周夢迪，沈嘉煒，梁立軍，李嘉辰，金樂紅，王琦

（1 杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江杭州311121； 2 杭州電子科技大學(xué)自動(dòng)化學(xué)院，浙江杭州310018； 3 浙江大學(xué)化學(xué)系，浙江杭州310027）

引 言

近年來，隨著納米技術(shù)的發(fā)展,納米粒子被廣泛用于許多研究領(lǐng)域，例如在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,納米粒子可用于醫(yī)學(xué)成像[1]、生物傳感[2-4]、藥物的靶向運(yùn)輸[5-6]以及癌癥的同步診斷和治療[7-9]等。同時(shí),納米粒子也已經(jīng)用于電子元件、涂料、運(yùn)動(dòng)器材、化妝品、食品添加劑等許多商業(yè)產(chǎn)品[10]。納米粒子在一維尺度上長度小于100 nm，尺寸很小，容易通過皮膚吸收并被體液攜帶，進(jìn)而到達(dá)活細(xì)胞，穿透細(xì)胞膜或在人體累積，從而誘導(dǎo)細(xì)胞損傷甚至凋亡。在進(jìn)入人體和細(xì)胞的過程中，納米材料可能會(huì)與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸等生物大分子相互作用[11-13]，從而導(dǎo)致生物大分子的失活，誘導(dǎo)或產(chǎn)生生物毒性。由于石墨烯在工業(yè)上的應(yīng)用越來越多[14-15]，是目前發(fā)現(xiàn)的最薄、強(qiáng)度最大、導(dǎo)電導(dǎo)熱性能最好的一種納米材料，因而被稱作“黑金”，近年來更被譽(yù)為是“新材料之王”。這種典型的二維材料的生物安全性及其在生物醫(yī)療方面的應(yīng)用也越來越受到關(guān)注[16-18]。

石墨烯(graphene，GRA)是一種由平整的單層碳原子密集堆積成二維蜂窩晶格的碳納米材料，可被視為富勒烯、碳納米管和石墨的基本組成部分[19-21]。氧化石墨烯(graphene oxide，GO)是石墨烯的氧化物，經(jīng)過氧化處理后，氧化石墨烯仍保持石墨的層狀結(jié)構(gòu)，但在每一層的石墨烯單片上引入了許多氧基官能團(tuán)。這些氧基官能團(tuán)的引入使得單一的石墨烯結(jié)構(gòu)變得非常復(fù)雜。這類物質(zhì)粒徑很小，容易進(jìn)入生物體，與組織、細(xì)胞、細(xì)胞器和蛋白質(zhì)等相互作用，導(dǎo)致組織或細(xì)胞的功能紊亂[22]。石墨烯由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)、電子特性等已被應(yīng)用于潛在的生物治療中[23]。雖然石墨烯已被證明是疾病診斷和治療的良好候選材料，但人們對石墨烯與生物系統(tǒng)相互作用所產(chǎn)生的生物效應(yīng)和相應(yīng)的機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍然有限。近年來有關(guān)石墨烯與生物大分子之間的研究越來越引起關(guān)注，例如，計(jì)算機(jī)模擬研究和實(shí)驗(yàn)研究都表明石墨烯可以吸附蛋白質(zhì)使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，穿透細(xì)胞膜從而吸附細(xì)胞膜上的磷脂，吸附DNA破壞DNA的堿基對等[24-26]。

分子動(dòng)力學(xué)模擬(molecular dynamic simulation，MD)自1966 年起發(fā)展至今已有五十余年，隨著計(jì)算方法學(xué)的不斷提升和計(jì)算機(jī)計(jì)算能力的飛速發(fā)展，近年來分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)已不斷地滲透到生物、化學(xué)、制藥等相關(guān)領(lǐng)域并在其中得到廣泛應(yīng)用，目前已成為除理論分析和實(shí)驗(yàn)研究以外的第三種分析手段[27-29]。分子動(dòng)力學(xué)模擬作為一種強(qiáng)大的工具不僅能得到原子的運(yùn)動(dòng)軌跡，還能像實(shí)驗(yàn)一樣進(jìn)行各種觀察，特別是在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中無法獲得的與原子有關(guān)的微觀細(xì)節(jié)，在分子動(dòng)力學(xué)模擬中都能方便地進(jìn)行觀察。相比于實(shí)驗(yàn)，利用分子動(dòng)力學(xué)模擬研究化學(xué)或生物問題具有以下一些優(yōu)點(diǎn)：(1)成本較低；(2)降低實(shí)驗(yàn)事故發(fā)生率，安全性高；(3)有助于更好地理解和獲取一些實(shí)驗(yàn)上難以得到的分子級別的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，有效地補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。因此本文綜述了近年來計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)，尤其是分子動(dòng)力學(xué)模擬方法在研究石墨烯、氧化石墨烯、石墨烯量子點(diǎn)等納米材料與細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)、DNA 等生物大分子相互作用及其潛在的生物毒性的進(jìn)展。

1 石墨烯和細(xì)胞膜的相互作用

納米材料能夠進(jìn)入細(xì)胞并與細(xì)胞發(fā)生作用，主要是通過對跨膜過程和細(xì)胞分裂、增殖、凋亡等基本生命過程的影響和相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)控，從而在細(xì)胞水平上產(chǎn)生一定的生物效應(yīng)。最近關(guān)于石墨納米材料如零維富勒烯[30-31]和一維碳納米管[32-33]與細(xì)胞膜相互作用的研究表明，這些材料可以通過直接滲透[34-35](通常是小尺寸納米顆粒的情況)或通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞[33,36]。據(jù)報(bào)道，石墨烯具有細(xì)胞毒性作用，細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的過量產(chǎn)生與其毒性有關(guān)[37-38]。一些實(shí)驗(yàn)研究也表明石墨烯具有毒性效應(yīng)。比如Kloepfer 等[39]發(fā)現(xiàn)當(dāng)石墨烯量子點(diǎn)的粒徑小于5 nm 時(shí)，它可以直接進(jìn)入大腸桿菌和枯草芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)，并產(chǎn)生毒性效應(yīng)；Hu 等[40]研究氧化石墨烯的加入對大腸桿菌的影響，發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯可以切斷大腸桿菌的細(xì)胞膜，并導(dǎo)致直接的物理膜損傷，從而造成細(xì)胞死亡；Liu 等[41]通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯可以和脂質(zhì)囊泡相互作用從而損傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。還有一些團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)石墨烯和氧化石墨烯對紅細(xì)胞有溶血作用[42-44]，這些溶血作用被證明和石墨烯對細(xì)胞膜的破壞作用有關(guān)[25,45]。

圖1 氧化石墨烯作用下的大腸桿菌細(xì)胞膜形態(tài)學(xué)的變化[25]Fig.1 Morphology of Escherichia coil exposed to graphene oxide nanosheets[25]

1.1 石墨烯和大腸桿菌細(xì)胞膜相互作用

最近有研究發(fā)現(xiàn)石墨烯對大腸桿菌有強(qiáng)烈的抑菌作用，這種細(xì)胞毒性被認(rèn)為是由石墨烯和細(xì)菌細(xì)胞膜之間的直接相互作用形成的物理損傷所引起的[46-49]。Tu 等[25]通過實(shí)驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯能夠破壞大腸桿菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，如圖1 所示。大腸桿菌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化歷經(jīng)三個(gè)階段。第一階段，大腸桿菌細(xì)胞膜保持初始結(jié)構(gòu)[圖1(a)]。第二階段，大腸桿菌細(xì)胞膜部分受損，其中部分細(xì)胞膜表面具有較低的磷脂密度即稀疏脂質(zhì)[如圖1(b)、(c)中Type B所示]。第三階段，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌細(xì)胞失去了細(xì)胞完整性，其膜被嚴(yán)重破壞，有些甚至喪失了所有細(xì)胞質(zhì)，即“空巢“[如圖1(d)～(f)中的Type A 所示]。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明氧化石墨烯能夠破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)從而對細(xì)胞產(chǎn)生一定的潛在毒性。Tu 等又采用分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)發(fā)現(xiàn)石墨烯能吸附大腸桿菌細(xì)胞膜上的磷脂，從而破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。他們發(fā)現(xiàn)石墨烯中所有的碳原子都是sp2雜化，由于這一特殊的二級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致石墨烯和細(xì)胞膜磷脂之間存在非常強(qiáng)的疏水相互作用。在本次模擬中使用全原子脂質(zhì)模型模擬大腸桿菌的細(xì)胞外膜和細(xì)胞內(nèi)膜，如圖2 所示，在石墨烯納米片自發(fā)地進(jìn)入細(xì)胞外膜和細(xì)胞內(nèi)膜這一過程中觀察到三種可區(qū)分的模式：第一，擺動(dòng)模式(swing mode)，石墨烯納米片由其最初無偏的取向經(jīng)過一次擺動(dòng)，然后在受其約束的原子周圍來回?cái)[動(dòng)，此過程持續(xù)一小段時(shí)間；第二，插入模式(insertion mode)，石墨烯納米片的尾端最終由于受到來自膜脂質(zhì)的強(qiáng)范德華力(vdW)的吸引而被膜攝取和拉動(dòng)；第三，攝取模式(extraction mode)，石墨烯納米片開始攝取細(xì)胞膜表面的磷脂分子，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。為進(jìn)一步研究石墨烯對大腸桿菌的細(xì)胞毒性機(jī)制,Tu等[25]將石墨烯放置在細(xì)胞膜上方，并觀察石墨烯和細(xì)胞膜相互作用的過程(圖3)，結(jié)果表明石墨烯不但可以插入細(xì)胞膜從而進(jìn)行物理切割，還可以通過疏水作用對細(xì)菌膜表面的脂質(zhì)分子進(jìn)行破壞性的抽取，進(jìn)而殺死細(xì)菌。他們指出，正是由于石墨烯獨(dú)特的二維結(jié)構(gòu)使其可以與細(xì)菌細(xì)胞膜上的磷脂分子發(fā)生超強(qiáng)的相互作用，從而導(dǎo)致大量磷脂分子脫離細(xì)胞膜并吸附到石墨烯的表面。

1.2 石墨烯和哺乳動(dòng)物細(xì)胞相互作用

圖2 石墨烯納米片插入細(xì)胞膜的過程[25]Fig.2 Graphene nanosheets insertion and lipid extraction[25]

圖3 石墨烯吸附磷脂分子的模擬過程[25]Fig.3 Lipids extraction by graphene in docking simulations[25]

圖4 石墨烯和磷脂分子相互作用的過程[50]Fig.4 Interaction between grapheme and membranes[50]

石墨烯不僅能攝取細(xì)胞膜表面的磷脂分子，改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，還可以形成膜孔。Duan 等[50]通過分子動(dòng)力學(xué)模擬方法發(fā)現(xiàn)石墨烯可以吸附細(xì)胞膜表面的磷脂，并形成水分子可以通過的膜孔，并通過實(shí)驗(yàn)加以證明。圖4(a)表現(xiàn)的是兩個(gè)平行的石墨烯片垂直插入細(xì)胞膜表面的磷脂雙分子層的過程。圖4(b)、(c)表明石墨烯片插入細(xì)胞膜后，吸收其表面的磷脂分子，并形成水分子孔道。隨著模擬時(shí)間的延長，孔道中的水分子數(shù)量越來越多，吸附在石墨烯表面的磷脂分子也越來越多。因?yàn)槭┖褪杷缘牧字肿游膊恐g存在強(qiáng)大的疏水作用，從而使得磷脂分子從細(xì)胞膜中脫離被吸附到石墨烯表面上，并導(dǎo)致細(xì)胞膜內(nèi)部片段之間的負(fù)曲率增加。在90 ns 時(shí)，細(xì)胞膜失去其完整性，并在石墨烯的中心位置形成孔。

為了進(jìn)一步說明膜孔形成的機(jī)制，Duan等又計(jì)算了石墨烯和細(xì)胞膜之間的范德華力(vdW)，如圖5(a)所示。模擬過程分為三個(gè)階段，第一階段，磷脂分子快速地吸附在石墨烯表面，導(dǎo)致石墨烯和細(xì)胞膜之間的vdW作用驟減，隨著細(xì)胞膜進(jìn)入亞穩(wěn)態(tài)，該過程開始顯著減慢；第二階段，細(xì)胞膜內(nèi)膜的張力和石墨烯介導(dǎo)的分開細(xì)胞膜的拉力大致平衡，從而使細(xì)胞膜的曲率保持在相對穩(wěn)定的水平；第三階段，熱力學(xué)波動(dòng)導(dǎo)致細(xì)胞膜張力最終屈服于石墨烯分散的拉力，導(dǎo)致石墨烯進(jìn)一步提取脂質(zhì)分子、膜孔形成以及vdW作用的又一次急劇下降。他們又通過計(jì)算磷原子的密度進(jìn)一步說明膜孔形成的機(jī)制，如圖5(b)所示。第一階段，磷原子的密度沿整個(gè)軸線相對均勻分布，就如同未受干擾的細(xì)胞膜所預(yù)期的分布。然而，到50 ns時(shí)，可以看到密度分布形成了一個(gè)深谷，在深谷區(qū)域發(fā)現(xiàn)了磷原子密度最大程度地耗盡(第二階段)。通過吸引納米片相鄰的脂質(zhì)分子將該間隙區(qū)域中的脂質(zhì)拉向石墨烯，進(jìn)一步刺激提取過程。在第三階段的開始，間隙區(qū)域中的脂質(zhì)分子之間形成的網(wǎng)格消散并且在膜中形成孔。

石墨烯侵入細(xì)胞膜除了能吸附細(xì)胞膜表面的磷脂分子外，還可以通過尖角穿孔的方式進(jìn)入細(xì)胞膜。Li等[43]使用全原子分子動(dòng)力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)石墨烯的尖角最初被放置在穿過磷脂雙分子層的角穿孔構(gòu)型中，然后觀察到石墨烯自發(fā)地向下移動(dòng)，進(jìn)一步穿透到磷脂雙分子層中，如圖6(a)所示。他們還計(jì)算了石墨烯尖角插入細(xì)胞膜過程中的能壘變化，如圖6(b)顯示石墨烯尖角穿透磷脂雙分子層頂部親水頭部區(qū)域的能壘約為5kBT。在此后不久，由于磷脂分子的疏水性尾部和石墨烯之間的疏水作用致使總的能量開始減少。進(jìn)一步的研究表明，與石墨烯角穿入磷脂雙分子層相關(guān)的自由能變化可以用四個(gè)參數(shù)的簡單數(shù)學(xué)模型來描述：hT(磷脂分子尾部的厚度)，hH(磷脂分子頭部的厚度)，γH(磷脂分子頭部基團(tuán)和石墨烯表面之間的能量)，γT(磷脂分子尾部和石墨烯表面之間的能量)，如圖6(c)所示。該模型預(yù)測，隨著石墨烯穿透磷脂雙分子層距離h的變化，能量在0 ＜h≤hH的范圍內(nèi)增加，并且在hH+ 2hT＜h≤2hH+ 2hT和2hH+ 2hT＜h的情況下減少。能壘計(jì)算公式為E=2(1-γH/γT)h2HγHtanα，其中α是石墨烯的半內(nèi)角。當(dāng)石墨烯的內(nèi)角為45°時(shí)，預(yù)計(jì)穿孔的能壘約為7kBT，這和之前全原子模擬計(jì)算的石墨烯和細(xì)胞膜之間的能壘為5kBT非常接近。這些分析的數(shù)據(jù)都表明石墨烯可以通過尖角插入細(xì)胞膜，從而破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。

圖5 石墨烯和細(xì)胞膜之間的范德華力(vdW)和磷原子的密度分布[50]Fig.5 (a)vdW energy profile for interactions between lipids and graphenes;(b)lipid density projected onto the y-axis at different stages of pore formation[50]

圖6 石墨烯尖角通過細(xì)胞膜的全原子分子動(dòng)力學(xué)模擬研究[43]Fig.6 All-atom molecular dynamical simulations of corner piercing of a monolayer graphene across a lipid bilayer[43]

1.3 石墨烯量子點(diǎn)和細(xì)胞膜的相互作用

圖7 100 ns分子動(dòng)力學(xué)模擬后不同濃度的GQD7穿越細(xì)胞膜的瞬時(shí)結(jié)構(gòu)[55]Fig.7 Final structures and distribution of GQDs in lipid membrane at different concentrations after 100 ns molecular dynamics simulation[55]

石墨烯量子點(diǎn)(graphene quantum dots,GQDs)是來源于石墨烯的一種零維納米材料，因其具有優(yōu)異的物理、電化學(xué)性質(zhì)而被應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域[51-52]。研究發(fā)現(xiàn)GQDs 的細(xì)胞毒性不同于石墨烯和氧化石墨烯。Zhang 等[53]發(fā)現(xiàn)GQDs 的細(xì)胞毒性低于微米尺寸的氧化石墨烯。然而也有實(shí)驗(yàn)表明，GQDs 可以造成人體細(xì)胞的死亡，并且高濃度的GQDs 具有一定的毒性[54]。本課題組[55]通過分子動(dòng)力學(xué)模擬研究發(fā)現(xiàn)高濃度的GQDs 能夠引起細(xì)胞膜磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的改變。圖7 顯示了同一尺寸、不同濃度的GQD7 進(jìn)入細(xì)胞膜后的分布情況，在四種不同濃度的體系中，GQD7 都能夠在細(xì)胞膜內(nèi)部分散開來，并且絕大多數(shù)GQD7單分散在細(xì)胞膜兩側(cè)。為了進(jìn)一步觀察GQD7 穿膜的過程，將數(shù)量為36 個(gè)分子的GQD7 體系模擬時(shí)間延長至200 ns(圖8)。圖8(a)顯示大部分的GQDs 在進(jìn)入細(xì)胞膜之前就呈現(xiàn)聚集狀態(tài)，這和C60進(jìn)入細(xì)胞膜的過程是相似的[56]。此后，在20 ns 和60 ns [圖8(b), (c)] 階段，GQDs 還是有一部分聚集在一起，這一點(diǎn)可以在圖9 的團(tuán)簇分析中得到證實(shí)。然而，在110 ns時(shí)團(tuán)簇中的大部分GQDs開始平行于細(xì)胞膜表面。圖10分析了GQDs表面和細(xì)胞膜xy平面的角度變化，從圖中可以看出GQDs表面和細(xì)胞膜xy平面的平均夾角分布在45°～60°之間。與此同時(shí)，隨著模擬時(shí)間的延長，數(shù)量為36 個(gè)分子的GQD7的最大團(tuán)簇?cái)?shù)量從33個(gè)降到10個(gè)，這表明在滲透進(jìn)入細(xì)胞膜后，GQD7 的聚集體趨向于在細(xì)胞膜的兩側(cè)解離并分散到能量最小的位置。由此可估測所有的GQD7分子在足夠長的模擬時(shí)間內(nèi)可以單分散在細(xì)胞膜內(nèi)部。這些結(jié)果表明高濃度的GQD7 傾向于通過聚集體進(jìn)入細(xì)胞膜中，并在進(jìn)入細(xì)胞膜后單分散開，進(jìn)而影響磷脂分子的結(jié)構(gòu)甚至可能影響細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)。

2 石墨烯與蛋白質(zhì)的相互作用

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要體現(xiàn)者,人類蛋白質(zhì)組中的蛋白種類估計(jì)有100多萬種。石墨烯納米材料與細(xì)胞內(nèi)生物分子(如DNA、蛋白質(zhì))之間的相互作用會(huì)干擾生物功能，導(dǎo)致細(xì)胞毒性作用[35]。有研究發(fā)現(xiàn)，石墨烯對多肽、蛋白片段、蛋白的結(jié)構(gòu)都有一定的破壞力。比如Matesanz 等[57]發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯納米片可以通過定位肌動(dòng)蛋白絲來誘導(dǎo)細(xì)胞周期改變。Wang 等[58]設(shè)計(jì)了不同表面的石墨烯，如純石墨烯、疏水性石墨烯、氧化石墨烯、表面N 摻雜的石墨烯、表面受限制的石墨烯等，利用分子動(dòng)力學(xué)模擬來研究FPA(Fibrinopeptide-A，纖維蛋白肽A)蛋白與這些石墨烯的相互作用。結(jié)果表明它們都能或多或少地改變FPA 的形態(tài)，但用氧和氮原子修飾的石墨烯表面可以更有效地與FPA 或其他一些生物分子相互作用，從而改變它們的形態(tài)和電學(xué)性質(zhì)，包括疏水性。

2.1 有缺陷的石墨烯和蛋白質(zhì)相互作用

圖8 濃度為36個(gè)分子的GQD7穿越細(xì)胞膜的過程[55]Fig.8 Aggregated structures and distribution of GQD7-36 during simulation[55]

圖9 數(shù)量為36個(gè)分子的GQD7系統(tǒng)中的團(tuán)簇分析[55]Fig.9 Number of cluster and maxsize of cluster in GQD7-36 system as a function of simulation time[55]

圖10 濃度為36個(gè)分子的GQD7和細(xì)胞膜之間的角度變化[55]Fig.10 Angle distribution of GQD7 in lipid membrane during simulation[55]

由于石墨烯在生產(chǎn)過程中容易受到操作手段及環(huán)境等影響，不可避免地會(huì)生成一些不完整的、有缺陷的石墨烯。雖然有缺陷的石墨烯可以用于DNA 測序、氣體分離、海水淡化等方面[59-62]，但是有研究發(fā)現(xiàn)，這種有缺陷的石墨烯也會(huì)和生物大分子發(fā)生相互作用并對其結(jié)構(gòu)造成一定的影響。比如Li等[63]采用分子動(dòng)力學(xué)方法將完整的石墨烯和有缺陷的石墨烯做了比較，發(fā)現(xiàn)相較于完整的石墨烯，有缺陷的石墨烯對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)影響更大。圖11(a)、(b)顯示了YAP65WW 蛋白的均方根位移(RMSD)隨時(shí)間的變化，可以發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)和有缺陷的石墨烯結(jié)合后其結(jié)構(gòu)變化更為明顯，而完整的石墨烯在吸附蛋白質(zhì)后，蛋白質(zhì)的RMSD 幾乎沒有變化。為了進(jìn)一步說明YAP65WW蛋白吸附在兩種石墨烯表面的過程，Li 等又分析了蛋白質(zhì)和兩種石墨烯之間接觸的重原子數(shù)量隨時(shí)間的分布，如圖11(c)、(d)所示。圖11(c)顯示蛋白質(zhì)和有缺陷的石墨烯之間的原子數(shù)量變化分為三個(gè)階段：第一階段在開始的幾個(gè)納秒之間，原子數(shù)量從20增加到50；第二階段，原子數(shù)量從50 增加到80；最后原子數(shù)量增加到110，并且圖中也顯示在最后階段，YAP65WW 蛋白完全地展開在有缺陷的石墨烯表面上，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞較大。而圖11(d)表明蛋白質(zhì)和完整的石墨烯之間接觸的原子數(shù)量變化只有兩個(gè)階段，第一階段原子數(shù)量從20 增加到40，第二階段從60 增加到80。并且在圖中也能看見蛋白質(zhì)在完整的石墨烯表面有一部分呈現(xiàn)折疊狀態(tài)，并沒有完全地展開。這些模擬結(jié)果表明，蛋白質(zhì)更易在有缺陷的石墨烯表面吸附并展開，其結(jié)構(gòu)破壞更大。

2.2 純石墨烯和蛋白質(zhì)的相互作用

圖11 分子動(dòng)力學(xué)模擬中石墨烯和YAP65WW蛋白質(zhì)之間相互作用時(shí)蛋白質(zhì)RMSD的變化及兩者間接觸的原子數(shù)量的變化[63]Fig.11 Time evolution of root-mean-squared deviation(RMSD)of YAP65WW and contact number of heavy atoms between YAP65WW and graphene[63]

研究發(fā)現(xiàn)石墨烯能插入一些蛋白質(zhì)復(fù)合物，破壞其整體結(jié)構(gòu)，從而使其蛋白質(zhì)的功能喪失。例如Luan等[64]使用全原子分子動(dòng)力學(xué)模擬方法將石墨烯與蛋白質(zhì)混合，通過探討蛋白質(zhì)之間的相互作用揭示石墨烯的潛在毒性。如圖12(a) 分析了在4 次獨(dú)立的模擬過程中蛋白質(zhì)二聚體之間的接觸面積隨時(shí)間的變化，研究發(fā)現(xiàn)在沒有插入石墨烯的初始階段，蛋白質(zhì)二聚體之間的接觸面積在300～350 ?2(1 ?=0.1 nm)之間，插入石墨烯之后，蛋白質(zhì)二聚體之間的接觸面積逐漸減少至零，說明疏水性的石墨烯可以插入蛋白質(zhì)二聚體的疏水界面中，從而破壞蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。圖12(b)～(e)描述的是石墨烯片侵入二聚體之間的過程。這一過程是通過石墨烯片和蛋白質(zhì)之間的范德華力(vdW)作用的，由于石墨烯表面是疏水性的，石墨烯和水分子之間的相互作用小于其和蛋白質(zhì)之間的相互作用，因此蛋白質(zhì)表面的疏水殘基會(huì)吸附到石墨烯表面[26]。石墨烯片通過旋轉(zhuǎn)的方式侵入二聚體之間，并且在2 ns時(shí)石墨烯開始接觸其中一個(gè)蛋白質(zhì)單體，而石墨烯片的一個(gè)邊緣保留在二聚體界面附近。在30 ns時(shí)，石墨烯和蛋白質(zhì)單體之間接觸的面積增多。在30～40 ns階段，由于石墨烯表面和二聚體界面上的非極性殘基之間的疏水作用，蛋白質(zhì)單體開始圍繞其中心軸開始旋轉(zhuǎn)。與此同時(shí)，另一個(gè)蛋白質(zhì)單體界面上的非極性殘基開始與石墨烯片的另一邊接觸。56 ns 時(shí)，石墨烯片已經(jīng)完全侵入二聚體之間，并將二聚體分開。圖12(f)～(i)顯示了石墨烯侵入蛋白質(zhì)二聚體之間的另一種方式。模擬開始時(shí)石墨烯片位于二聚體的對側(cè)，石墨烯表面可以與兩個(gè)單體上的疏水殘基接觸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)石墨烯片快速地插入二聚體的疏水表面，并且在3 ns 內(nèi)將二聚體分開。總之，這兩種模擬都能表明石墨烯片可以通過與蛋白質(zhì)之間的疏水作用快速地進(jìn)入蛋白質(zhì)二聚體內(nèi)并將其分開，破壞其結(jié)構(gòu)，從而造成蛋白質(zhì)功能紊亂。

圖12 (a)蛋白質(zhì)二聚體之間的接觸面積隨石墨烯插入時(shí)間的變化；(b)～(i)石墨烯插入蛋白質(zhì)二聚體之間的過程[64]Fig.12 (a)Time-dependent contact areas of dimer during insertion of a graphene sheet；(b)—(i)Snapshots of insertion process of graphene sheet into dimer[64]

圖13 蛋白質(zhì)吸附在石墨烯表面的過程及相關(guān)分析[26]Fig.13 Representative trajectory and analysis of HP35 adsorbing onto graphene[26]

圖14 氧化墨烯和蛋白質(zhì)的相互作用[65]Fig.14 Insertion process of GO nanosheet into interstrand gap of actin tetramer[65]

石墨烯除了可以插入蛋白質(zhì)之間，還可以通過與蛋白質(zhì)表面的殘基相互作用從而吸附蛋白質(zhì)，改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。Zuo 等[26]利用分子動(dòng)力學(xué)模擬還發(fā)現(xiàn)石墨烯可以通過π-π 相互作用與絨毛蛋白(HP)的芳香族殘基相結(jié)合，從而破壞蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。如圖13(a)所示，在模擬時(shí)間500 ns 內(nèi)HP 蛋白逐漸吸附到石墨烯表面。在3 ns 時(shí)，F(xiàn)35 殘基吸附在石墨烯表面，此時(shí)HP 蛋白與石墨烯表面的接觸面積增加到250 ?2[圖13(b)]；在t=7 ns 時(shí)，W23 殘基開始吸附在石墨烯表面，且HP 蛋白與石墨烯表面的接觸面積從250 ?2增加到300 ?2，同時(shí)HP 蛋白的第三條α 螺旋也開始吸附到石墨烯表面；在t=145 ns 時(shí)，F(xiàn)10 殘基吸附到石墨烯表面，蛋白質(zhì)與石墨烯之間的接觸面積從300 ?2增加到750 ?2，并且HP 蛋白的第二條α 螺旋開始吸附到石墨烯表面。圖13(c)進(jìn)一步說明了HP蛋白吸附在石墨烯表面上的過程：在沒有石墨烯插入的情況下，HP 蛋白的RMSD 是1.8 ?，此時(shí)HP蛋白處于穩(wěn)定的環(huán)境并且α螺旋上有23 或24 個(gè)殘基；然而當(dāng)石墨烯插入HP 蛋白后，其RMSD 從1.8 ? 增加到7.5 ?，且α 螺旋上的殘基數(shù)下降到10 個(gè)。HP 蛋白的三條α 螺旋中，第三條α 螺旋大部分被破壞，部分轉(zhuǎn)變成310螺旋和β轉(zhuǎn)角，第一條α 螺旋也有一部分轉(zhuǎn)變成β 折疊，第二條α螺旋幾乎沒有變化。這三條螺旋表現(xiàn)不同可能因?yàn)槠渎菪辖M成的氨基酸殘基不同。為了進(jìn)一步研究殘基對HP 蛋白質(zhì)吸附的影響，Zuo 等分析了殘基距離石墨烯表面的距離，如圖13(d)所示。觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)35、W23、F10 殘基通過和石墨烯之間的強(qiáng)烈的π-π 相互作用，先后分別吸附在石墨烯表面。因此，這些研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的氨基酸殘基可以控制蛋白質(zhì)吸附在石墨烯表面的過程，在吸附過程中其二級結(jié)構(gòu)遭到了破壞。

2.3 氧化石墨烯和蛋白質(zhì)的相互作用

氧化石墨烯和石墨烯都會(huì)破壞蛋白片段的二級結(jié)構(gòu)，但石墨烯的破壞力較強(qiáng)，且在石墨烯表面螺旋結(jié)構(gòu)會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)棣抡郫B。為進(jìn)一步研究氧化石墨烯插入蛋白質(zhì)之間的過程，Tian 等[65]利用分子動(dòng)力學(xué)模擬研究發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯納米片能夠吸附肌動(dòng)蛋白單體，從而改變其二級結(jié)構(gòu)。圖14(a)顯示了肌動(dòng)蛋白四聚體和氧化石墨烯之間的三次獨(dú)立的動(dòng)力學(xué)模擬過程，研究發(fā)現(xiàn)插入氧化石墨烯后，隨著模擬時(shí)間的延長，肌動(dòng)蛋白四聚體之間的重原子接觸數(shù)量急劇減少。圖14(b)～(d) 顯示了氧化石墨烯片插入兩個(gè)蛋白質(zhì)二聚體之間的過程，發(fā)現(xiàn)在前兩次模擬過程中，當(dāng)時(shí)間為100 ns時(shí)，肌動(dòng)蛋白四聚體被氧化石墨烯片分開，這兩個(gè)蛋白質(zhì)二聚體在氧化石墨烯表面表現(xiàn)出異步的移動(dòng)方式。在第三次模擬過程中，在120 ns時(shí)，氧化石墨烯也會(huì)插入兩個(gè)蛋白質(zhì)二聚體之間，破壞其結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果表明氧化石墨烯納米片通過范德華相互作用能插入肌動(dòng)蛋白四聚體之間的鏈間間隙，破壞四聚體結(jié)構(gòu)，從而在很大程度上破壞肌動(dòng)蛋白的整體結(jié)構(gòu)。

2.4 石墨烯量子點(diǎn)和蛋白質(zhì)的相互作用

圖15 HP35吸附在不同大小的GQDs表面上的RMSD隨模擬時(shí)間的變化[67]Fig.15 Time evolution of RMSD of HP35 protein on GQDs with different size[67]

圖16 HP35蛋白吸附在不同大小的GQDs表面上的二級結(jié)構(gòu)變化[67](其中二級結(jié)構(gòu)根據(jù)DSSP算法得到[68])Fig.16 Time evolution of the secondary structure of HP35 upon binding to the surface of GOQDs with different size[67](here,the secondary structures are determined by DSSP program[68])

石墨烯量子點(diǎn)的潛在生物毒性不容忽視，研究發(fā)現(xiàn)石墨烯量子點(diǎn)能夠和蛋白質(zhì)等生物大分子相互作用。比如Fang 等[66]采用實(shí)驗(yàn)和分子動(dòng)力學(xué)模擬相結(jié)合的方法，發(fā)現(xiàn)GQDs 可以通過識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)吸附泛素蛋白。本課題組[67]運(yùn)用分子動(dòng)力學(xué)模擬方法研究了不同尺寸的石墨烯量子點(diǎn)(GQDs)對蛋白質(zhì)HP35 吸附的結(jié)構(gòu)影響。研究發(fā)現(xiàn)GQDs 的尺寸越大，殘基的吸附能力越強(qiáng)，吸附在GQDs 上的殘基數(shù)量也越多，而且對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)破壞也越大，進(jìn)而對蛋白質(zhì)產(chǎn)生一定的毒性。如圖15 所示，通過計(jì)算RMSD 來分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，在四個(gè)不同尺寸的GQDs體系中RMSD值分別穩(wěn)定在0.16、0.24、0.24、0.36 nm，其 中 圖15(d) 顯 示HP35-GQD275這一體系的第三條軌跡在47 ns內(nèi)RMSD值從0.2 nm 增加到0.78 nm，第四條軌跡在183 ns 之內(nèi)RMSD 值從0.2 nm 增加到0.56 nm，與其他三個(gè)體系相比，變化最為明顯。為了驗(yàn)證RMSD這一結(jié)果，又做了蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)分析，如圖16所示。在圖16(d)中，發(fā)現(xiàn)HP35-GQD275的結(jié)構(gòu)變化最為明顯，其中第三條α 螺旋部分轉(zhuǎn)變?yōu)?10螺旋、轉(zhuǎn)角及卷曲，第一條α 螺旋部分轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)角，但是其他三個(gè)體系[圖16(a)、(b)、(c)]的蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)改變就相對較小。通過計(jì)算RMSD 和對蛋白質(zhì)進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)GQDs的大小對蛋白質(zhì)吸附在GQDs表面上起著重要的作用，并且隨著GQDs 尺寸的增加，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化更明顯。圖17 詳細(xì)介紹了蛋白質(zhì)在最大尺寸GQDs 上的吸附過程，在第47 ns 時(shí)，位于第三條α 螺旋的最末端芳香族殘基W23 開始吸附在GQD275 表面[圖17(a)]，與 此同時(shí)，W23 殘基與GQD275 表面之間的最短距離是0.36 nm[圖17(b)]。在第57 ns 時(shí)，芳香族殘基F10 也吸附在GQD275 表面[圖17(a)]，此時(shí)F10 殘基與GQD275 表面之間的最短距離也是0.36 nm。這些最短距離和文獻(xiàn)中描述芳香族殘基與石墨材料之間的最短距離約為0.4 nm大致相近[26]。

3 石墨烯與DNA的相互作用

DNA 是染色體的主要組成成分，同時(shí)也是主要遺傳物質(zhì)。DNA 分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)是相對穩(wěn)定的。這是因?yàn)樵贒NA 分子雙螺旋結(jié)構(gòu)的內(nèi)側(cè)，通過氫鍵形成的堿基對使兩條脫氧核苷酸長鏈穩(wěn)固地并聯(lián)起來。另外，堿基對之間縱向的相互作用力也進(jìn)一步加固了DNA 分子的穩(wěn)定性。生物分子(如DNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜)與納米級材料的結(jié)合為高級復(fù)合納米材料的設(shè)計(jì)提供了機(jī)會(huì)。由于碳基納米材料獨(dú)特的物理化學(xué)結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能等，現(xiàn)已被廣泛用于生物傳感、生物醫(yī)療等各個(gè)領(lǐng)域[69-71]。比如氧化石墨烯因其具有良好的吸附性，可與DNA 結(jié)合用于生物傳感器[72-73]。含有納米孔的石墨烯表面可作為DNA 測序的潛在材料，其中石墨烯表面的工程化形態(tài)將調(diào)節(jié)DNA 的遷移和易位[74-77]。比如，Jagota 等[78]模擬了單鏈DNA 在石墨烯和碳納米管上的二級結(jié)構(gòu)變化，他們發(fā)現(xiàn)可以通過鏈間氫鍵建立一類DNA結(jié)構(gòu)(β折疊和β桶)，并且單鏈DNA在石墨表面上呈平面形式。

3.1 純石墨烯和DNA相互作用

Zhao[79]使用分子動(dòng)力學(xué)模擬研究了DNA 片段與水溶液中石墨烯表面的相互作用，發(fā)現(xiàn)雙鏈DNA在石墨烯表面吸附過程中結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞。圖18 顯示了DNA 片段可以快速調(diào)整它們的幾何取向，并在石墨烯表面上形成兩種不同的自組裝結(jié)構(gòu)。第一種自組裝結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為DNA 片段1,3 和4 能夠旋轉(zhuǎn)并穩(wěn)定在“站立”狀態(tài)。DNA 雙螺旋的軸在30 ns 內(nèi)逐漸從平行幾何形狀轉(zhuǎn)變?yōu)榇怪睅缀涡螤睿@導(dǎo)致旋轉(zhuǎn)的DNA 片段在表面上形成森林狀結(jié)構(gòu)。在觀察到的第二種類型的自組裝結(jié)構(gòu)中，DNA 片段2 位于石墨烯表面上并保持其原始取向。在50 ns 模擬時(shí)間內(nèi)都保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生移動(dòng)。促使形成這兩種模式背后的驅(qū)動(dòng)力是疏水性DNA 堿基對與石墨烯碳環(huán)之間的π-π 堆積作用。特別是當(dāng)DNA在第二類自組裝中與石墨烯表面穩(wěn)定結(jié)合時(shí)，DNA的末端堿基對由于嚴(yán)重變形而斷裂，從而對DNA 產(chǎn)生潛在的細(xì)胞毒性。

3.2 氧化石墨烯和DNA的相互作用

圖17 HP35吸附到石墨烯量子點(diǎn)表面的過程[67]Fig.17 Adsorption progress of HP35 on graphene quantum dots[67]

圖18 DNA吸附在石墨烯表面的過程[79]Fig.18 Self-assembly of DNA segments on graphene layers[79]

圖19 雙鏈DNA吸附在石墨烯和氧化石墨烯表面的相關(guān)分析[80]Fig.19 Interaction between DNA and graphene and graphene oxide[80]

有研究表明石墨烯、C60、碳納米管等碳基納米材料與DNA 的相互作用，會(huì)破壞DNA 的堿基對，從而破壞DNA 的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而可能影響DNA 的功能。Chen 等[80]研究了短鏈DNA 在石墨烯和氧化石墨烯上的吸附方式，發(fā)現(xiàn)單鏈DNA 傾向于平躺在石墨烯和氧化石墨烯表面，而雙鏈DNA 則是垂直于石墨烯和氧化石墨烯表面，從而減少了其與碳表面之間的接觸面積，使得石墨烯和氧化石墨烯的吸附能力也減弱。如圖19(c) 所示，γ=0 (cosγ= 1) 表明雙鏈DNA 以垂直方式吸附在石墨烯和氧化石墨烯表面。圖19(d) 表明雙鏈DNA 可以在石墨烯表面自由移動(dòng)，而在25 ns 時(shí)，雙鏈DNA 在氧化石墨烯表面的結(jié)合位點(diǎn)開始不再改變，并緊緊吸附在氧化石墨烯表面上。圖19(a)、(b)表明雙鏈DNA 和石墨烯、氧化石墨烯的相互作用主要靠范德華力和氫鍵。本次模擬結(jié)果表明，氧化石墨烯更傾向于吸附單鏈DNA 而不是雙鏈DNA。通過比較雙鏈DNA 在石墨烯和氧化石墨烯上的結(jié)合位點(diǎn)，還發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯具有更好的吸附能力。因此，氧化石墨烯通過吸附DNA 與DNA發(fā)生相互作用從而破壞DNA的堿基對，進(jìn)而破壞DNA的結(jié)構(gòu)，給DNA帶來潛在的生物毒性。

3.3 氮化石墨烯和DNA的相互作用

Gu 等[24]通過分子動(dòng)力學(xué)模擬和瓊脂糖凝膠電泳分析，研究了雙鏈DNA 與新近合成的氮化石墨烯(C2N)相互作用的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)變化，發(fā)現(xiàn)雙鏈DNA 以垂直的方式吸附在C2N 表面上。圖20 顯示雙鏈DNA 吸附在石墨烯過程中其界面處的端基對會(huì)發(fā)生變性，即堿基間氫鍵斷裂，釋放的堿基與石墨烯原子直接結(jié)合，在此期間DNA 和石墨烯表面接觸的原子數(shù)目也相應(yīng)地增加。相比較而言，DNA 吸附在C2N 表面上的強(qiáng)度比較溫和，DNA 結(jié)構(gòu)破壞程度也較石墨烯低。上述研究表明，雙鏈DNA 和單鏈DNA在石墨烯表面有不同的吸附方式，雙鏈DNA垂直于石墨烯表面而單鏈DNA 平行于石墨烯表面，因此石墨烯更傾向于吸附雙鏈DNA。在吸附過程中，雙鏈DNA 堿基對之間的氫鍵(特別是AT 間的氫鍵)斷裂，釋放的堿基與石墨烯原子直接結(jié)合，破壞DNA 堿基對的結(jié)構(gòu)。因此石墨烯對DNA 具有一定的潛在毒性。

4 結(jié)論與展望

圖20 雙鏈DNA吸附在石墨烯表面及C2N表面上的過程[24]Fig.20 Interaction between dsDNA and graphene and C2N[24]

雖然石墨烯等納米材料具有獨(dú)特的物理、化學(xué)性質(zhì)，并在生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，但是其生物安全性應(yīng)引起人們的重視。本文總結(jié)了當(dāng)前已報(bào)道的石墨烯及其衍生物在生物毒性方面的計(jì)算機(jī)模擬研究，研究表明石墨烯及其衍生物具有潛在的生物毒性：石墨烯可以吸取細(xì)胞膜表面的磷脂分子，破壞細(xì)胞膜的完整性；石墨烯通過π-π 相互作用能夠破壞蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和DNA 堿基對等。石墨烯及其衍生物自身的物理化學(xué)性質(zhì)對其生物效應(yīng)有著決定性影響，這些性質(zhì)包括尺寸、形狀、表面電荷、化學(xué)組成、表面修飾等。有關(guān)這些因素對生物膜毒性影響的研究還比較少，因此，進(jìn)一步研究石墨烯及其衍生物的物理化學(xué)性質(zhì)對生物膜毒性的影響十分必要。除此之外，生物環(huán)境中的鹽濃度、溫度、pH 等對石墨烯及其衍生物的生物毒性的影響也不是特別清楚，石墨烯及其衍生物對具體哪些蛋白質(zhì)、生物膜的毒性影響仍然不清楚，即蛋白質(zhì)、生物膜的種類對石墨烯及其衍生物的生物毒性的影響機(jī)制尚不明確。目前國內(nèi)外對石墨烯與生物體相互作用的機(jī)制研究尚處于初級階段，石墨烯作用于生物體后引發(fā)的生理、生化反應(yīng)及機(jī)制尚未有深入的研究，因此，相關(guān)領(lǐng)域的研究人員應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)石墨烯及其衍生物的生物安全性研究，強(qiáng)化石墨烯及其衍生物對生物體作用的機(jī)制研究。