王浩，易鴛鴦，古麗米熱·對山巴依，樊慶庚，蘇艷

·動物及獸醫(yī)生物技術·

馬流產(chǎn)沙門菌重組鞭毛蛋白FliC和FljB免疫原性比較

王浩，易鴛鴦，古麗米熱·對山巴依，樊慶庚，蘇艷

新疆農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，新疆 烏魯木齊 830052

為評價與比較馬流產(chǎn)沙門菌 () 2種不同鞭毛蛋白FliC (Flagellin C) 和FljB (Flagellin B) 的免疫原性，為進一步利用這兩種蛋白奠定實驗基礎，本研究誘導表達及純化FliC和FljB蛋白，將純化后的蛋白分別免疫小鼠，對免疫后小鼠的抗體水平、滴度及抗體亞型進行檢測，攻擊小鼠后進行免疫相關受體檢測及病理組織學觀察。結果顯示，成功誘導表達了重組蛋白FliC和FljB，純化后蛋白的相對分子量分別為52 kDa和42 kDa。兩種蛋白分別免疫小鼠，產(chǎn)生較高水平的特異性抗體IgG，F(xiàn)ljB免疫組抗體水平高于FliC免疫組，且抗體亞型以IgG1為主。FljB免疫組攻擊保護率為87.5%，高于FliC免疫組的75%，病理組織學及臟器荷菌數(shù)檢測結果顯示，F(xiàn)ljB免疫組效果優(yōu)于FliC免疫組；FljB免疫組誘導TLR2、TLR4、MHC-I、TCR (T細胞抗原受體) 的水平均高于FliC免疫組。該結果表明，F(xiàn)ljB免疫組誘導小鼠免疫應答的水平高于FliC免疫組。

馬流產(chǎn)沙門菌，F(xiàn)liC蛋白，F(xiàn)ljB蛋白，免疫原性

馬流產(chǎn)沙門菌可引起懷孕母馬流產(chǎn)，還可引起初生幼駒敗血癥或局部炎癥、公馬鬐甲炎和睪丸炎，其感染可給養(yǎng)馬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[1]。鞭毛不僅是該菌的運動器官，還直接影響其致病性及對宿主細胞的黏附性和侵襲性。和基因分別編碼沙門菌鞭毛蛋白的第一相和第二相鞭毛抗原，這2種基因交替表達，構成鞭毛的相變換。大腸桿菌LF82菌株在缺失編碼蛋白的基因后，喪失了對腸上皮細胞的黏附和侵襲功能[2]。

天然的抗鞭毛免疫應答可對機體起到保護作用[3]。遲緩愛德華重組菌[4]及鼠傷寒沙門菌重組鞭毛蛋白FliC免疫小鼠，可誘導其產(chǎn)生較高水平的特異性抗體[5]。研究表明鞭毛蛋白還具有免疫增強作用，促進吞噬細胞的吞噬作用，參與誘導分泌前炎癥細胞因子，介導激活T細胞和B細胞免疫應答[6-8]。

以往的研究主要集中于鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌及其他細菌的鞭毛蛋白，且大多集中在一種單相鞭毛蛋白上，馬流產(chǎn)沙門菌鞭毛蛋白及其FliC和FljB兩相不同鞭毛蛋白之間的免疫生物學特性的比較和分析研究報道較少。本研究表達純化了馬流產(chǎn)沙門菌FliC和FljB蛋白，用其免疫小鼠后，檢測血清抗體水平、抗體亞型及相關免疫分子表達水平，檢測了攻擊保護率、攻擊后的病理組織學變化及不同臟器的荷菌量，綜合比較分析了重組蛋白FliC與FljB的免疫生物學特性的差異。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

馬流產(chǎn)沙門菌新疆分離株XJMS-97由新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院微生物實驗室分離并保存，分別含重組質(zhì)粒pET28a-FliC[9]和pET28a-FljB[10]的大腸桿菌BL21(DE3)，由新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院微生物實驗室構建并保存。

1.2 主要試劑

中等分子量蛋白標準購自大連寶生物工程有限公司；HRP-IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司；TMB顯色液購自北京索萊寶科技有限公司；QuantiNovaTMSYBR?Green PCR Kit購自QIAGEN公司；其他相關化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 實驗動物

實驗用SPF級6周齡18?25 g雌性昆明鼠共計30只，購自新疆維吾爾自治區(qū)疾病預防控制中心實驗動物研究中心。

1.4 重組蛋白FliC、FljB的誘導表達及純化

將含有重組表達質(zhì)粒pET28a-FliC、pET28a-FljB的大腸桿菌BL21(DE3)，分別接種至含有50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至600達到0.5–0.6時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進行誘導。收集的菌體經(jīng)超聲破碎后，取其上清液加入Ni-NTA親和層析柱，用不同濃度咪唑?qū)δ康牡鞍走M行洗脫，純化后的蛋白用SDS-PAGE進行分析。

1.5 小鼠免疫

將30只小鼠隨機分為4組，每組8只，分別為FliC免疫組、FljB免疫組和PBS對照組。將純化后的pET-28a-FliC、pET28a-FljB重組蛋白與等體積弗氏佐劑混勻，經(jīng)背部皮下多點注射免疫小鼠，每只0.5 mL (100 μg/mL)，每隔2周免疫1次，共免疫2次。分別于初次免疫后0、14、35、42 d采血，分離血清?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 免疫小鼠抗體水平、效價及抗體亞型的檢測

以純化后的FliC、FljB重組蛋白包被酶標板，100 ng/孔，過夜包被。37 ℃封閉2 h，PBST洗滌3次，將各組小鼠免疫血清按照1∶300、1∶900、1∶2 700等系列梯度稀釋，加入酶標板中，37 ℃作用1 h，加1∶5 000稀釋HRP標記的山羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3作為二抗，100 μL/孔，37 ℃作用30 min，PBST洗滌5次，用TMB顯色，終止反應，測定450值。

1.7 免疫FliC及FljB蛋白對該菌致死性感染的評估

初次免疫后42 d，用菌株XJMS-97分別對FliC免疫組、FljB免疫組和PBS對照組小鼠進行攻擊，每只小鼠腹腔接種攻擊菌2×108CFU，攻擊后連續(xù)14 d觀察并記錄小鼠的發(fā)病和死亡情況，并計算保護率。

1.8 不同臟器定殖細菌的檢測

攻擊后第3天，處死小鼠取肺、肝、脾和腎，加入滅菌PBS進行充分勻漿，1∶10梯度稀釋后取100 μL涂布于THB固體培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)；對培養(yǎng)細菌計數(shù)。

1.9 病理組織學觀察

攻擊后第10天，分別取各試驗組存活小鼠肝、脾、肺和腎組織置于10%福爾馬林溶液中固定，制作石蠟切片，H.E.染色，觀察各臟器的病理組織學變化。

1.10 免疫小鼠攻擊后細胞因子的檢測

攻擊后第3天，取各免疫組脾臟，提取細胞總RNA，以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，根據(jù)GenBank中TLR2、TLR4、TCR、MHC-I、β-Act的基因序列，使用Primer Premier 5.0設計實時熒光定量PCR檢測引物，由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成 (表1)。按照以下參數(shù)進行qPCR擴增。反應體系為：2×SYBR Select Master Mix 10 μL，正向引物0.25 μL，反向引物0.25 μL，QN ROX Reference Dye 2 μL，模板1 μL，ddH2O 7.5 μL。反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。對PCR產(chǎn)物進行熔解曲線分析，檢測免疫相關因子的表達，計算目的基因的拷貝。

1.11 統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0分析軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

表1 實時熒光定量PCR的引物序列

2 結果與分析

2.1 重組蛋白的表達及純化

pET28a-FliC和pET28a-FljB重組菌經(jīng)誘導表達后經(jīng)SDS-PAGE，分別在52和42 kDa左右處出現(xiàn)明顯的蛋白條帶 (圖1A和1B)，與預期值相符，表明重組目的蛋白成功誘導表達。

2.2 免疫小鼠的抗體檢測

2.2.1 抗體水平及效價的檢測

采用間接ELISA法，對免疫后0、14、35、42 d的抗體水平進行檢測，檢測結果顯示，各免疫組在免疫后抗體水平均升高，第二次免疫后，抗體水平顯著升高，F(xiàn)ljB免疫組的抗體水平高于FliC免疫組和PBS對照組 (圖2A)?？贵w效價檢測結果顯示，F(xiàn)liC和FljB免疫組在第二次免疫后14 d，免疫抗體效價均可達到1∶72 900 (圖2B)。

2.2.2 抗體亞型的檢測

第二次免疫后14 d，小鼠血清中特異性抗體亞型的檢測結果顯示，F(xiàn)liC和FljB免疫組小鼠均產(chǎn)生了較高水平的IgG抗體，且產(chǎn)生的特異性抗體主要以IgG1亞型為主，F(xiàn)ljB免疫組IgG1抗體水平高于FliC免疫組 (圖3)。

2.3 小鼠免疫攻擊后體內(nèi)免疫相關分子表達水平的檢測

攻擊后3 d對免疫小鼠免疫相關分子測定結果顯示，不同免疫組各細胞因子產(chǎn)生情況不同，與對照組相比各免疫組TLR2、TLR4、TCR、MHC-Ⅰ水平均明顯升高，且FljB免疫組4種免疫相關分子的表達水平均明顯高于FliC免疫組 (圖4)。

圖1 重組蛋白FliC (A) 和FljB (B) 的SDS-PAGE分析

圖2 小鼠血清中特異性抗體水平和抗體滴度檢測

圖3 免疫小鼠血清抗體亞型水平檢測結果

圖4 熒光定量PCR檢測免疫相關分子的表達水平

2.4 保護率檢測

第二次免疫后14 d，用XJMS-97對各免疫組和PBS對照組進行攻擊保護率測試，觀察小鼠死亡情況。結果顯示，F(xiàn)ljB免疫組的存活率可達87.5%，F(xiàn)liC免疫組的存活率可達75%，PBS對照組小鼠在攻擊后2 d內(nèi)全部死亡(圖5A)。用.攻擊小鼠后，體重變化結果顯示，F(xiàn)liC和FljB免疫組小鼠體重均在3 d后體重開始回升，5 d后體重基本恢復到攻擊前正常范圍(圖5B)。

2.5 病理組織學觀察

2.5.1 各實驗組小鼠肺臟病理組織學觀察結果

肺臟病理組織學觀察結果顯示(圖6)，與未攻擊對照組相比，PBS對照組攻擊死亡小鼠肺臟出血，肺泡間質(zhì)增厚，肺泡間可見大量的炎性細胞浸潤。FliC免疫組出現(xiàn)組織出血、肺間質(zhì)增厚，F(xiàn)ljB免疫組小鼠病理損傷程度較FliC免疫組輕，無出血。

2.5.2 各實驗組小鼠脾臟病理組織學觀察結果

脾臟病理組織學觀察結果顯示(圖7)，與對照組相比，PBS對照組小鼠攻擊后脾臟可見脾小體周圍出現(xiàn)大量出血、淤血。FliC與FljB組小鼠脾臟出現(xiàn)輕微的出血、充血，損傷程度相對較小。

圖6 小鼠肺臟病理組織學觀察結果(H.E染色)

圖7 小鼠脾臟病理組織學觀察結果(H.E.染色)

2.5.3 各實驗組小鼠肝臟病理組織學觀察結果

肝臟病理組織學觀察結果顯示 (圖8)，與對照組相比，PBS對照組攻擊后小鼠肝臟出現(xiàn)淤血，肝間質(zhì)充血，大量炎性細胞浸潤。FliC免疫組腎間質(zhì)出現(xiàn)輕微出血、淤血，腎小球髓質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)少量淤血，而FljB免疫組出血不明顯，與正常小鼠肝臟組織相似。

圖8 小鼠肝臟病理組織學觀察結果 (H.E染色)

2.5.4 各實驗組小鼠腎臟病理組織學觀察結果

腎臟病理組織學觀察結果顯示(圖9)，與對照組相比，PBS對照組攻擊后小鼠腎髓質(zhì)與腎小管中出現(xiàn)大量淤血，腎間質(zhì)充血，大量炎性細胞浸潤。FliC免疫組腎臟組織有明顯病變，腎間質(zhì)出血、淤血，腎小球髓質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)少量淤血，而FljB免疫組未見明顯病變，與正常小鼠腎臟組織相似。

圖9 小鼠腎臟病理組織學觀察結果(H.E染色)

圖10 小鼠臟器荷菌量檢測結果

2.6 荷菌數(shù)檢測結果

免疫小鼠攻擊后，檢測小鼠肺臟、脾臟、腎臟和肝臟組織荷菌數(shù)。結果表明，各免疫組小鼠肺臟、脾臟、腎臟和肝臟組織荷菌數(shù)均顯著低于PBS對照組，F(xiàn)ljB免疫組小鼠肝臟、脾臟、肺臟、腎臟組織荷菌數(shù)明顯低于FliC免疫組 (圖10)。

3 討論

的鞭毛蛋白是一種強有力的先天和特異性免疫的啟動劑，可在該菌的運動、黏附及侵襲宿主細胞等方面發(fā)揮重要作用[11]。研究顯示，鞭毛蛋白可誘導機體產(chǎn)生先性和被動免疫應答從而增強抗原特異性淋巴細胞對抗病原體的能力[12-14]。此外細菌鞭毛蛋白可以促進樹突狀細胞成熟增加抗原的遞呈效率，對機體免疫應答起到增強作用[15]。

史冰田等[16]證明了用誘導表達及純化后的腸炎沙門菌FliC重組蛋白免疫SPF雞，其抗體效價達到了1∶12 800，產(chǎn)生了較高水平的特異性抗體。本研究純化的第一相和第二相鞭毛蛋白FliC和FljB，免疫小鼠后均能誘導小鼠產(chǎn)生較高水平的特異性抗體。首次免疫后42 d，各免疫組小鼠血清抗體效價均達到了1∶72 900，抗體亞型主要以IgG1為主，這與趙亞南等[17]用馬流產(chǎn)沙門菌FliC蛋白免疫小鼠后，可誘導小鼠產(chǎn)生較高水平的IgG1抗體研究結果一致。

TLR家族在啟動先天免疫應答中占據(jù)重要的地位，TLR2和TLR4是TLR家族成員，通過對病原微生物及其產(chǎn)物的病原相關分子模式識別介導天然免疫反應。TLR2是革蘭氏陽性菌脂蛋白的主要識別受體，TLR4僅識別革蘭氏陰性菌細胞壁成分脂多糖。TLR2和TLR4在抗細菌感染中起著核心作用，在機體抵御細菌感染引發(fā)炎癥反應發(fā)生過程中TLR2和TLR4可降低動物機體炎癥反應發(fā)生的程度[18]。TLR5參與識別革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的鞭毛蛋白[19]。MHC-I類分子在體內(nèi)表達主要向CD8+T細胞的T細胞受體呈遞抗原，并激活T細胞[20]。T細胞受體 (TCR) 的多樣性是機體能對多種抗原進行識別和發(fā)揮作用的前提，TCR發(fā)揮作用時一般與抗原肽及MHC分子同時作用。本研究對免疫后小鼠體內(nèi)相關免疫分子檢測結果顯示，各免疫組小鼠TLR2、TLR4、TCR和MHC-I等免疫相關分子表達水平均有明顯升高，且FljB免疫組4種免疫相關分子的表達量顯著高于FliC免疫組 (<0.05)，各免疫組TLR2和TLR4表達量顯著升高，TCR和MHC-I表達水平也有升高。

本研究對小鼠的攻擊保護率結果顯示，F(xiàn)ljB和FliC免疫組攻擊保護率分別為75%和87.5%。病理組織學觀察結果表明，F(xiàn)ljB免疫組各臟器出血、水腫、炎性細胞浸潤和組織細胞變性等病理組織變化顯著少于FliC免疫組。Eom等[21]研究結果表明，對免疫過鼠傷寒沙門菌重組鞭毛蛋白FliC和FljB小鼠攻擊后，脾臟和肝臟的荷菌量明顯低于對照組。本研究對小鼠不同臟器的荷菌量檢測結果表明，F(xiàn)ljB免疫組小鼠各臟器的荷菌量明顯低于FliC免疫組。

綜上所述，兩相重組鞭毛蛋白FliC和FljB，能夠刺激和誘導小鼠，產(chǎn)生特異性抗體，誘導TLR4、TLR2、TCR及MHC-I分子的表達，減少不同臟器的菌體載量以及保護小鼠抵抗攻擊，此外證明了FljB蛋白在免疫原性和保護率方面的效果優(yōu)于FliC蛋白，該結果為我們深入認識鞭毛蛋白的感染和免疫特性，進一步利用其進行診斷及疫苗的研究提供了實驗基礎。

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Comparison of immunogenicity between recombinant flagellins C and B of

Hao Wang, Yuanyang Yi, Duishanbayi·Gulimire, Qinggeng Fan, and Yan Su

,,830052,,

To evaluate and compare of the immunogenicity differences of flagellins FliC and FljB ofand lay the experimental foundation for the further utilization of the two recombinant proteins, FliC and FljB recombinant proteins were induced, expressed and purified. The purified FliC and FljB were used to immunize mice separately. The antibody level, titer and subtype of mice serum were detected after immunization. Immune-related receptors and histopathological changes were observed in immunized mice after challenged. The recombinant proteins FliC and FljB were successfully induced and expressed. Proteins of about 52 kDa and 42 kDa were purified. High levels of specific IgG antibodies were induced in mice immunized with these two proteins, the antibody level of FljB-immunized group was higher than that of FliC-immunized group, and IgG1 was the dominant subtype of antibody. The challenge protection rate of the FljB-immunized group was 87.5%, higher than that of FliC immunized group. Bacterial loads and observation pathological of FljB-immunized group were better than that of FliC immunized group, the levels of TCR2, TCR4, MHC-I and TCR induced by FljB-immunized group were higher than those of FliC-immunized group. The of immune response induced by FljB group was better than that of FliC group.

, flagellin C, flagellin B, immunogenicity

王浩, 易鴛鴦, 古麗米熱·對山巴依, 等. 馬流產(chǎn)沙門菌重組鞭毛蛋白FliC和FljB免疫原性比較. 生物工程學報, 2020, 36(1): 57–66.

Wang H, Yi YY, Gulimire·Duishanbayi, et al. Comparison of immunogenicity between recombinant flagellins C and B of. Chin J Biotech, 2020, 36(1): 57–66.

April 13, 2019;

July29, 2019

Supported by: University Scientific Research Projects of Xinjiang Uygur Autonomous Region (No. XJEDU2018I009).

Yan Su. Tel: +86-991-8762704; E-mail:2006au@163.com

10.13345/j.cjb.190135

新疆維吾爾自治區(qū)高?？蒲杏媱?(No. XJEDU2018I009) 資助。

2019-08-27

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20190827.0936.001.html

(本文責編 陳宏宇)