趙家榮， 馮雪松， 李 宏， 王國(guó)全， 張艷芳， 史海龍， 李媛媛， 晁 旭,△

((1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 咸陽(yáng) 712046； 2. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院， 咸陽(yáng) 712000； 3. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 咸陽(yáng) 712000)

肝癌是世界上第六大最常見的癌癥，也是導(dǎo)致癌癥死亡的第四大原因，截止到2018年，全球每年新增病例約84.1萬(wàn)，死亡782 000人[1]。研究表明，中醫(yī)藥可通過抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡和分化，抑制腫瘤血管生成，抗肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞耐藥性，調(diào)節(jié)和提高機(jī)體免疫功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等環(huán)節(jié)達(dá)到治療肝癌的目的[2]。

四逆散是治療肝病的經(jīng)典代表方，首見于張仲景的《傷寒論》，被后世贊譽(yù)為疏肝之祖方。該方由柴胡、芍藥、枳實(shí)、炙甘草四味中藥組成，主要用于治療肝氣郁結(jié)，陽(yáng)氣內(nèi)郁，不能透達(dá)四肢的熱厥證[3]。四逆散在臨床上廣泛用于治療肝纖維化[4]、肝損傷[5]、肝硬化[6]、酒精性脂肪肝[7]和肝炎等[8]。

研究表明，四逆散在原發(fā)性肝癌的治療中也發(fā)揮重要作用[9-10]，對(duì)延長(zhǎng)原發(fā)性肝癌患者生存期、中位生存時(shí)間及控制瘤體有一定效果，可改善患者的癥狀，提高患者生存質(zhì)量，改善肝功能[11]。但是，有關(guān)四逆散對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。

本研究以體外培養(yǎng)的人肝癌HepG2細(xì)胞為材料，研究含四逆散藥液血清對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響及分子機(jī)制，以期為臨床上用四逆散治療原發(fā)性肝癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞系

SPF級(jí)雄性SD大鼠購(gòu)買于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證編號(hào)：61001700002052)。人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物與試劑

柴胡，白芍，枳實(shí)，炙甘草購(gòu)買于陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房。五氟尿嘧啶(5-FU)由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司出品。RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco生物技術(shù)公司。小牛血清購(gòu)自四季青生物技術(shù)有限公司。MTT試劑盒、hochest33258染色試劑盒、Rho123染色液購(gòu)自北京solarbio生物科技有限公司。二甲基亞砜(DMSO)，四甲基偶氮唑鹽(MTT)，胰蛋白酶等試劑購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

1.3 含四逆散藥液血清的制備

四逆散藥液制備：取柴胡(6 g)、白芍(6 g)、枳實(shí)(6 g)、炙甘草(6 g)藥材加水10倍浸泡3 h，煎煮2次(第1次8倍量，第2次6倍量)，每次1 h，過濾分離藥渣，保留藥液。合并濾液，混勻，煎煮濃縮藥液至600 ml，直至藥液含生藥終濃度為0.4 g /ml。

選擇SPF級(jí)SD雄性大鼠(180～220 g)6只，分為空白血清組，四逆散0.4 g/ml組，每組3只?？瞻籽褰M給予蒸餾水灌胃，四逆散給予四逆散藥液灌胃，連續(xù)灌胃3 d，每次2 ml，2次/日。末次給藥后2 h,麻醉動(dòng)物后，心臟取血。然后將血液常溫靜置2 h后，2 500 r/min(離心后切勿晃動(dòng))離心25 min，取上清，得到高濃度含四逆散藥液血清。然后用空白血清將高濃度含四逆散藥液血清稀釋1倍，得到中濃度含四逆散藥液血清；再用空白血清將中濃度含四逆散藥液血清稀釋1倍，得到低濃度含四逆散藥液血清。

將所有的含四逆散藥液血清置于56℃水浴鍋中滅活30 min，用0.22 μm微孔濾器過濾除菌，然后儲(chǔ)存于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中(含100 U/L 青霉素和100 μg/ml鏈霉素)；在37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)和傳代。實(shí)驗(yàn)分為5組(n=3)：空白對(duì)照組(Control)、陽(yáng)性對(duì)照組(5-FU)、四逆散低劑量組(SNS-L)、四逆散中劑量組(SNS-M)和四逆散高劑量組(SNS-H)。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率

將HepG2細(xì)胞以1×104cells/ml的密度接種于96孔板，每孔180 μl，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞完全貼壁后，SNS-L、SNS-M和SNS-H組分別添加20 μl低、中、高濃度的含四逆散藥液血清，空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組分別加入20 μl空白血清和5-FU。繼續(xù)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μl MTT溶液，再培養(yǎng)4 h。然后小心地吸去培養(yǎng)液，再向每孔加入150 μl DMSO溶液，振蕩混勻10 min，用酶標(biāo)分析儀(雷杜RT-600)，在490 nm波長(zhǎng)條件下檢測(cè)各孔吸光值，并用以下公式計(jì)算抑制率：

抑制率(%)=(1- OD處理組/OD對(duì)照組)×100%

1.6 Hochest33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將各組HepG2細(xì)胞以2×106cells/ml的密度接種于6孔板，培養(yǎng)箱中過夜。藥物作用48 h后，小心地吸去培養(yǎng)液，再加入0.5 ml固定液；固定10 min后，小心地吸去固定液，用PBS洗2遍。向每孔加入0.5 ml hochest33258染色液，染色5 min；然后棄去染色液，用PBS洗兩遍；最后取1滴抗熒光淬滅封片液于載玻片，封片后用熒光顯微鏡拍照。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

將各組HepG2細(xì)胞以2×106cells/ml的密度接種于6孔板，培養(yǎng)箱中過夜，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。藥物作用48 h后，收集細(xì)胞，用PBS清洗兩次。然后400 μl細(xì)胞懸液中加入400 μl結(jié)合緩沖液和10 μl AnnexinV-FITC(20 μg/ml)，混勻，4℃避光孵育15 min后，在細(xì)胞懸液中加入5 μl碘化丙啶(PI)(20 μg/ml)，混勻，4℃避光孵育5 min，室溫放置10 min。采用流式細(xì)胞儀(BECKMAN COULTER)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.8 細(xì)胞周期檢測(cè)

將各組HepG2細(xì)胞以2×106cells/ml的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)箱中過夜。藥物作用48 h后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌2次后，加入預(yù)冷75%乙醇，于4℃固定4 h。然后1 500 r/min離心5 min，棄上清；再用預(yù)冷PBS洗滌1次，加入PI 400 μl和RNaseA 100 μl，4℃避光孵育30 min。經(jīng)50 μm尼龍網(wǎng)過濾后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2細(xì)胞周期。

1.9 線粒體膜電位檢測(cè)

將各組HepG2細(xì)胞以2×106cells/ml的密度接種于6孔板，培養(yǎng)箱中過夜。藥物作用48 h后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次后，加入400 μl羅丹明123染液(5 μg/ml)。在培養(yǎng)箱中孵育10 min后，用培養(yǎng)基洗滌兩次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體FSC、SSC(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 含四逆散藥液血清對(duì)HepG2細(xì)胞增殖和凋亡率的影響

含四逆散藥液血清處理人肝癌HepG2細(xì)胞48 h后，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)， MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖率。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，含四逆散藥液血清處理后的HepG2細(xì)胞數(shù)量顯著減少。細(xì)胞形態(tài)由邊緣清晰的梭形，變圓、皺縮，甚至破裂(圖1A)。MTT法檢測(cè)結(jié)果表明，藥物處理后各組細(xì)胞的抑制率顯著增大(P<0.01)，空白對(duì)照組、5-FU組、SNS-L組、SNS-M和SNS-H組細(xì)胞的平均抑制率分別為2.97%，28.72%，26.90%，31.87%和37.90%。

如圖1(B)所示，含四逆散藥液血清處理HepG2細(xì)胞后，空白血清組，5-FU對(duì)照組，含四逆散藥液血清低劑量組，中劑量組，高劑量組48 h的凋亡率隨著濃度的增加而升高，分別為15.7%、19.6%、 20.0%、40.3%、46.3%；四逆散低劑量組與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異，中劑量組和高劑量組與對(duì)照組比較有明顯差異(P<0.05)。

Fig. 1 Effect of SNS on cell morphology and apoptosis of hepatocellular carcinoma HepG2 cells(n= 3)

2.2 含四逆散藥液血清對(duì)細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響

如圖2所示，含四逆散藥液血清處理HepG2細(xì)胞后，四逆散組與對(duì)照組細(xì)胞核差異顯著?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞核形態(tài)完整，均勻分布，四逆散低、中和高劑量組細(xì)胞核皺縮，變圓，形成凋亡小體。

Fig. 2 Apoptosis of hepatocellular carcinoma cell detected through Hochest33258 stain

2.3 含四逆散藥液血清對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞周期和線粒體膜電位的影響

如圖3A所示，含四逆散藥液血清處理的HepG2細(xì)胞48 h后，空白血清組、5-FU組，四逆散低、中和高劑量組G1期細(xì)胞的百分比隨著濃度的增加而升高(P<0.05)，分別為67.5%、72.95%、71.97%、79.72%、81.75%；G2期細(xì)胞的百分比分別為5.66%、4.21%、4.50%、3.34%和1.43%。該結(jié)果表明含四逆散藥液血清處理的HepG2細(xì)胞被阻滯于G1期，從而抑制細(xì)胞增殖。

HepG2細(xì)胞經(jīng)處理48 h后，空白對(duì)照組、5-FU組、含四逆散藥液血清低、中和高劑量組的線粒體膜電位顯著降低(P<0.05)，分別為156.21%、 151.86%、140.52%、111.41%、107.57%，提示含四逆散藥液血清可能通過破壞線粒體膜電位，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡(圖3B)。

Fig. 3 Effects of SNS on cell cycle and mitochondrial membrane potential of hepatocellular carcinoma HepG2 cells(n= 3)

2.4 含四逆散藥液血清對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖4A所示，人肝癌HepG2細(xì)胞經(jīng)含四逆散藥液血清處理后，與空白對(duì)照組相比，5-FU組、含四逆散藥液血清中和高劑量組Bax的表達(dá)顯著升高(P<0.05)，bcl-2的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。經(jīng)含四逆散藥液血清處理后，5-FU組、含四逆散藥液血清中和高劑量組Caspase-3、Caspase-9和Cyt-c的蛋白表達(dá)均顯著增高(P<0.05)。

Fig. 4 Effects of SNS on the expression levels of proteins related to apoptosis of hepatocellular carcinoma HepG2 cell(n= 3)

3 討論

由于人肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)發(fā)病隱匿，大多數(shù)患者在確診時(shí)已處于晚期，發(fā)生了轉(zhuǎn)移, 只有三分之一的確診肝癌患者可以進(jìn)行手術(shù)切除、射頻消融、肝移植等治療[12]。目前，對(duì)于不能手術(shù)治療的晚期肝癌，其中全身化療是其治療的重要手段之一。但是大多數(shù)化療藥都選擇性差，毒副作用大而且容易產(chǎn)生耐藥性，因此，尋找高效、低毒、選擇性強(qiáng)的天然抗腫瘤藥物很有必要[13]。中醫(yī)藥是中國(guó)腫瘤治療中的一大特點(diǎn)，在腫瘤治療過程中發(fā)揮著重要意義[14]。

肝癌在我國(guó)古代文獻(xiàn)中可歸屬于“鼓脹”、“肥氣”、“黃疽”、“積聚”、“肝積”等病證的范疇；《醫(yī)宗必讀》有云:“積之成也，正氣不足，而后邪氣踞之?！敝嗅t(yī)對(duì)肝癌的認(rèn)識(shí)，目前多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為本病屬因虛致實(shí)，虛實(shí)夾雜，本為正氣不足，標(biāo)為邪毒內(nèi)發(fā)。正氣虧虛而致臟腑陰陽(yáng)失調(diào)、氣機(jī)不暢，痰濁、瘀血、毒邪相互搏結(jié)，久積于肝而發(fā)為肝癌。臨證上多以培正固本、清熱解毒、祛瘀活血、消痰散結(jié)等治則為主。四逆散是治療肝病的經(jīng)典代表方，其主治脅肋脹悶，脘腹疼痛的肝脾氣郁證?！秱摗け嫔訇?yáng)病脈證并治》中記載：“少陰病，四逆，其人或咳，或悸，或小便不利，或腹中痛，或泄利下重者，四逆散主之”。四逆散由柴胡，芍藥，枳實(shí)，炙甘草四味中藥組成，共奏透邪解郁，疏肝理脾之效，使邪祛郁解，氣血條暢，清陽(yáng)得升，四逆自愈。

本研究結(jié)果顯示，含四逆散藥液血清具有抑制HepG2細(xì)胞增殖的作用，且隨著劑量的增大而增強(qiáng)。人肝癌HepG2細(xì)胞經(jīng)含四逆散藥液血清處理后，細(xì)胞數(shù)量顯著減少，細(xì)胞核呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)。細(xì)胞周期結(jié)果顯示，經(jīng)含四逆散藥液血清處理后，G1期細(xì)胞數(shù)明顯增加，而G2期細(xì)胞數(shù)量減少。以上結(jié)果提示，含四逆散藥液血清可能是通過阻滯腫瘤細(xì)胞滯留于G1期，抑制肝癌細(xì)胞的增殖。

研究表明，線粒體通過向釋放細(xì)胞膜間隙活化半胱天冬酶而在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。細(xì)胞的線粒體凋亡是由于Bcl-2家族促凋亡基因Bax/Bak與抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL水平之間的平衡失調(diào)導(dǎo)致的[16]。Bcl-2/Bax失調(diào)引起線粒體內(nèi)Cyt-c釋放，進(jìn)而激活Caspase-9的表達(dá)，激活Caspase-3，最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡[17]。Caspase 家族是細(xì)胞凋亡過程中起著調(diào)節(jié)和執(zhí)行作用的重要樞紐，Caspase 的異常變化提示細(xì)胞凋亡水平的改變[18]。本研究結(jié)果顯示，含四逆散藥液血清處理HepG2細(xì)胞凋亡率顯著增加，線粒體膜電位顯著下降。Western blot結(jié)果表明，含四逆散藥液血清處理HepG2細(xì)胞后，Bax、Caspase-3、-9和Cyt-c的表達(dá)顯著升高，而Bcl-2的表達(dá)顯著降低。以上結(jié)果表明，四逆散可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果表明含四逆散藥液血清可以抑制人肝癌HepG2細(xì)胞增殖，并通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但是，其中通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑的成分尚需進(jìn)一步研究。