張冬雪,文亞雄,羅志威,鄭雙鳳,譚石勇*

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 植物營養(yǎng)與生物肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長沙 410205;2.重金屬污染耕地安全高效利用湖南省工程研究中心,湖南 長沙 410205;3.湖南省生物肥料工程技術(shù)研究中心,湖南 長沙 410205;4.泰谷生態(tài)科技集團(tuán)股份有限公司,湖南 長沙 410205)

湖南省是一個(gè)水稻產(chǎn)出大省,據(jù)2015年數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),全省秸稈資源理論總量約為4912.36萬t,實(shí)際可收集資源量為3632.23萬t,其中包括水稻秸稈2628.55萬t。秸稈資源的循環(huán)利用對改善農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境、降低環(huán)境壓力具有重要意義。

纖維素是植物細(xì)胞壁的組成成分。有研究顯示,水稻秸稈中稈部、穗部的纖維素含量分別為39.69%、23.89%。此外,秸稈中半纖維素、木質(zhì)素等主要成分的存在也使得秸稈的降解率較低[1-2]。目前,針對秸稈降解的方法,主要有直接還田、物理降解、化學(xué)降解及生物降解等,相比于其它方法,生物降解法具有處理方式溫和、低能耗、對環(huán)境無二次污染等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注[3]。微生物降解的酶活性高低決定了水稻秸稈被降解的程度,即采用此方法的關(guān)鍵是獲得豐富有效的具有降解秸稈能力的微生物菌種資源。因此,我們從湖南望城區(qū)稻田土壤中分離篩選纖維素降解菌,并通過一系列實(shí)驗(yàn)篩選出了具有高效降解能力的菌株,可為水稻秸稈的資源化利用提供有效的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 樣品采集于湖南望城區(qū)稻田土,去除土壤表面植物秸稈等殘?bào)w雜質(zhì),取0～10 cm表層土樣,風(fēng)干、研磨、裝袋，冷藏備用。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 分離培養(yǎng)基 CMC培養(yǎng)基:羧甲基纖維素鈉(CMC-Na) 10.0 g, KH2PO40.25 g,土豆汁100 mL,瓊脂粉18.0 g,蒸餾水1000 mL。

1.1.2.2 純化、保存培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20.0 g,瓊脂粉18.0 g,蒸餾水1000 mL。

1.1.2.3 篩選培養(yǎng)基 剛果紅培養(yǎng)基: CMC-Na 2.0 g, KH2PO40.5 g, MgSO4·7H2O 0.25 g, (NH4)2SO41.0 g,剛果紅0.1 g,瓊脂粉18.0 g,蒸餾水1000 mL。復(fù)篩培養(yǎng)基: CMC-Na 5.0 g, KH2PO41.0 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, NaNO33.0 g, KCl 0.5 g, FeCl3·6H2O 0.01 g,蒸餾水1000 mL。

1.1.2.4 水稻秸稈液體培養(yǎng)基 CMC-Na 10.0 g, KH2PO41.0 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, NaCl 0.5 g,蛋白胨2.0 g,酵母膏0.5 g,蒸餾水1000 mL,水稻秸稈0.5 g /瓶。

1.2 菌株的分離篩選

1.2.1 菌株的分離純化 將土壤樣品通過梯度稀釋用無菌水制成10-3～10-5菌懸液,并在分離培養(yǎng)基上涂布,置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),將分離到的真菌在PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行劃線純化及保存,將保存好的菌種放于4 ℃冰箱保藏。

1.2.2 菌株的初篩 將分離純化得到的真菌菌株孢子懸浮液涂布于PDA上,于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d,待培養(yǎng)基表面菌落生長均勻時(shí),用5 mm打孔器制成菌餅并接種于剛果紅培養(yǎng)基上,置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d,觀察菌餅周圍是否有透明水解圈,并測量水解圈直徑,每個(gè)菌種設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3 羧甲基纖維素酶(CMCase)活性的測定

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將無水葡萄糖于80 ℃條件下烘干至恒重,并制備成濃度為1.0 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液；在6支干凈的試管中分別加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,補(bǔ)蒸餾水至2.0 mL,再加入1.5 mL DNS試劑，然后沸水浴5 min,冷卻后定容至25 mL,最后于波長540 nm下測定OD值,采用Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 粗酶液的制備 利用初篩得到的真菌菌株制備種子液,按10%的接種量接于復(fù)篩培養(yǎng)基中,在250 mL三角瓶中裝液90 mL,于28 ℃恒溫下振蕩培養(yǎng),分別在3、5、7、9、11 d取發(fā)酵液1.5 mL于離心管中,以10000 r/min離心10 min，得到粗酶液,測定各菌株在不同發(fā)酵時(shí)間下的羧甲基纖維素酶(CMCase)活力,每個(gè)菌種設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3.3 酶活力的測定 參照李靜等的方法[4]進(jìn)行測定。

1.4 水稻秸稈崩解及降解率的測定

1.4.1 水稻秸稈崩解實(shí)驗(yàn) 用剪刀將水稻秸稈剪成約0.5 cm×3.0 cm的條狀,用水稻秸稈替代復(fù)篩培養(yǎng)基中的碳源(CMC-Na),每瓶裝入0.5 g水稻秸稈；按10%的接種量將種子液接于裝液量為45 mL/250 mL的三角瓶中,于28 ℃、120 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng),定期觀察水稻秸稈的崩解情況。

1.4.2 水稻秸稈降解率的測定 將水稻秸稈粉碎后過40目篩,用水稻秸稈替代復(fù)篩培養(yǎng)基中的碳源(CMC-Na),每瓶裝入2.0 g水稻秸稈；按10%的接種量將種子液接于裝液量為90 mL/250 mL的三角瓶中,以接入10 mL蒸餾水為對照,于28 ℃、120 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng),25 d后,將培養(yǎng)物以5000 r/min離心10 min,棄上清液,用蒸餾水反復(fù)清洗3～5次,于80 ℃烘干至恒重,計(jì)算失重率,每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.5 菌株的鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定 根據(jù)有效菌株在PDA平板上的菌落形態(tài)進(jìn)行初步判斷。

1.5.2 分子生物學(xué)鑒定 對高效降解纖維素的菌株進(jìn)行DNA提取,并將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對,在GenBank中尋找相似性最大菌株的基因序列,采用Mega 7.0軟件分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與初步篩選

本文將從土壤樣品中分離的真菌菌株,通過剛果紅培養(yǎng)基初篩得到6株具有纖維素降解能力的菌株(CAF1、CAF2、CF3、WF5、WAF6、F19)。

由表1分析可知,水解圈直徑D與菌落直徑d的比值大小反映了菌株在CMC-Na剛果紅平板上的生長情況,其中菌株CAF2、F19的D/d值分別為2.99、3.12,說明其相對水解圈直徑較大,而CAF2與F19的最高酶活分別為21.06和8.56 U/mL;菌株WAF6、CAF1、CAF2的酶活相對較高,且最高酶活出現(xiàn)時(shí)間相同(第5天),但D/d值相差較多;菌株CF3的水解圈直徑較小,酶活也相對較小;此外,各菌株達(dá)到最高酶活的時(shí)間也各不相同。

表1 各菌株降解纖維素能力的評價(jià)結(jié)果

2.2 菌株對水稻秸稈的崩解效果及降解率

2.2.1 菌株對水稻秸稈的崩解效果 在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,將上述6個(gè)菌株接種于水稻秸稈液體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)25 d后鑒定它們降解水稻秸稈的能力，結(jié)果如表2所示。從表2可以看出：各菌株在培養(yǎng)0～3 d期間水稻秸稈無明顯的形態(tài)變化；從第5天開始,經(jīng)菌株CAF2、WAF6作用的秸稈開始逐漸被降解,其中WAF6在15 d內(nèi)能夠降解絕大部分的秸稈;菌株CAF1、CAF2、F19在20 d內(nèi)能夠崩解約1/2的水稻秸稈。

不同菌株對水稻秸稈的崩解效果如圖1所示,在菌株WAF6的作用下,水稻秸稈基本上被降解。

注:“+”表示秸稈被降解較少;“++”表示秸稈被降解1/2左右;“+++”表示秸稈基本被降解;“++++”表示秸稈被完全降解。

圖1 各菌株在培養(yǎng)25 d時(shí)對水稻秸稈的崩解效果

2.2.2 各菌株對水稻秸稈的降解率 如圖2所示,各菌株對水稻秸稈均有一定的降解作用,其中菌株WAF6、CAF2的降解效果較好,降解率分別為45.72%和33.97%；菌株CAF1、WF5、F19的降解率分別為25.22%、18.55%、13.58%；菌株CF3的降解效果最差,僅為2.94%。

2.3 菌株的鑒定結(jié)果

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,對降解水稻秸稈效果較好的1株真菌WAF6進(jìn)行形態(tài)特征描述,以及分子生物學(xué)分析。

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 WAF6在PDA培養(yǎng)基上的菌落平坦,生長迅速,菌絲起初為白色絨毛狀,后隨培養(yǎng)時(shí)間延長由中間部位開始產(chǎn)生大量暗綠色分生孢子,孢子較易脫落。根據(jù)形態(tài)特征，初步鑒定其屬于青霉屬。

2.3.2 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹分析 根據(jù)序列測定結(jié)果,在GenBank中采用Blast進(jìn)行檢索與同源性序列比對,用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果(圖3)顯示,菌株WAF6與草酸青霉(Penicilliumoxalicum, NR 121232.1)的親緣關(guān)系最近，因此,將菌株WAF6鑒定為草酸青霉(Penicilliumoxalicum)。將該菌株保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心,保藏號為ACCC 32731。

圖2 不同菌株對水稻秸稈的降解率

圖3 基于序列測定結(jié)果的不同菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論和結(jié)論

利用微生物降解處理秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物,纖維素降解菌的篩選是基礎(chǔ)。目前,分離篩選纖維素降解菌的相關(guān)研究已有較多報(bào)道,從研究中可以發(fā)現(xiàn)降解纖維素細(xì)菌主要包括芽孢桿菌屬、短桿菌屬、類芽孢桿菌屬等[5-8];真菌包括木霉(綠色木霉)、青霉、曲霉(棘孢曲霉、黑曲霉、米曲霉等)[9-11];放線菌包括鏈霉菌屬等[12-14]。

在纖維素降解菌的篩選過程中,微生物種類不同會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)酶活性和其對不同秸稈的降解能力也存在較大差異,因此,應(yīng)注重篩選與評價(jià)方法的綜合應(yīng)用。在本研究中,采用剛果紅平板培養(yǎng)法初步篩選出6株真菌,測量并計(jì)算出各菌株的水解圈直徑D與菌落直徑d的比值(D/d)，以此指標(biāo)作為參考,在后續(xù)的CMCase實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),有些比值(D/d)大的菌株酶活較高，而有些菌株則相反,即比值(D/d)大,但酶活較低,說明各菌株在CMC-Na剛果紅平板上形成的水解圈大小與CMCase活力之間無顯著的相關(guān)性。這與李靜等的研究結(jié)論相似,即剛果紅培養(yǎng)基上產(chǎn)生的水解圈只能定性判斷某菌株是否具有CMC降解能力[4]。于慧娟等[15]在秸稈降解菌的研究中采用透明圈直徑與菌落直徑的比值初步判斷菌株產(chǎn)纖維素酶的能力,其認(rèn)為比值越大,產(chǎn)酶能力越強(qiáng)。

本研究采用CMC-Na酶活力法測定纖維素酶活力,該方法具有反應(yīng)時(shí)間短、能夠排除干擾因素的影響等優(yōu)點(diǎn)[16]。通過分析酶活力及秸稈降解率發(fā)現(xiàn),酶活力大小與水稻秸稈降解率具有相關(guān)性,即菌株產(chǎn)纖維素酶能力是秸稈降解的主導(dǎo)因素,因此,在對纖維素降解菌的篩選研究中，還應(yīng)著重于菌株產(chǎn)酶情況的研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,菌株WAF6對水稻秸稈的降解率最高,為45.72%;CMCase活力在培養(yǎng)的第5天達(dá)到最大值,為29.35 U/mL。經(jīng)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)手段將菌株WAF6鑒定為草酸青霉(Penicilliumoxalicum)。穆春雷[17]從玉米秸稈還田地區(qū)篩選出的1株草酸青霉菌能夠在低溫下高效降解纖維素,在搖床發(fā)酵培養(yǎng)第9天時(shí),CMCase活力最高，達(dá)33.08 U/mL;王洪媛等[18]所篩選的草酸青霉菌株98MJ在培養(yǎng)5 d后,其對由小麥秸稈制備的秸稈木質(zhì)纖維素的失重率為26.8%。此外,我們在鎘污染土壤培育模擬實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，本文所篩選菌株WAF6能夠有效降低土壤中有效鎘含量(未附數(shù)據(jù)),由此表明該菌株在秸稈降解與重金屬污染修復(fù)方面均具有一定的研究開發(fā)潛力。