付學(xué)東， 王壽懿， 朱志強(qiáng)， 鄧幼平

((武漢大學(xué)中南醫(yī)院兒科， 湖北武漢 430071)

糖尿病嚴(yán)重威脅人類身體健康。2017年，全球共有4.25億成人糖尿病患者。其中，中國成人糖尿病患者人數(shù)高達(dá)1.14億, 位居世界第一, 占總數(shù)的1/4以上。糖尿病分為1型糖尿病和2型糖尿病。2型糖尿病的基本特征是葡萄糖體內(nèi)平衡失調(diào)，導(dǎo)致高血糖。其中，細(xì)胞葡萄糖攝取和內(nèi)源性葡萄糖產(chǎn)生之間的協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)對維持正常的血糖濃度具有至關(guān)重要的作用，肝細(xì)胞在此過程中具有重要影響。肝細(xì)胞通過控制葡萄糖生成(葡萄糖異生)和糖原分解的過程，改變肝葡萄糖的釋放，從而影響血糖水平[1-2]。因此，探討肝葡萄糖異生的分子機(jī)制對2型糖尿病的靶向治療具有特殊意義。

微小核糖核酸(microRNA，miRNA，miR)與2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展、防治密切相關(guān)，包括對肝細(xì)胞葡萄糖異生的影響。研究表明miR-9，miR-21，miR-214，miR-451等參與對胰島素抵抗和肝細(xì)胞葡萄糖異生的調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致血糖水平升高，促進(jìn)糖尿病的發(fā)生、發(fā)展[3-6]。miR-106b被認(rèn)為是一個(gè)原癌基因(oncogene)，參與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、與惡化[7-8]。此外，miR-106b還具有其他功能，如通過對NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，核因子活化B細(xì)胞κ輕鏈增強(qiáng)子)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，miR-106b的過度表達(dá)可減輕心臟內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥損傷[9]。由于在胰島素抵抗的骨骼肌組織中高表達(dá)，miR-106b也被認(rèn)為與骨骼肌的胰島素抵抗和2型糖尿病的發(fā)生相關(guān)[10-11]。研究表明，miR-106b除調(diào)節(jié)胰島素抵抗、脂肪細(xì)胞分化等與糖尿病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的因素外，還可以直接影響血糖水平[10-11]。盡管肝葡萄糖異生在血糖升高和糖尿病的發(fā)生、發(fā)展中具有重要意義，但miR-106b對肝葡萄糖異生的影響未見報(bào)道。本研究的目的旨在觀察miR-106b對肝細(xì)胞葡萄糖異生的影響，并探討其可能的機(jī)制，為糖尿病的發(fā)生、發(fā)展提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為降糖治療提供新的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、主要儀器

DMEM液體培養(yǎng)基、FBS、penicillin/streptomycin等購自Gibco公司；抗STAT3(signal transducer and activator of transcription 3，信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3)和磷酸化STAT3抗體購自Cell Signaling Technology公司；抗PEPCK(phosphoenolpyruvate carboxykinase，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶)和G6Pase(glucose-6-phosphatase，葡萄糖-6-磷酸酶)抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司；抗tubulin抗體和所有II 抗均購自Sigma-Aldrich公司；STAT3抑制劑NSC74859 來源于Selleck公司；成熟miR-106b序列為：5’-CCGCACUGUGGGUACUUGCUGC-3’，其模擬物(mimic)和抑制物(antagomiR)、以及相應(yīng)的對照物(negative control)均來源于Ambion公司(貨號(hào)：MC12321，4464058，AM17010)；Lipofectamine 2000 RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑、及其DMEM購自Invitrogen公司。

本研究中使用的關(guān)鍵儀器包括：IX51倒置顯微鏡來自日本Olympus株式會(huì)社，MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱來自日本SANYO公司，Applied Biosystems實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR) 平臺(tái)(7500 Fast & 7500 Real-Time PCR System)來自美國ThermoFisher公司)，蛋白免疫印跡使用的電泳儀 、制膠板、 電泳槽、成像系統(tǒng)等均來源于美國Bio-Red公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人正常肝L02細(xì)胞系來源于上海中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心(Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences，Shanghai)，在含有10% 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、2 mmol/L 谷氨酰胺(glutamine)、100 U/ml青霉素(penicillin)和100 mg/ml鏈霉素(streptomycin)的DMEM培養(yǎng)液、37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.3 L02細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-106b模擬物或抑制劑

L02細(xì)胞正常培養(yǎng)在含10% FBS的DMEM中。在本研究中，第5代L02細(xì)胞按2×105cells/ml細(xì)胞數(shù)量的濃度接種至6孔板中，培養(yǎng)18 h后的第6代L02細(xì)胞用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法如下：70%～80%融合的L02細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM中，利用Lipofectamine 2000 RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染miR-106b模擬物、抑制劑、或各自的對照物，使用濃度均為20 nmol/L, 操作嚴(yán)格按試劑說明書進(jìn)行。

1.4 培養(yǎng)液中葡萄糖含量的檢查

為檢查培養(yǎng)液中的葡萄糖含量，L02細(xì)胞培養(yǎng)于無糖無酚紅DMEM中，并加入葡萄糖異生底物(10 nmol/L 乳酸、1 mmol/L丙酮酸)、100 nmol/L 地塞米松、100 μmol/L cAMP。在20 μmol/L的miR-106b模擬物或抑制劑處理24 h后，利用葡萄糖檢查試劑盒(Glucose Assay Kit(ab65333)，Abcam公司)檢測培養(yǎng)液中葡萄糖濃度，操作嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。

1.5 定量RT-PCR

利用帶SYBR-綠色熒光(SYBR-green fluorophore)的7500 Real Time System進(jìn)行定量RT-PCR。 PCR基本過程如下，40 ng的cDNA作為模板， 95℃10 min，循環(huán)參數(shù)為95℃ 15 s、60℃ 1 min、95℃ 30 s、60℃ 15 s，共40個(gè)周期。使用儀器自帶系統(tǒng)軟件(7500 Software v2.05)分析熒光強(qiáng)度，β-actin作為內(nèi)參，利用2-ΔΔCt法獲得相對值。本研究中使用的GCK (glucokinase，葡萄糖激酶)上游引物序列為5’-GCCTTGACTCTGGTAGAGCAG-3’，下游引物序列為5’-ATCACCCTGAAGTTAGTGCCA-3’；PCK1 (phosphoenolpyruvate carboxykinase 1，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1)的上游引物序列為5’-GAAATCTTAGCATGCCTCCA-3’，下游引物序列為5’-AAATATCACACAGACACATGTGC-3’；STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription 3)；上游引物序列為5’-CTTTGAGACCGAGGTGTATCACC-3’,下游引物序列為5’-GGTCAGCATGTTGTACCACAGG-3’；beta-Actin的上游引物序列為5’-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3’，下游引物序列為5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-’3。

1.6 蛋白免疫印跡(Western blot)

實(shí)驗(yàn)按常規(guī)方法進(jìn)行，簡述如下：細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，Bradford試劑檢測蛋白含量，并調(diào)整蛋白濃度為2 μg/μl；細(xì)胞裂解液與等量的2SDS 上樣緩沖液混合，100 °C加熱10 min，14 000 r/min、4°C離心10 min，取上清用于上樣；SDS-PAGE 膠分離蛋白、電轉(zhuǎn)移蛋白到硝化纖維素膜上；5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h、 I 抗4°C過夜、II 抗室溫1 h；蛋白表達(dá)通過ECL顯示；蛋白表達(dá)的相對密度利用Quantity One軟件(Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室公司)分析。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)4次，并具有相似的結(jié)果。以內(nèi)參蛋白(如tubulin或總蛋白)為參照，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組蛋白以及磷酸化蛋白表達(dá)的相對變化值。組間比較時(shí)，設(shè)定對照組值為1，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組蛋白或磷酸化蛋白的相對變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 miR-106b對肝細(xì)胞葡萄糖異生的影響

Western blot和RT-qPCR檢測肝細(xì)胞葡萄糖異生相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-106b模擬物(mimic)的人L02肝細(xì)胞顯著增加了PEPCK和G6Pase的蛋白表達(dá) (1±0vs2.90± 0.31，P<0.01；1±0vs1.68±0.30，P<0.01)、以及PCK1的mRNA表達(dá)(1±0vs4.22±0.36，P<0.01)，降低了GCK的mRNA的表達(dá)(1±0vs0.28±0.07，P<0.01，圖1)。

與轉(zhuǎn)染miR-106b模擬物(mimic)的人L02肝細(xì)胞相反，轉(zhuǎn)染miR-106b抑制劑(antagomiR-106b)的人L02肝細(xì)胞顯著降低PEPCK蛋白(1±0vs0.23±0.09，P<0.01)、G6Pase蛋白(1±0vs0.34±0.08，P<0.01)和PCK1 mRNA(1±0vs0.38±0.11，P<0.01)的表達(dá)，增加GCK mRNA(1±0vs3.29±0.29，P< 0.01)的表達(dá)(圖2)。

通過檢查培養(yǎng)基中葡萄糖濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20 nmol/L的miR-106b模擬物作用24 h顯著增加培養(yǎng)基中葡萄糖濃度(43.25±2.36vs124.37 ±9.63 μmol/L,P<0.01)，而同樣時(shí)間和劑量miR-106b抑制劑處理的細(xì)胞，其培養(yǎng)基中葡萄糖含量與對照組比較明顯降低(42.87±3.21vs30.34 ±2.75 μmol/L,P<0.01)。

Fig. 1 The effects of miR-106b mimic transfection on hepatic n=4)

Fig. 2 The effects of antagomiR-106b transfection on hepatic n=4)

2.2 MiR-106b對肝細(xì)胞STAT3蛋白表達(dá)的影響

為觀察miR-106b對參與調(diào)節(jié)肝細(xì)胞葡萄糖異生的信號(hào)系統(tǒng)的影響，L02細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-106b模擬物(mimic)或抑制劑(antagomiR)，Western blot檢測部分信號(hào)分子的蛋白表達(dá), RT-PCR檢測STAT3 mRNA的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-106b模擬物(mimic)顯著抑制STAT3蛋白的表達(dá)(1±0vs0.45±0.10，P<0.01)；而轉(zhuǎn)染miR-106b抑制劑(antagomiR)顯著提高STAT3蛋白的表達(dá)(1±0vs1.76±0.28，P<0.01)，但并不影響STAT3 mRNA的表達(dá)(分別1±0vs1.06±0.15，P> 0.05; 1±0vs1.05±0.24，P>0.05)。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-106b的表達(dá)水平對PI3K信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)蛋白如PDK1、Akt的蛋白表達(dá)無影響(圖3)。

2.3 STAT3對肝細(xì)胞葡萄糖異生的影響

為證實(shí)STAT3在miR-106b影響肝細(xì)胞葡萄糖異生中的介導(dǎo)作用，轉(zhuǎn)染miR-106b抑制劑(antagomiR-106b)的L02細(xì)胞接受100 μmol/L的STAT3特異性抑制劑NSC74859處理18 h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單純轉(zhuǎn)染antagomiR-106b抑制劑(antagomiR-106b)的L02細(xì)胞比較，NSC74859處理可顯著降低STAT3的磷酸化、提高PEPCK和G6Pase的蛋白表達(dá)、增加PCK1的 mRNA表達(dá)、降低GCK的mRNA表達(dá)(圖4，表1)。

Fig. 3 The effects of miR-106b on the protein and mRNA abundances of STAT3 in the L02 n=4)

3 討論

肝葡萄糖異生是肝臟葡萄糖代謝的主要組成部分，受一系列的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，其中葡萄糖異生限速酶葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCK)起到重要作用。G6Pase和PEPCK是決定葡萄糖異生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因而其蛋白、基因、或活性的變化通常用來反應(yīng)肝葡萄糖異生活動(dòng)的增強(qiáng)或降低。而糖激酶(GCK)是調(diào)節(jié)人體血液中葡萄糖水平的重要酶，主要作用是監(jiān)控血中的葡萄糖水平。臨床上，由于葡萄糖激酶過度激活或者失活，導(dǎo)致血液中葡萄糖水平過低或過高，繼而引發(fā)2型糖尿病和高血糖癥病變。本研究利用L02肝細(xì)胞模型，通過觀察G6Pase和PEPCK的蛋白表達(dá)，以及PCK1和GCK mRNA的表達(dá)，結(jié)合培養(yǎng)液中的葡萄糖含量，確定miR-106對肝細(xì)胞葡萄糖異生的影響。

本研究的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-106模擬物(mimic)可增加肝細(xì)胞葡萄糖異生限速酶G6Pase和PEPCK(圖1)、提高培養(yǎng)液中葡萄糖的含量，表明miR-106可增強(qiáng)葡萄糖異生。相反，miR-106抑制劑(antagomiR-106b)具有與miR-106模擬物相反的作用，表明抑制miR-106可抑制肝細(xì)胞葡萄糖異生活動(dòng)(圖2)。此外，miR-106對葡萄糖異生的調(diào)節(jié)作用伴隨有STAT3蛋白表達(dá)的降低或升高(圖3)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制STAT3活性可逆轉(zhuǎn)miR-106b抑制劑(antagomiR-106b)對肝細(xì)胞葡萄糖異生的影響(圖4)。這些結(jié)果表明，miR-106b通過抑制STAT3蛋白表達(dá)而促進(jìn)肝細(xì)胞葡萄糖異生。

Fig. 4 Inhibition of STAT3 signaling abolished the inhibitory effects of antagomiR-106 on hepatic n=4)

Tab. 1 Inhibition of STAT3 signaling abolished the inhibitory effects of antagomiR-106 on hepatic n=4)

STAT3屬轉(zhuǎn)錄因子的一員，參與對多種細(xì)胞細(xì)胞活動(dòng)的調(diào)節(jié)。例如，激活的JAK2/STAT3信號(hào)通路具有抗心肌細(xì)胞凋亡的作用，也可影響急性胰腺炎的炎癥反應(yīng)[12-13]。在本研究中，STAT3通過與葡萄糖異生基因PEPCK和G6Pase調(diào)節(jié)區(qū)的相互作用，抑制這2個(gè)葡萄糖異生關(guān)鍵基因的表達(dá)，從而影響肝細(xì)胞葡萄糖異生活動(dòng)，具體表現(xiàn)為激活的STAT3可抑制肝細(xì)胞葡萄糖異生[14-15]。既往研究也表明，STAT3的活性可受到其他因素的影響，如SirT1介導(dǎo)的STAT3關(guān)鍵賴氨酸位點(diǎn)的脫乙?；上齋TAT3對肝細(xì)胞葡萄糖異生的抑制作用[16]。早期的研究已證實(shí)，STAT3的mRNA是miR-106b的直接靶標(biāo)，miR-106b通過與STAT3 mRNA的3’UTR結(jié)合，從而降低細(xì)胞內(nèi)STAT3的蛋白表達(dá)，包括內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞內(nèi)的STAT3蛋白表達(dá)[17-19]。與這些研究結(jié)果相一致，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，miR-106b抑制劑可增強(qiáng)STAT3的表達(dá)，而其模擬物可降低STAT3的表達(dá)(圖3)，證實(shí)miR-106b對STAT3的負(fù)調(diào)節(jié)作用。既然STAT3可抑制肝細(xì)胞葡萄糖的異生[14-15]，我們認(rèn)為：miR-106b增加肝細(xì)胞葡萄糖異生的作用是通過抑制STAT3蛋白表達(dá)而完成的。

胰島素在調(diào)節(jié)肝葡萄糖輸出中的作用被廣泛接受，胰島素信號(hào)可通過直接或間接的方法控制肝細(xì)胞葡萄糖的異生[1]。其中，Akt起到至關(guān)重要的作用。磷酸化的Akt通過對FoxO1的調(diào)節(jié)控制葡萄糖異生基因的表達(dá)[1]。在本研究中，miR-106b模擬物(mimic)和抑制劑(antagomiR-106b)對細(xì)胞胰島素信號(hào)分子PDK1和Akt的蛋白表達(dá)均不產(chǎn)生影響(圖3)，表明miR-106b促進(jìn)肝細(xì)胞葡萄糖異生的作用不依賴Akt的蛋白表達(dá)。而在腫瘤研究中，miR-106b可通過對PTEN的調(diào)節(jié)影響PI3K/Akt信號(hào)通路[20]。因此，miR-106b對胰島素信號(hào)，尤其是對Akt和FoxO1的磷酸化的影響有待進(jìn)一步的深入研究。有趣的是，研究表明STAT3是Akt信號(hào)的上游，激活的STAT3可增加Akt的磷酸化和活性[21]。因此有理由相信，miR-106b可能通過對STAT3蛋白表達(dá)的調(diào)控而影響Akt/FoxO1信號(hào)，從而調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的葡萄糖異生活動(dòng)。當(dāng)然，這一假說需要更多的實(shí)驗(yàn)研究加以證實(shí)。

綜上，本研究的結(jié)果表明miR-106b通過抑制STAT3的蛋白表達(dá)而增加肝葡萄糖異生作用。由于肝葡萄糖異生的增加在血糖升高中具有重要作用，因此本研究也為了解糖尿病患者血糖升高的分子機(jī)制提供了新的理論解釋，同時(shí)為糖尿病的治療提供了新靶點(diǎn)。