劉宏梅 韋文飛 農(nóng)愛紅 盧少坤 陸必科

（百色市動物疫病預(yù)防控制中心，廣西 百色市 533000）

氯霉素（Chloroamphenicol，CAP）是一種廣譜抗生素[1]，隨著家禽養(yǎng)殖業(yè)的集約化與規(guī)模化發(fā)展，家禽的疾病更加頻繁發(fā)生，氯霉素以它對多種病原菌有較強的抑制作用和低廉的價格,而曾被廣泛應(yīng)用于動物生產(chǎn)[2]。但由于氯霉素存在嚴(yán)重的副作用，殘留的氯霉素通過食物鏈進入人體后，對人體構(gòu)成長期、慢性和積累性的潛在危害，并誘發(fā)致病菌的耐藥性。能引起造血系統(tǒng)嚴(yán)重不良反應(yīng),主要是抑制骨髓造血機能[3]，對人類健康造成極大威脅，歐美等發(fā)達國家已相繼禁止或嚴(yán)格禁止使用，我國也明確規(guī)定在動物源性食品中不得檢出氯霉素。由于經(jīng)濟利益的驅(qū)使，加之檢測難度大，氯霉素在畜牧業(yè)中的使用仍未能得到有效控制和禁止，藥物殘留依然日益突顯。所以選擇一種高效、便捷、實用的快速檢測方法成為業(yè)內(nèi)人士亟待的目標(biāo)。傳統(tǒng)上常用高效液相色譜法，但其紫外檢測器在納克級缺乏敏感性；氣相色譜法靈敏度高，檢測限低，但它檢測樣本少，很難用于大規(guī)模檢測，無法滿足實際工作需要；液質(zhì)聯(lián)用法與氣質(zhì)聯(lián)用法可同時定性和定量，但對儀器、人員素質(zhì)要求高，樣品前處理繁瑣、耗時，也不適宜大規(guī)模應(yīng)用。酶聯(lián)免疫吸附法以其檢測速度快、費用低廉、靈敏度高和選擇性強、操作簡便、試驗過程短、檢測樣品多、特異性高等特點被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)檢驗的各個領(lǐng)域中[4]。ELISA試劑盒試劑穩(wěn)定、容易保存、操作簡便，不需要精密復(fù)雜設(shè)備，對環(huán)境無污染等特點而被用于獸藥殘留檢測領(lǐng)域中。本試驗通過對氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液添加量及回收率的檢測以判斷該方法能滿足檢測飼料中氯霉素殘留的需要。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑與樣品

氯霉素殘留酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（北京望爾生物技術(shù)有限公司批號C190113A10GGX），乙酸乙酯、正己烷，試驗中所使用的試劑，除特別注明外均為分析純。實驗用水符合實驗室用水規(guī)則（GB/T6682）。試驗樣品為2019年百色市飼料和飼料添加劑產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測中所抽的飼料樣品。

1.2 儀器設(shè)備

雷杜RT?6100型酶標(biāo)儀，氮吹儀，振蕩器，離心機，天平（感量0.01g）,微量移液器（單道20～200μL，多道50～300μL，容量瓶，聚苯乙烯離心管。

1.3 樣品的制備

取粉碎并過40目銅篩的飼料樣本，作為供試樣品；以粉碎并過40目銅篩的空白樣本，作為空白對照。取粉碎并過40目銅篩的空白樣本，添加適宜濃度的對照溶液，作為空白添加試樣。

稱取1.0±0.05g試樣，加入6mL乙酸乙酯，充分振蕩5min，3000g以上離心5 min；移取3mL上層有機相至10mL潔凈干燥玻璃管中，50℃水浴氮氣流下吹干；加入1mL正己烷，渦旋1min，再加入1mL復(fù)溶工作液渦旋30s，3000g以上離心5min；除去上層有機相，取下層水相50μL用于分析。

1.4 氯霉素含量的檢測與檢測方法準(zhǔn)確度測定

分別準(zhǔn)確稱取8份重量為1.0g空白試料，分別加入8個10mL聚四氟乙烯離心管中，均分為4組，每組2個重復(fù)。每組分別加入0μL、10μL、30μL、50μL的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液（10霉素標(biāo)準(zhǔn)），分別配制成0μg/kg（空白平行對照）、0.1μg/kg、0.3μg/kg、0.5μg/kg平行樣本。按試劑盒使用說明書進行嚴(yán)格規(guī)范操作。

1.5 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

采用間接競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔上包被偶聯(lián)抗原，加入一定體積標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中殘留的氯霉素和酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭氯霉素酶結(jié)合物，用TMB底物顯色，標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的吸光度值與其所含殘留物氯霉素的含量成負(fù)相關(guān)。具體操作嚴(yán)格按試劑盒使用說明書進行規(guī)范操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定分析

測出相應(yīng)吸光度值后，分別以0ppb、0.025ppb、0.075ppb、0.3ppb、1.2ppb、4.8ppb氯霉素標(biāo)準(zhǔn)對照品的百分吸光率為縱坐標(biāo)，以氯霉素各標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=?0.2394X+1.0668，相關(guān)系數(shù)為0.9910，具體標(biāo)準(zhǔn)曲線圖如圖1所示。

2.2 氯霉素添加回收試驗結(jié)果

圖1 氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

將測得的樣品百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品所對應(yīng)的濃度，乘以其所對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣品中氯霉素的實際濃度。添加回收試驗結(jié)果為：0.1μg/kg添加OD值分別為1.398、1.396，實測濃度為0.104、0.105；0.3μg/kg添加OD值分別為0.912、0.910，實測濃度為0.306、0.308；0.5μg/kg添加OD值分別為0.688、0.686，實測濃度為0.502、0.504。添加平衡回收率分別為105.0%、102.0%、100.6%，變異系數(shù)分別為 0.48%、0.33%、0.20%，具體添加回收試驗結(jié)果如表1所示。由試驗結(jié)果可知本方法在 0.1μg/kg、0.3μg/kg、0.5μg/kg添加濃度的回收率為70%～120%以內(nèi)，批內(nèi)變異系數(shù)≤5%，具有較高的準(zhǔn)確度和靈敏度。

3 討論與分析

由試驗結(jié)果可知，本方法具有較高的準(zhǔn)確度和靈敏度，滿足飼料中氯霉素殘留的檢測需要。

ELISA方法為目前國內(nèi)最常用的抗生素殘留檢測方法之一[5]，具有靈敏度高，特異性強，重復(fù)性好，可進行定量及半定量測定的優(yōu)點，但該方法受反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、洗滌徹底性等因素影響，操作步驟較多，要求操作熟練，否則易出現(xiàn)假陽性和不易定量，需要色譜法進一步定量和確證。

在使用前，所有試劑應(yīng)恢復(fù)到室溫并搖勻，以保證試劑的均一性。加樣時要垂直加到孔底，不能有氣泡；整個加樣過程要迅速，以保證各加樣孔反應(yīng)時間相對一致。

洗板時一定要迅速，保證每個孔放置時間一致。加洗滌液時不可溢出，以免造成交叉污染。洗滌后甩掉液體、拍干，洗板次數(shù)、洗液量的多少、浸泡時間的長短、洗板的力度等都可能會造成跳孔或出現(xiàn)背景高。

在加入終止液后要在最短的時間內(nèi)上機檢測，否則吸光度會隨著時間的延長而受各種環(huán)境因素的影響發(fā)生變化，造成測試結(jié)果不準(zhǔn)確。

鑒于ELISA方法具有簡便、省時、省力的優(yōu)點，建議在日常獸藥殘留監(jiān)控工作中，可以先用ELISA方法進行初篩，再對篩選出的陽性樣品用精確方法驗證，可大大降低檢測成本，有效防止漏檢和錯判，提高工作效率。

本試驗驗證了ELISA法測定家禽飼料中氯霉素含量的可行性，證實該方法簡便快捷、重復(fù)性好，回收率和檢出限令人滿意，從而為今后飼料中氯霉素殘留檢測提供技術(shù)參考。

表1 添加回收試驗結(jié)果