地理群體的遺傳分化，仍然無法通過DNA 條形碼序列的比對來定種。如本文測序的呂宋海峽尖棘長角螺序列，無法在數據庫中與已有的其他海域的尖棘長角螺序列形成高精度匹配。因此，建立我國海域本地物種的DNA 條形碼數據庫是極為必要的，且測序個體應有足夠的數量并覆蓋較大的地理尺度。

致謝：中國科學院南海海洋研究所周林濱博士采集了印度洋樣品，李開枝研究員在實驗過程中給予了幫助和支持，謹致謝忱。