郭海, 馬海平, 張永強, 王江

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科, 新疆 烏魯木齊 830054)

隨著社會的發(fā)展, 老年冠心病患者逐年增多, 對于此類患者心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷是影響其壽命的主要原因, 目前心肌保護(hù)的研究熱點在于細(xì)胞衰老和再生復(fù)制的內(nèi)在機制[1-2]。 在心肌細(xì)胞自我修復(fù)的過程中, 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse trameripmse, TERT)扮演著重要的角色, 有研究[3-4]報道心肌缺氧復(fù)氧損傷時TERT被誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)揮心肌保護(hù)作用。 但在不同的缺氧時間下, TERT具體的表達(dá)情況尚未見報道。 本研究對H9C2心肌細(xì)胞株實施不同時間缺氧復(fù)氧損傷, 觀察不同缺血情況下心肌組織端粒酶的表達(dá)情況, 進(jìn)而探究TERT對缺血心肌的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

H9C2大鼠胚胎心肌細(xì)胞株購自凱基生物; CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Smart Cell HF-90)購自上海力康儀器有限公司; DHG型熒光倒置顯微鏡(Eclipse TS100-F)購自日本尼康公司; 胎牛血清(FBS)購自美國Life technologies公司; 磷酸鹽緩沖液粉劑(PBS)(ZLI-9062)購自北京中杉金橋生物公司; DMEM(高糖)培養(yǎng)(C11965500BT)、 青霉素-鏈霉素雙抗(10 000 U, SC30010)、 0.25%胰蛋白酶(Trypsin-EDTA, 25200-056)均購自Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 缺氧損傷模型[5]先將低氧混合氣體(94% N2和5% CO2, 1%O2)預(yù)充缺氧緩沖液30 min[磷酸氫鈉(NaH2PO4) 0.9 mmol/L, 氯化鉀(KCl) 10.0 mmol/L, NaHCO36.0 mmol/L, 氯化鈉(NaCl) 98.5 mmol/L, 氯化鈣(CaCl2) 1.8 mmol/L, 硫酸鎂(MgSO4) 1.2 mmol/L, HEPES 20 mmol/L], pH 6.8, 將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液替換成為氧緩沖液, 培養(yǎng)皿放置在充入低氧混合氣體的環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2.2 缺氧復(fù)氧方案[5]缺氧復(fù)氧時間, 本研究參照前期研究結(jié)果, 選取最佳復(fù)氧時間, 具體如下, 將缺氧損傷后的細(xì)胞更換正常培養(yǎng)液, 于37 ℃、 5% CO2常氧培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h。

1.2.3 實驗分組及處理 (1)正常對照組: 正常進(jìn)行培養(yǎng); (2)缺氧3 h組: 缺氧3 h, 后進(jìn)行復(fù)氧3 h; (3)缺氧6 h組: 缺氧6 h, 后進(jìn)行復(fù)氧3 h; (4)缺氧12 h組: 缺氧12 h, 后進(jìn)行復(fù)氧3 h。 每組分為10個培養(yǎng)皿次。

1.2.4 CCK-8法測定細(xì)胞活力 缺氧/復(fù)氧處理后, 收集細(xì)胞上清液檢測乳酸脫氫酶(LDH)含量。 貼壁細(xì)胞加入10% CCK-8溶液, 在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 1～4 h后450 nm波長下測定光密度。 設(shè)置試劑背景孔, 每組5個重復(fù)。

1.2.5 測定細(xì)胞上清液中LDH的含量 缺氧/復(fù)氧處理后, 收集96孔板各孔的細(xì)胞上清液于一個新的96孔板中, 各孔加入60 μL LDH檢測工作液, 用錫箔紙包裹后置于搖床上, 室溫孵育30 min。 在490 nm處測定吸光度(A)值。 選取≥600 nm的某一波長作為參考波長, 進(jìn)行雙波長測定。

1.2.6 Western blot檢測細(xì)胞總蛋白中TERT的表達(dá)量 取對數(shù)生長期H9C2細(xì)胞, 37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)24 h 貼壁后, 培養(yǎng)瓶(25 cm2)中細(xì)胞貼壁融合達(dá)80%時, 棄掉上清液, PBS洗滌貼壁細(xì)胞2次, 用完全培養(yǎng)液制備成0.2×104～1×104cells/mL單細(xì)胞懸液, 后續(xù)按照Western blot實驗標(biāo)準(zhǔn)操作。

2 結(jié)果

2.1 各組H9C2細(xì)胞活力的變化

缺氧處理3、 6和12 h后, 與對照組相比, 細(xì)胞株的存活率明顯下降(P<0.05, 表1), 說明本研究缺血再灌注模型的建立符合實驗要求。

組別存活率/%處理3 h處理6 h處理12 h正常對照組99.71±4.57102.17±2.0199.69±2.08H/R處理組85.32±3.09a071.99±3.06a44.90±1.89a

aP<0.05vs正常對照組.

2.2 各組H9C2細(xì)胞LDH含量的變化

缺氧處理3、 6和12 h后, 與對照組相比, 細(xì)胞株的LDH含量明顯升高(P<0.05, 表2)。

組別LDH含量(A值)處理3 h處理6 h處理12 h正常對照組0.39±0.030.43±0.010.57±0.03H/R處理組0.61±0.04a0.69±0.06a1.31±0.06a

aP<0.05vs正常對照組.

2.3 各組細(xì)胞TERT蛋白的相對表達(dá)量的變化

缺氧處理3、 6和12 h后, 與對照組相比, 各時點細(xì)胞株的TERT蛋白含量明顯增高。 其中在缺氧6 h TERT蛋白含量最高(P<0.05, 表3, 圖1)。

組別TERT蛋白處理3 h處理6 h處理12 h正常對照組0.15±0.030.13±0.020.17±0.02H/R處理組0.21±0.04a0.49±0.05ac0.26±0.02a

aP<0.05vs正常對照組;cP<0.05vs處理3、 12 h.

圖1 Western blot檢測TERT蛋白的表達(dá)

3 討論

心肌缺血再灌注損傷是老年患者圍術(shù)期最為常見的心臟不良事件, 其內(nèi)在機制被發(fā)現(xiàn)與鈣超載、 炎性反應(yīng)及氧自由基產(chǎn)生等多個因素相關(guān), 而心肌缺血再灌注損傷最終結(jié)果則會引起心肌細(xì)胞凋亡[6-8]。 真核細(xì)胞生物的染色體末端存在端粒這一特殊結(jié)構(gòu), 端粒會在細(xì)胞分裂過程中持續(xù)縮短, 而在端粒中存在特殊DNA序列, 可以防止染色體被降解, 因此, 端?？梢院芎帽Ｗo(hù)細(xì)胞染色體, 進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡, 而端粒結(jié)構(gòu)及長度的穩(wěn)定則有賴于端粒酶[9-10]。 因此, 提升和改善端粒的功能有助于缺血再灌注損傷的恢復(fù), 而提升端粒的功能, 則有賴于端粒酶活性的提升, 端粒酶的活性主要取決于TERT, 此外, TERT可以提高DNA修復(fù)蛋白的表達(dá)進(jìn)而修復(fù)DNA, 穩(wěn)定染色體結(jié)構(gòu), 并且可以促進(jìn)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖而抑制細(xì)胞凋亡[11-12]。

本研究采用了前期本課題組建立的心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型, 分別實施了3、 6、 12 h的缺氧并進(jìn)行了3 h的復(fù)氧, 與對照組相比, 心肌細(xì)胞株的存活率隨著缺氧的時間延長明顯下降。 說明本研究缺血再灌注模型的建立達(dá)到了實驗要求。 本研究發(fā)現(xiàn), 缺氧處理3、 6和12 h后, 與對照組相比, 細(xì)胞株的LDH含量明顯升高。 當(dāng)心肌細(xì)胞受損后細(xì)胞內(nèi)的LDH會滲透到細(xì)胞外液, 因此, 可以直接通過培養(yǎng)液中LDH的含量評價心肌細(xì)胞的受損情況。 有研究結(jié)果表明, 缺血心肌細(xì)胞在灌流恢復(fù)時, 血液中高含量氧分子進(jìn)入心肌細(xì)胞, 從而引發(fā)大量過氧化氫、 超氧陰離子等的產(chǎn)生[13-15]。 這些因子均能損傷細(xì)胞膜, 最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷LDH滲漏[16-17]。 染色體DNA隨著細(xì)胞增殖而不斷復(fù)制, 在這一過程中, 端粒會不斷縮短。 端粒酶可以利用自身RNA通過TERT逆轉(zhuǎn)錄過程不斷合成端粒DNA, 從而使不斷縮短的端粒得到延長, 防止因端粒縮短及消失而引發(fā)的細(xì)胞凋亡。 TERT決定了端粒酶的表達(dá)水平, 因此, TERT具有抑制細(xì)胞凋亡的功能, 同時TERT 還能抑制因大量營養(yǎng)因子減少引起的細(xì)胞凋亡[18-19]。

本研究中設(shè)置不同缺氧時間, 發(fā)現(xiàn)經(jīng)過缺氧處理, 與對照組相比, 各時點細(xì)胞株的TERT蛋白含量明顯增高。 其中在缺氧6 h TERT蛋白含量最高。 本研究認(rèn)為, 當(dāng)缺氧發(fā)生早期(3～6 h)心肌細(xì)胞端粒受損, 端粒損傷后能夠激活內(nèi)源性的修復(fù)機體, 從而激活TERT的表達(dá)起到修復(fù)作用, 但隨著缺氧時間延長, 心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重, TERT的表達(dá)也隨之下降。 本研究中探討了不同缺氧損傷時間對TERT的作用情況, 其具體作用機制尚待進(jìn)一步研究。