陳如章，王茜桐，李燕晨，高基民

·醫(yī)藥生物技術(shù)·

人CS1-Fc融合蛋白的真核表達(dá)、蛋白純化及生物學(xué)效應(yīng)鑒定

陳如章，王茜桐，李燕晨，高基民

溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035

人信號(hào)淋巴細(xì)胞激活分子F7 (SLAMF7/CS1) 是一種細(xì)胞表面糖蛋白，在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中高度表達(dá)。已有研究表明CS1是多發(fā)性骨髓瘤較為靈敏且特異的生物標(biāo)志物。CAR-T細(xì)胞免疫療法是治療多發(fā)性骨髓瘤的新方法，其中CS1 CAR-T細(xì)胞免疫療法針對(duì)復(fù)發(fā)性難治性多發(fā)性骨髓瘤有較好的療效。為了檢測(cè)CS1 CAR-T細(xì)胞上CS1 CAR的表達(dá)效率和探尋CAR-T細(xì)胞免疫療法的輔助手段，文中制備了一種CS1-Fc融合蛋白。首先利用PCR技術(shù)從已有質(zhì)粒中擴(kuò)增得到CS1的胞外段序列，再通過重疊延伸PCR與人IgG1-Fc段相連。將重組片段連接至pMH3真核表達(dá)載體上，經(jīng)酶切鑒定和DNA測(cè)序后，將重組質(zhì)粒pMH3-CS1-Fc-his轉(zhuǎn)染至中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞 (CHO-S)。經(jīng)G418加壓篩選和流式細(xì)胞術(shù)鑒定，證實(shí)CS1-Fc融合蛋白在CHO-S細(xì)胞中獲得了表達(dá)。利用鎳柱對(duì)CS1-Fc融合蛋白進(jìn)行純化，經(jīng)Western blotting鑒定，融合蛋白的分子量約為70 kDa。流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞計(jì)數(shù)分析結(jié)果顯示，CS1-Fc融合蛋白能有效檢測(cè)CS1 CAR的表達(dá)效率，證實(shí)了CS1-Fc融合蛋白對(duì)CS1 CAR-T細(xì)胞具有活化、促增殖及促分泌細(xì)胞因子的作用。本研究結(jié)果為多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞免疫治療CAR-T細(xì)胞的體外檢測(cè)和效能強(qiáng)化奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

人信號(hào)淋巴細(xì)胞激活分子F7 (SLAMF7/CS1)，CS1-Fc融合蛋白，真核表達(dá)，嵌合抗原受體T細(xì)胞，多發(fā)性骨髓瘤

多發(fā)性骨髓瘤 (Multiple myeloma，MM) 是一種惡性漿細(xì)胞病，其特征在于骨髓中的惡性漿細(xì)胞異常增生以及單克隆免疫球蛋白或輕鏈 (M蛋白) 過度生成[1]。在美國(guó)，每年每100 000人發(fā)病約5例，多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病率約占所有血液系統(tǒng)惡性腫瘤的10%[2]。在眾多的免疫療法中，嵌合抗原受體T細(xì)胞 (Chimeric antigen receptor T cells，CAR-T) 免疫療法已經(jīng)發(fā)展成為一種潛在的抗癌療法，特別是在復(fù)發(fā)/難治性多發(fā)性骨髓瘤中，它表現(xiàn)出很高的緩解率和無進(jìn)展生存期的延長(zhǎng)[3-5]。嵌合抗原受體 (Chimeric antigen receptors，CARs) 是一種跨膜融合蛋白，由位于胞外的抗原識(shí)別域和位于胞內(nèi)的T細(xì)胞活化域及連接兩者的鉸鏈區(qū)三部分組成。CAR-T細(xì)胞是經(jīng)過基因修飾表達(dá)CARs的T細(xì)胞[6]。CAR-T細(xì)胞與單克隆抗體 (mAbs) 相同點(diǎn)是兩者均是針對(duì)特定的細(xì)胞表面抗原。理想情況下，它應(yīng)僅在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)而不在健康組織中表達(dá)[7]。與單克隆抗體不同的是，CAR-T細(xì)胞不僅能夠殺死靶細(xì)胞，而且它可以在患者體內(nèi)持續(xù)存在，并誘導(dǎo)發(fā)生針對(duì)靶抗原的持久免疫應(yīng)答[4,8]。

CS1 (CD2 subset 1) 也稱為信號(hào)淋巴細(xì)胞活化家族成員7 (Signalling lymphocytic activation molecule F7，SLAMF7)，它是一種細(xì)胞表面糖蛋白，在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中高度表達(dá)，自然殺傷細(xì)胞 (NK) 表達(dá)較低，但在正常組織中不表達(dá)[9-10]。這使其成為多發(fā)性骨髓瘤免疫治療的理想靶點(diǎn)。美國(guó)希望之城醫(yī)療中心Wang等研究結(jié)果證實(shí)在小鼠模型中CS1 CAR-T細(xì)胞具有有效的抗腫瘤活性。在體外試驗(yàn)中，加入來那度胺可通過共刺激效應(yīng)提高CS1 CAR-T細(xì)胞的免疫功能。在體內(nèi)試驗(yàn)中，來那度胺可提高CS1 CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性及持久性[11]。在體外殺傷原發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，MM患者和健康人的CS1 CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出高效的殺傷活性。此外，在異種移植小鼠模型中，CS1 CAR-T細(xì)胞能顯著抑制髓質(zhì)和髓外骨髓瘤。重要的是，CS1 CAR-T細(xì)胞不僅可以特異性識(shí)別多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，同時(shí)還可以保留CS1低表達(dá)的免疫細(xì)胞[12]。

Fc-融合蛋白 (Fc-fusion proteins) 是指利用基因工程技術(shù)將免疫球蛋白 (IgG、IgA等) 的可結(jié)晶段 (Fragment crystallizable，F(xiàn)c) 與某種具有生物學(xué)活性的功能蛋白分子融合而產(chǎn)生的新型蛋白[13]。融合蛋白的Fc段可延長(zhǎng)功能蛋白在血漿內(nèi)的半衰期、提高分子的穩(wěn)定性，且可與細(xì)胞表面的Fc受體特異性結(jié)合，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能[14]。據(jù)報(bào)道，研究人員制備了一種癌胚抗原-Fc融合蛋白 (CEA-Fc)，發(fā)現(xiàn)它可用于檢測(cè)和激活CEA CAR-T細(xì)胞[15]。Ag-Fc融合蛋白亦可用于檢測(cè)CAR-T細(xì)胞表面CARs表達(dá)以及用作選擇性離體擴(kuò)增劑。對(duì)于CAR-T細(xì)胞免疫療法，獲得大規(guī)模CAR-T細(xì)胞 (多達(dá)1011個(gè)細(xì)胞) 至關(guān)重要。通過用固定的Ag-Fc選擇性激活CAR-T細(xì)胞，可以誘導(dǎo)細(xì)胞擴(kuò)增[15]。組氨酸標(biāo)簽 (His-tag) 被廣泛用作融合標(biāo)簽，憑借此組氨酸肽段與二價(jià)金屬離子(鎳、鋅等) 的螯合作用，便于用金屬螯合親和層析純化蛋白質(zhì)，也可以用針對(duì)組氨酸肽段的抗體來檢測(cè)該融合蛋白[16]。

根據(jù)Ag-Fc融合蛋白和His-tag標(biāo)簽的特性，我們計(jì)劃制備一種CS1-Fc-his融合蛋白，并驗(yàn)證它對(duì)CS1 CAR-T細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。本研究擬通過構(gòu)建表達(dá)CS1-Fc融合蛋白的CHO-S細(xì)胞獲得CS1-Fc融合蛋白，初步驗(yàn)證CS1-Fc融合蛋白對(duì)CS1 CAR的生物學(xué)效應(yīng)，為CS1 CAR-T細(xì)胞的檢測(cè)提供有效的方法，同時(shí)也為增強(qiáng)CS1 CAR-T細(xì)胞的效能及擴(kuò)增打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

pMH3真核表達(dá)質(zhì)粒和CHO-S細(xì)胞 (中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞) 由本實(shí)驗(yàn)室保存；人CS1 DNA片段由韓家淮實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；人IgG1 Fc片段由本實(shí)驗(yàn)室保存；CS1 CAR慢病毒濃縮液由本實(shí)驗(yàn)室制備；Trans5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海桑尼生物技術(shù)公司；PCR試劑、膠回收試劑盒和DNA marker購(gòu)自Genstar 公司；限制性核酸內(nèi)切酶RⅠ和Ⅰ購(gòu)自NEB公司；質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；TAE、氨芐青霉素 (Ampicillin) 和考馬斯快速染色液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；引物合成及DNA序列測(cè)序均由上海桑尼生物技術(shù)公司完成；Ni-NTA柱填料購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司；Lip2000和G418購(gòu)自Thermo公司；Bio-CS1 Protein購(gòu)自ACRO公司；抗人CS1和抗His-tag單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司；APC-SA、FITC-抗人IgG1 Fc、PB-抗人CD69、PB-Live/Dead和APC-抗人CS1等流式抗體購(gòu)自BioLegend公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

文中所用引物見表1。

1.2.2 重組質(zhì)粒pMH3-CS1-linker-FC-his的構(gòu)建

將PCR擴(kuò)增得到的CS1胞外端與Fc片段 (尾部加His-tag) 進(jìn)行重疊延伸PCR，用限制性內(nèi)切酶RⅠ和Ⅰ對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的重組質(zhì)粒pMH3-CD19進(jìn)行雙酶切，回收pMH3載體。將產(chǎn)物純化得到的CS1-linker-Fc-his基因擴(kuò)增產(chǎn)物與pMH3載體連接，將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Trans5α感受態(tài)大腸桿菌，挑選陽性克隆，經(jīng)質(zhì)粒提取獲得重組質(zhì)粒pMH3-CS1-linker-Fc-his。

表1 試驗(yàn)所用引物

Note: underlined sequences are restriction enzyme sites.

1.2.3 融合蛋白表達(dá)細(xì)胞CS1-Fc-CHO-S的構(gòu)建及篩選

按照Lip2000說明書將重組質(zhì)粒pMH3-CS1- linker-Fc-his轉(zhuǎn)染至CHO-S細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后更換含遺傳霉素 (G418，濃度為1 mg/mL)、不含其他抗生素的DMEM/F12培養(yǎng)基，進(jìn)行加壓篩選，同時(shí)用未轉(zhuǎn)染的CHO-S作為對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)10–14 d。挑取單克隆至96孔板，在含G418的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)，吸取上清液作蛋白免疫點(diǎn)雜交(Dot blot)，取5 μL培養(yǎng)基上清液點(diǎn)于NC膜上，自然風(fēng)干后，封閉，抗his抗體孵育，洗膜，山羊抗鼠HRP-IgG孵育，洗膜，曝光。選擇點(diǎn)雜交陽性的孔用含G418的DMEM/ F12完全培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液 (10細(xì)胞/1 mL)，按每孔0.1 mL細(xì)胞懸液接種 (即每孔1 cell)。2輪有限稀釋后，作胞內(nèi)染色，通過流式細(xì)胞分析鑒定細(xì)胞中融合蛋白的表達(dá)。

1.2.4 CS1-Fc-CHO-S的鑒定和CS1-Fc融合蛋白的純化及鑒定

96孔板每孔鋪0.1×106個(gè)細(xì)胞，加入適量的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞貼壁過夜，以1∶1 000的比例加入高爾基體阻斷劑，4–6 h后轉(zhuǎn)入V型底96孔板，PB-Live/Dead染料 (1∶1 000) 4 ℃避光孵育15 min后，固定破膜，APC抗人CS1抗體 (1∶400) 4 ℃避光孵育30 min，F(xiàn)ACS緩沖液清洗2次，重懸后待流式細(xì)胞分析。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用Ni-NTA親和層析柱對(duì)CS1-Fc融合蛋白進(jìn)行純化、SDS-PAGE分析和Western blotting鑒定。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CS1 CAR的表達(dá)

用Dynabeads CD3/CD28提取健康人的T細(xì)胞，將實(shí)驗(yàn)室制備的CS1 CAR慢病毒濃縮液按1∶1 000的比例稀釋于X-VIVO培養(yǎng)基，4 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)5 d。將細(xì)胞轉(zhuǎn)入V型底96孔板，2 500 r/min、4 ℃離心3 min，棄上清，對(duì)照孔細(xì)胞中加入50 μL FACS緩沖液配制的Biotin-CS1 (稀釋比為1∶400)，實(shí)驗(yàn)孔加入50 μL FACS緩沖液配制的CS1-FC融合蛋白，4 ℃避光孵育40 min。清洗1次，棄上清，每孔加入5 μL FACS緩沖液配制的抗體(APC-抗人CS1和FITC-抗人IgG1 Fc抗體稀釋比分別為1∶400和1∶200)，4 ℃避光孵育15 min。清洗2次，棄上清，最后每孔用200 μL的FACS緩沖液重懸混勻，待流式細(xì)胞分析。

1.2.6 T細(xì)胞早期活化分子CD69的檢測(cè)

以0.1×106個(gè)CS1 CAR-T細(xì)胞鋪96孔板，每孔100 μL，加入可溶CS1-Fc (10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL) 或BSA (10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL)，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，或?qū)⒓?xì)胞鋪在提前包被CS1-Fc的96孔板 (用DPBS將蛋白稀釋至5 μg/mL，100 μL/孔，4 ℃包被過夜后DPBS清洗2遍，吸干液體即可)，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，設(shè)置不加蛋白的對(duì)照組。取出細(xì)胞轉(zhuǎn)入V型底96孔板，2 500 r/min、4 ℃離心3 min，棄上清，每孔加入50 μL的PB-抗人CD69抗體(1∶200稀釋)，4 ℃避光染色15 min。清洗2次，棄上清，最后每孔用200 μL FACS緩沖液重懸混勻，進(jìn)行流式細(xì)胞分析。

1.2.7 細(xì)胞因子IFN-γ的檢測(cè)

以100 μL含0.1×106個(gè)CS1 CAR-T細(xì)胞鋪96孔板，分別加入CS1-Fc (100 μg/mL) 或加入CS1-Fc (DPBS稀釋至5 μg/mL，100 μL/孔)，4 ℃包被過夜。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入高爾基體阻斷劑及細(xì)胞刺激劑 (PMA+離子霉素)，培養(yǎng)4 h。設(shè)置不加蛋白的對(duì)照組。取出細(xì)胞轉(zhuǎn)入V型底96孔板，2 500 r/min、4 ℃離心3 min，棄上清，PB-Live/Dead染料 (1∶1 000) 4 ℃避光孵育15 min后，4%多聚甲醛 (PFA) 避光4 ℃固定20 min。1×BD Wash常溫避光孵育 30 min，離心后每孔孵育50 μL的APC-抗人 IFN-γ抗體 (1∶200稀釋)，4 ℃避光染色40 min。清洗2次，棄上清，最后每孔用200 μL的FACS 緩沖液重懸混勻，待流式細(xì)胞分析。

1.2.8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將含CS1 CAR-T細(xì)胞的Ep管置于磁力架上，放置3 min，磁珠將吸附靠近磁力架的管壁上，小心吸出細(xì)胞懸液。用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)組用含100 μg/mL融合蛋白的X-VIVO培養(yǎng)基 (對(duì)照組用不含融合蛋白的X-VIVO培養(yǎng)基) 將細(xì)胞稀釋，每孔以100 μL含0.1×106個(gè)CS1 CAR-T細(xì)胞鋪 96孔板，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每?jī)商煸陲@微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并加入用含融合蛋白的X-VIVO培養(yǎng)基確保融合蛋白濃度為100 μg/mL。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pMH3-CS1-Fc-his的構(gòu)建及鑒定

以人CS1線性DNA (全長(zhǎng)1 005 bp) 為模板，PCR擴(kuò)增1–678 bp，其中包含信號(hào)肽 (66 bp) 和胞外段 (612 bp)。再經(jīng)重疊延伸PCR分別將人Fc段與CS1相連。CS1-linker-Fc-his片段全長(zhǎng)為1 479 bp，N端為CS1片段，中間有一段24 bp的linker，之后是693 bp的人Fc段，C端為His標(biāo)簽。CS1-linker-Fc-his的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1A。用限制性內(nèi)切酶RⅠ和Ⅰ對(duì)重組質(zhì)粒pMH3-CD19進(jìn)行雙酶切，與CS1-linker-Fc-his片段進(jìn)行連接，從而構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pMH3- CS1-Fc-his。用限制性內(nèi)切酶RⅠ和Ⅰ對(duì)其進(jìn)行雙酶切，可見插入的CS1-linker-Fc-his (1 479 bp) 片段 (圖1B)。將質(zhì)粒送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與基因序列一致，說明該質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 CS1-Fc-CHO-S細(xì)胞株的構(gòu)建及鑒定

將重組質(zhì)粒pMH3-CS1-Fc-his通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至CHO-S細(xì)胞，經(jīng)1 mg/mL G418篩選2周后，取上清液進(jìn)行蛋白斑點(diǎn)雜交，以mGM-CSF-his作為陽性對(duì)照，可見轉(zhuǎn)染的CHO-S細(xì)胞表達(dá)融合蛋白 (圖2A)。在顯微鏡下挑取單克隆至96孔板，在含1 mg/mL G418的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周，取上清液作點(diǎn)雜交，篩選出表達(dá)CS1-Fc融合蛋白的CHO-S單克隆細(xì)胞 (CS1-Fc-CHO)，14號(hào)孔信號(hào)最強(qiáng) (圖2B)。將陽性細(xì)胞作第一次有限稀釋，培養(yǎng)2周后，取上清液作點(diǎn)雜交，32號(hào)孔信號(hào)最強(qiáng) (圖2C)。第2次有限稀釋后，可見大多數(shù)孔陽性信號(hào)均較強(qiáng)，C10號(hào)孔為最強(qiáng) (圖2D)。將C10孔的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，進(jìn)行胞內(nèi)染色檢測(cè)，證實(shí)CS1-Fc融合蛋白表達(dá)的陽性率可達(dá)到99.9%以上 (圖3)，說明該細(xì)胞株構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒pMH3-CS1-linker-Fc-his的構(gòu)建及鑒定

圖2 蛋白斑點(diǎn)雜交篩選表達(dá)CS1-Fc融合蛋白的CHO-S細(xì)胞

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CS1-Fc-CHO-S細(xì)胞株的陽性表達(dá)率

2.3 CS1-Fc融合蛋白純化及鑒定

將收集的上清液經(jīng)0.22 μm濾器過濾后，進(jìn)行鎳柱親和層析純化。經(jīng)SDS-PAGE鑒定，CS1-Fc融合蛋白以單體(70 kDa) 和二聚體(140 kDa)為主 (圖4A)。蛋白印跡 (抗His-tag抗體) 結(jié)果顯示，CS1-Fc融合蛋白的分子量大小為70 kDa (圖4B)，CS1-Fc融合蛋白能與抗人CS1抗體發(fā)生特異性反應(yīng) (圖4C)。

2.4 CS1-Fc融合蛋白檢測(cè)CS1 CAR的表達(dá)

CS1-Fc融合蛋白的CS1部分可以作為抗原部分與CS1 CAR結(jié)合，F(xiàn)c片段可以作為檢測(cè)抗原被FITC-抗人IgG1 Fc流式所檢測(cè)，因而可能具有檢測(cè)CS1 CAR表達(dá)效率的能力。我們分離了外周血PMBC，通過Dynabeads分離T細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后，將制備的CS1 CAR慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)至T細(xì)胞中，培養(yǎng)5 d后，取部分T細(xì)胞，在磁力架上將beads脫掉，對(duì)T細(xì)胞上CS1 CAR的表達(dá)效率進(jìn)行流式細(xì)胞分析。結(jié)果顯示，CS1-FC融合蛋白與商品化Biotin-CS1的檢測(cè)結(jié)果相似 (圖5)，這表明CS1-Fc融合蛋白具有較好地檢測(cè)CS1 CAR表達(dá)效率的能力。

圖4 CS1-Fc融合蛋白的SDS-PAGE與Western blotting分析

圖5 CS1-Fc融合蛋白檢測(cè)CS1 CAR-T細(xì)胞上CS1 CAR的表達(dá)率

2.5 CS1-Fc融合蛋白的生物學(xué)效應(yīng)

為了驗(yàn)證CS1-Fc融合蛋白對(duì)CS1 CAR-T細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)，我們從細(xì)胞活化、細(xì)胞因子及增殖等方面進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。

2.5.1 CS1-Fc融合蛋白對(duì)CS1 CAR-T細(xì)胞的激活作用

將BSA和CS1-Fc融合蛋白以10 μg/mL、 50 μg/mL、100 μg/mL的濃度梯度與CS1 CAR-T細(xì)胞在37 ℃、5% CO2條件下共孵育24 h后，用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞早期活化標(biāo)志CD69的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。研究結(jié)果顯示，與CS1-Fc融合蛋白共孵育24 h后，CS1 CAR-T細(xì)胞表面CD69表達(dá)明顯升高。與BSA組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (<0.001) (圖6)。CS1 CAR-T細(xì)胞與固相結(jié)合的CS1-Fc (包被濃度為5 μg/mL) 共孵育24 h后，CD69的表達(dá)率為70.7% (圖7)。表明固相結(jié)合的CS1-Fc融合蛋白能更有效地激活CS1 CAR-T細(xì)胞。

2.5.2 CS1-Fc融合蛋白對(duì)CS1 CAR-T細(xì)胞的促細(xì)胞因子分泌作用

將健康人的T細(xì)胞與CS1-Fc共孵育24 h，并將CS1 CAR-T細(xì)胞分別與可溶性形式的CS1-Fc (100 μg/mL) 和固相結(jié)合的 CS1-Fc (5 μg/mL) 共孵育24 h，以細(xì)胞刺激劑 (PMA+離子霉素) 作為對(duì)照。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，CS1-Fc不能促進(jìn)健康人的T細(xì)胞分泌IFN-γ，而不同形式的CS1-Fc均能特異性地促進(jìn)CS1 CAR-T細(xì)胞分泌IFN-γ，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (<0.001) (圖8和9)。

圖6 CS1-Fc融合蛋白與CS1 CAR-T細(xì)胞共孵育后早期活化標(biāo)志CD69的表達(dá)率

圖7 不同形式CS1-Fc融合蛋白與CS1 CAR-T細(xì)胞共孵育后早期活化標(biāo)志CD69表達(dá)率的流式分析

圖8 不同形式CS1-Fc融合蛋白與CS1 CAR-T細(xì)胞共孵育后細(xì)胞因子IFN-γ表達(dá)率的流式分析

2.5.3 CS1-Fc融合蛋白對(duì)CS1 CAR-T細(xì)胞的促增殖作用

將CS1 CAR-T細(xì)胞與CS1-Fc共孵育，同時(shí)設(shè)置未加蛋白組為對(duì)照，每?jī)商煊?jì)數(shù)并加入培養(yǎng)基和蛋白，使蛋白濃度達(dá)到100 μg/mL，共孵育 7 d。結(jié)果顯示，加入CS1-Fc融合蛋白的CS1 CAR-T細(xì)胞數(shù)目明顯增加，與未加蛋白組相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (<0.001) (圖10)。

圖9 不同形式CS1-Fc融合蛋白與CS1 CAR-T細(xì)胞共孵育后細(xì)胞因子IFN-γ表達(dá)率的統(tǒng)計(jì)分析

圖10 CS1-Fc融合蛋白與CS1 CAR-T細(xì)胞共孵育后細(xì)胞數(shù)目的統(tǒng)計(jì)分析

3 討論

CAR-T細(xì)胞是經(jīng)過基因修飾表達(dá)CARs的T細(xì)胞[6]。CARs是模塊化的，其中每個(gè)功能結(jié)構(gòu)域都允許部分替代，具有很強(qiáng)的通用性。例如，多種靶抗原結(jié)合部分，包括單鏈抗體 (scFv) 和納米抗體，可以充當(dāng)CARs的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。與天然的T細(xì)胞受體 (TCR) 復(fù)合物不同的是，CARs可以識(shí)別抗原而不需要經(jīng)過主要組織相容性復(fù)合物 (MHC) 分子的提呈，使CARs能夠結(jié)合更廣泛的抗原，包括可溶性抗原[17]。靶向不同抗原的CAR-T細(xì)胞具有結(jié)合這些可溶性抗原的能力，并產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)[18-20]。德國(guó)維爾茨堡大學(xué)Gogishvili等研究證實(shí)在體外試驗(yàn)中，CS1 CAR-T細(xì)胞對(duì)于未經(jīng)治療的、難治復(fù)發(fā)型患者的多發(fā)性骨髓瘤 (MM) 細(xì)胞都表現(xiàn)出快速細(xì)胞溶解作用。此外，在小鼠活體試驗(yàn)中，CS1 CAR-T細(xì)胞對(duì)骨髓內(nèi)外MM細(xì)胞均具有抑制活性[12]。

我們制備的CS1-Fc融合蛋白由CS1的胞外區(qū)和人IgG1的Fc段組成。結(jié)果顯示出CS1-Fc融合蛋白能特異性結(jié)合CS1抗體，同時(shí)也能結(jié)合CS1 CAR。我們通過CS1-Fc融合蛋白與CS1 CAR T細(xì)胞孵育，再利用FITC-抗人IgG1Fc抗體檢測(cè)CS1 CAR-T細(xì)胞上CS1 CAR的表達(dá)，檢測(cè)效果與商品化的Biotin-CS1相差無幾，且CS1-Fc融合蛋白中的Fc段可延長(zhǎng)半衰期，不容易變質(zhì)，而商品化的Biotin-CS1價(jià)格昂貴，容易變質(zhì)。我們提供的這種檢測(cè)CS1 CAR表達(dá)的手段，能夠在體外培養(yǎng)階段檢測(cè)CS1 CAR的表達(dá)。

現(xiàn)有研究表明，CS1 CAR-T細(xì)胞可以在體外殺死高表達(dá)CS1的多發(fā)性腫瘤細(xì)胞[12]。CAR-T細(xì)胞的殺靶能力強(qiáng)弱與它的活化有密切的關(guān)系。CD69亦稱為激活誘導(dǎo)分子 (AIM)，是NK細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)基因復(fù)合體家族的成員。CD69可作為共刺激信號(hào)促進(jìn)T細(xì)胞進(jìn)一步活化和增殖。靜止的T淋巴細(xì)胞一般不表達(dá)CD69，T細(xì)胞通過TCR接受CD3/TCR復(fù)合物、佛波醇乙酯(PMA)、植物血凝素(PHA) 等刺激信號(hào)后，細(xì)胞表面即合成和表達(dá)一些新的糖蛋白，包括CD69、IL-2受體CD25、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體CD71，這些分子被稱為活化標(biāo)志，其中最早表達(dá)的是CD69[21]。我們的研究結(jié)果顯示，CS1-Fc融合蛋白在與CS1 CAR-T細(xì)胞共孵育后，CS1 CAR-T細(xì)胞上的CD69表達(dá)水平明顯升高，提示CS1-Fc融合蛋白能特異地激活CS1 CAR-T細(xì)胞。我們的研究還顯示CS1-Fc融合蛋白以固相結(jié)合形式相較可溶形式的CS1-Fc融合蛋白能更有效地活化CS1 CAR，原因可能在于IgG對(duì)聚苯乙烯等固相具有較強(qiáng)的吸附力，結(jié)合多發(fā)生在Fc段，因而CS1部分可更好地暴露而被CS1 CAR所識(shí)別。

CS1 CAR-T細(xì)胞免疫療法的主要困難在于體內(nèi)外增強(qiáng)CS1 CAR-T細(xì)胞的生存和擴(kuò)增。目前，CAR-T細(xì)胞培養(yǎng)是依賴于抗CD3抗體(單獨(dú)或與抗CD28抗體組合) 和細(xì)胞因子。對(duì)于CAR-T細(xì)胞免疫療法來說，如何獲得大規(guī)模的CAR-T細(xì)胞至關(guān)重要[22]。已有研究表明，在適當(dāng)?shù)臈l件下，活化的T細(xì)胞可以通過同源抗原再活化以達(dá)到擴(kuò)增[23-24]。我們的研究結(jié)果顯示，CS1-Fc融合蛋白可以在可溶形式下促進(jìn)CS1 CAR-T細(xì)胞的增殖，推測(cè)這種選擇性增殖是由于融合蛋白的CS1片段被CS1 CAR所識(shí)別并結(jié)合，活化了CS1 CAR-T細(xì)胞。

本研究首次通過質(zhì)粒構(gòu)建、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和G418加壓篩選等方法成功地構(gòu)建了CS1-Fc- CHO-S細(xì)胞，并運(yùn)用鎳柱親和層析分離純化制備了CS1-Fc融合蛋白。我們發(fā)現(xiàn)CS1-Fc融合蛋白能有效地檢測(cè)CS1 CAR-T細(xì)胞中CS1 CAR的表達(dá)，并且表現(xiàn)出在體外某些條件下特異性激活CS1 CAR-T細(xì)胞、促進(jìn)增殖和細(xì)胞因子分泌的能力。CS1-Fc融合蛋白是否可在體內(nèi)作用于CS1 CAR-T細(xì)胞有待進(jìn)一步研究的驗(yàn)證。

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Eukaryotic expression, protein purification and biological effects research of human CS1-Fc fusion protein

Ruzhang Chen, Xitong Wang, Yanchen Li, and Jimin Gao

,,325035,,

Signaling lymphocyte activation family 7 (SLAMF7/CS1) is a cell surface glycoprotein that is highly expressed in multiple myeloma cells. CS1 is a sensitive and specific biomarker for multiple myeloma. CAR-T cell immunotherapy is a new method for the treatment of multiple myeloma. CS1 CAR-T cell immunotherapy has good effect on relapsed refractory multiple myeloma. To detect the expression efficiency of CS1 CAR on CS1 CAR-T cells and to find an auxiliary means to CAR-T cell immunotherapy, we prepared a CS1-Fc fusion protein. First, the extracellular domain of CS1 was amplified from the existing plasmid by PCR and ligated with human IgG1-Fc fragment by overlap extension PCR. The recombinant fragment was ligated into pMH3 eukaryotic expression vector. After restriction enzyme digestion and DNA sequencing, the pMH3-CS1-Fc-his recombinant plasmid was successfully constructed. The recombinant plasmid was transfected into Chinese hamster ovary cell (CHO-S) by liposome. The expression of the CS1-Fc fusion protein in CHO-S cells was identified by flow cytometry after G418 pressure screening. Next, the CS1-Fc fusion protein was purified by nickel column. Western-blot analysis showed that molecular weight of the fusion protein was about 70 kDa was identified by Western blotting. The CS1-Fc fusion protein couldeffectively detect the expression rate of CS1 CAR and promote the activation, proliferation andcytokines secretion of the CS1 CAR-T cells. The results will lay the experimental foundation for thedetection and potentiation of CAR-T cells in multiple myeloma treated with CS1 CAR-T cell.

human signaling lymphocyte activation family 7 (SLAMF7/CS1), CS1-Fc fusion protein, eukaryotic expression, CAR-T, multiple myeloma

陳如章, 王茜桐, 李燕晨, 等. 人CS1-Fc融合蛋白的真核表達(dá)、蛋白純化及生物學(xué)效應(yīng)鑒定. 生物工程學(xué)報(bào), 2020, 36(1): 122–132.

Chen RZ, Wang XT, Li YC, et al. Eukaryotic expression, protein purification and biological effects research of human CS1-Fc fusion protein. Chin J Biotech, 2020, 36(1): 122–132.

September 22, 2019;

December 5, 2019

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 81573110), Science Foundation of National Health Commission of the People’s Republic of China (No. WKJ-ZJ-1928), Science and Technology Major Projects of Wenzhou (No. ZJ2017014), Technology Innovation and Application Development Major Projects of Chongqing (No. cstc2019jscx-msxmX0431).

Jimin Gao. Tel: +86-577-86699341; E-mail: jimingao64@yahoo.com

10.13345/j.cjb.190430

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 81573110)，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)科研基金(No. WKJ-ZJ-1928)，溫州市重大科技專項(xiàng)(No. ZJ2017014)，重慶市技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用發(fā)展專項(xiàng)(No. cstc2019jscx-msxmX0431)資助。

2019-12-25

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20191225.1442.001.html

(本文責(zé)編 郝麗芳)