蔣曉祎,侯欣妤，張波，任禾，牛祖彪，鄭幽，王雨琪，孫強(qiáng)，黃紅艷

1.首都醫(yī)科大學(xué) 附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，北京 100038；

2.軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100071

2019年末暴發(fā)的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19），給全世界造成了巨大災(zāi)難。COVID-19由SARS-CoV-2病毒引起，其感染機(jī)體的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一是病毒表面的刺突蛋白（S蛋白）與宿主細(xì)胞表面的受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）結(jié)合[1]。

人ACE2基因位于第17號(hào)染色體上，跨越18個(gè)外顯子[2]，編碼一個(gè)含805個(gè)氨基酸殘基的跨膜糖蛋白。該蛋白是一種與ACE同源的金屬羧肽酶，具有明顯的信號(hào)肽、單一的金屬蛋白酶活性位點(diǎn)和跨膜結(jié)構(gòu)域，可降解血管緊張素Ⅰ（angiotensinⅠ，AngⅠ）生成Ang1-9，降解血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）生成Ang1-7[3-4]。Ang1-7作用于Mas受體，起到舒張血管和降低血壓的作用[5-6]。

ACE2在SARS-CoV-2入侵人體時(shí)發(fā)揮關(guān)鍵作用。SARS-CoV-2的S蛋白在感染細(xì)胞時(shí)起主要作用，它主要包括S1和S2兩個(gè)片段，S1片段識(shí)別細(xì)胞表面的ACE2并與之結(jié)合，介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞，S2促進(jìn)病毒與細(xì)胞膜間的融合[7-9]。

為了動(dòng)態(tài)追蹤ACE2的表達(dá)情況，我們擬構(gòu)建ACE2與紅色熒光蛋白的融合表達(dá)載體，并初步驗(yàn)證載體功能，以期為后續(xù)新冠病毒的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎細(xì)胞293T、包含目的基因ACE2的質(zhì)粒 pcDNA3.1-ACE2-3xFlag、pQCXIP-mCherry-Lamp載體、pSec-SARS-CoV-2-S質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室提供；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans10、dNTPs、TaqDNA聚合酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pQCXIP-mCherry載體購(gòu)自Promega公司；Q5超保真DNA聚合酶，限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、AgeⅠ及Cutsmart酶切緩沖液購(gòu)自New England Biolabs公司；同源重組試劑盒購(gòu)自中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司；PCR試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；Opti-MEM減糖培養(yǎng)基購(gòu)自購(gòu)自Thermo Fisher公司；脂質(zhì)體LipofectAMINE 3000購(gòu)自Invitrogen生命技術(shù)有限公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自PAN-Biotech公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)盒、0.25%-EDTA胰酶購(gòu)自中國(guó)邁晨科技公司；鼠源ACE2抗體、鼠源β-actin抗體購(gòu)自Proteintech公司；鼠源SARS-CoV-2 spike抗體購(gòu)自GeneTex公司；辣根過氧化物酶標(biāo)抗鼠IgG、Hochest 33342購(gòu)自CST公司。

1.2 基因測(cè)序與引物序列合成

單鏈向?qū)?RNA（sgRNA）寡核苷酸（oligo）的DNA序列合成及基因測(cè)序由中美泰和生物技術(shù)公司完成。

1.3 PCR擴(kuò)增目的基因

以pcDNA3.1-ACE2-3xFlag載體為模板設(shè)計(jì)PCR 擴(kuò)增引物 ACE2-PQC-F（5′-GATCCGCGGCC GCACCGGGATCTATGTCAAGCTCTTCCTGGCTCCT TCTC-3′）、ACE2-R-mCh（5′-CTTGCTCACCATGG TGGCGACAAAGGAGGTCTGAACATCATCAGTGTT TTGG-3′）。引物的3′端包含能與模板DNA結(jié)合的堿基序列，以便擴(kuò)增出目的DNA片段；引物的5′端包含與線性化載體末端同源的堿基序列，以便PCR擴(kuò)增片段能與線性化載體進(jìn)行重組反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性30 s；98℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，33個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 min。擴(kuò)增得到目的基因片段ACE2。擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，紫外線透射儀下觀察電泳結(jié)果，后用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.4 重組載體的構(gòu)建及鑒定

采用SnapGene 3.2.1軟件設(shè)計(jì)載體pQCXIPACE2-mCherry（圖1），用XhoⅠ、AgeⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)pQCXIP-mCherry-Lamp進(jìn)行切割，37℃水浴3 h，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果，待DNA完全消化后（電泳顯示單一條帶），回收純化酶切產(chǎn)物。

圖1 pQCXIP-ACE2-mCherry載體構(gòu)建示意圖

將目的基因ACE2片段與酶切后的線性化載體用同源重組酶連接，重組產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans10感受態(tài)細(xì)胞，用氨芐青霉素（Amp）篩選，37℃培養(yǎng)12 h后挑取單菌落到LB培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min振蕩過夜培養(yǎng)后測(cè)序鑒定，獲得重組表達(dá)載體pQCXIP-ACE2-mCherry。

1.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

293T細(xì)胞按1.0×106/孔的密度接種于6孔板，用含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基DMEM于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組，將 1 μg pQCXIP-ACE2-mCherry表達(dá)載體和1 μg pSec-SARS-Cov2-S表達(dá)載體共同稀釋在100 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中，用LipofectAMINE 3000脂質(zhì)體作為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染介質(zhì)，共轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，6 h后換成DMEM培養(yǎng)基。對(duì)照組，將載體pQCXIP-ACE2-mCherry換成pQCXIP-mCherry，其他條件不變。

1.6 活細(xì)胞拍攝觀察融合基因的表達(dá)

轉(zhuǎn)染48 h后在培養(yǎng)基中加入Hochest 33342染料（稀釋比為1∶1000）對(duì)細(xì)胞核染色，用熒光顯微鏡（Nikon Eclipse）同時(shí)采集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的293T細(xì)胞圖像（DIC、DAPI及mCherry通道），觀察熒光蛋白表達(dá)情況。

1.7 Western印跡鑒定瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中ACE2及S蛋白的表達(dá)

熒光顯微鏡采集圖像后吸走培養(yǎng)基，PBS清洗后用RIPA裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白并用BCA法定量蛋白，每個(gè)樣品各取50 μg總蛋白，和上樣緩沖液混合后煮沸10 min變性，完成蛋白樣本的制備。將樣本進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后加入鼠源ACE2抗體（稀釋比為1∶3000）、SARS-CoV-2 spike抗體（1∶2000）、β-actin抗體（1∶8000），4℃或室溫下孵育12 h后用二抗抗鼠IgG（1∶3000）常溫孵育1 h，加入曝光底物進(jìn)行曝光。以β-actin為內(nèi)參，Western印跡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組ACE2和S蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 pQCXIP-ACE2-mCherry載體的鑒定

用引物ACE2-PQC-F和ACE2-R-mCh擴(kuò)增所得產(chǎn)物為2459 bp（圖2A），與預(yù)期相符，提示ACE2擴(kuò)增成功。用XhoⅠ、AgeⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)pQCXIP-mCherry-Lamp進(jìn)行雙酶切，共做2份，電泳顯示2號(hào)酶切成功（圖2B）。膠回收目的片段ACE2和切割完成的線性載體pQCXIP-mCherry，用同源重組方法將ACE2與線性載體連接，轉(zhuǎn)化后挑取單克隆測(cè)序，結(jié)果顯示插入序列正確無(wú)誤（圖2C），證明pQCXIP-ACE2-mCherry融合載體構(gòu)建成功。

圖2 ACE2的PCR擴(kuò)增和表達(dá)載體構(gòu)建

2.2 ACE2-mCherry融合蛋白在293T細(xì)胞中的表達(dá)

研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2的S蛋白與ACE2受體結(jié)合后，S蛋白將裂解為S1和S2片段，其中S2片段能誘導(dǎo)胞膜融合[7]。在此，我們利用合胞體形成實(shí)驗(yàn)來觀察是否出現(xiàn)膜融合現(xiàn)象，從而驗(yàn)證ACE2-mCherry是否發(fā)揮功能。如圖3所示，載體通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后在熒光顯微鏡下可見293T細(xì)胞有紅色熒光蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組中，當(dāng)共轉(zhuǎn)含ACE2和S蛋白的質(zhì)粒時(shí)，有大量合胞體形成，而對(duì)照組無(wú)ACE2時(shí)幾乎無(wú)合胞體產(chǎn)生，證明ACE2-mCherry融合蛋白在293T細(xì)胞中表達(dá)，并且和S蛋白結(jié)合，使其誘導(dǎo)膜融合。

圖3 ACE2-mCherry融合蛋白在293T細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 Western印跡檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中ACE2及S蛋白的表達(dá)

為了再次驗(yàn)證ACE2是否成功表達(dá)且發(fā)揮功能，我們?cè)诘鞍姿綑z測(cè)ACE2、S及S2蛋白的表達(dá)情況。如圖4，SARS-CoV-2的S蛋白全長(zhǎng)在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均表達(dá)且無(wú)明顯差別，證明pSec-SARS-CoV-2-S質(zhì)粒均成功轉(zhuǎn)染且表達(dá)量相差不大。實(shí)驗(yàn)組中S2表達(dá)，而對(duì)照組幾乎不表達(dá)，證明ACE2-mCherry發(fā)揮其作為S蛋白受體的功能。

圖4 Western印跡驗(yàn)證蛋白的表達(dá)量

3 討論

ACE2是SARS-CoV-2入侵宿主細(xì)胞的關(guān)鍵受體，研究其表達(dá)譜具有重要意義。ACE2可在人體心臟、肺臟、肝臟、腎臟、睪丸、腸等多種組織中表達(dá)[4,10]。它在肺組織中主要分布于Ⅱ型肺泡細(xì)胞，少量分布于Ⅰ型肺泡細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，表達(dá)量下調(diào)是急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）發(fā)生的重要原因之一[11-13]。系統(tǒng)和/或局部的ACE/ACE2活性失衡已被認(rèn)為是許多疾病的重要致病因素。

SARS-CoV-2與ACE2的結(jié)合是病毒感染的重要環(huán)節(jié)和前提條件，因此阻斷二者結(jié)合是抑制病毒感染的一種有效方法。目前能夠阻止其與病毒結(jié)合發(fā)揮作用的藥物正在被研發(fā)。Vanessa等[14]利用體外純化的臨床級(jí)人重組可溶性ACE2（human recombinant solubility ACE2，hrsACE2）將SARS-CoV-2感染的非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）中的病毒生長(zhǎng)率降低至1/1000～1/5000；中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所王祥喜團(tuán)隊(duì)在前期篩選到一株對(duì)冠狀病毒β家族有廣譜中和作用的人源化單克隆抗體H014的基礎(chǔ)上[15]，發(fā)現(xiàn)了一種高效的SARSCoV-2特異性中和抗體P17，可阻礙SARS-CoV-2的RBD蛋白與受體ACE2之間的相互作用，并能阻斷病毒的膜融合過程[16]；Kruse闡述了將可溶性ACE2與免疫球蛋白Fc域融合（ACE2-Fc），既可阻斷SARS-CoV-2的進(jìn)入，又可以幫助免疫系統(tǒng)建立持久的免疫[17]。

另外，由于ACE2參與人類疾病的多種病理生理過程，進(jìn)一步了解它在疾病中的作用將有望引導(dǎo)探索新的治療方向。使用ACE2抑制劑進(jìn)行功能研究對(duì)于闡明ACE2的調(diào)控機(jī)制至關(guān)重要。

為了進(jìn)一步研究ACE2基因在介導(dǎo)病毒感染中的功能，建立帶有熒光標(biāo)記的ACE2融合表達(dá)系統(tǒng)是有效方法之一。本研究利用同源重組方法構(gòu)建了ACE2基因以及帶有熒光標(biāo)記蛋白mCherry的真核表達(dá)載體pQCXIP-ACE2-mCherry，通過活細(xì)胞熒光顯微鏡成像及Western印跡檢測(cè)到目的熒光的表達(dá)及蛋白表達(dá)。在成功構(gòu)建融合基因基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步對(duì)該表達(dá)載體表達(dá)的目的蛋白ACE2的功能進(jìn)行了初步驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ACE2能夠介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大量合胞體的出現(xiàn)，與公認(rèn)已知的ACE2參與病毒感染的研究結(jié)果一致，再次說明該系統(tǒng)的構(gòu)建能夠?yàn)檫M(jìn)一步探討ACE2功能提供有效的模型。本研究為深入了解ACE2在SARS-CoV-2感染治療中的作用及相應(yīng)機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。