郭 飛， 向 茹， 王一民， 史銀斌， 曹衛(wèi)華， 池愛平， 曹 犇

((陜西師范大學體育學院， 陜西 西安 710119)

運動性疲勞產(chǎn)生的生理原因與能量消耗、代謝物堆積、自由基生成過多等有關[1]。合理的運動性疲勞能夠進一步提高機體的運動機能水平，而通過合適的訓練手段使機體達到合理的運動性疲勞狀態(tài)，也是科學訓練的目的之一。因此，對于運動性疲勞的科學檢測，具有重要的實際意義。目前人們多采用常規(guī)的生理指標(如心率與血壓等)、生化指標(如血尿素氮與血乳酸等)以及主觀自覺用力程度分級量表(rate of perceived exertion, RPE)等用于運動性疲勞的檢測[1]，而較少對機體內小分子代謝物的變化進行監(jiān)測。

足球運動項目對運動員的有氧運動能力和無氧運動能力均有較高要求，足球運動員的運動性疲勞產(chǎn)生必然與其機體的有氧代謝和無氧代謝水平有關。對于少年足球運動員而言，由于其機體處于生長發(fā)育階段，具有能源物質代謝快、機體易疲勞等特點，因而其在運動性疲勞后代謝物的變化必然具有一定的特異性。代謝組學是檢測機體小分子代謝物變化的一種常用方法，已有研究將其應用在運動人體科學研究領域[2]。因此，為了探索少年足球運動員在運動性疲勞后差異代謝物的變化特征，本研究模擬足球運動的能量代謝特點，建立少年足球運動員有氧運動和無氧運動相結合的運動模型，采用氣相-質譜法(gas chromatograph-mass spectrometer, GC-MS)，對其運動性疲勞后的尿液差異代謝進行檢測與篩選，為少年足球運動員的科學訓練提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

研究對象來自陜西省少年體校12名男性足球運動員，年齡14～16歲。研究對象均滿足本實驗的入選標準：① 身體健康，無任何疾??；② 參加專業(yè)訓練年限3～4年，均達到我省足球預備隊選拔要求；③ 運動前，通過RPE量表確定沒有任何身體疲勞積累；④ 均無抽煙與飲酒習慣。在獲得本人、學校和監(jiān)護人的同意后，進入本實驗流程。本實驗方案與實驗過程獲得陜西師范大學學術與倫理道德委員會的許可與監(jiān)督。

1.2 運動模型的建立與評定標準

在參考相關文獻[3]的基礎上，建立一個有氧運動+無氧運動的功率自行車復合運動訓練模型，其中，有氧運動采用奧斯特蘭德(Astrand-ryhmin)運動模式[4]，即：運動員完成6 min踏騎運動(負荷：150 W，轉速：60～65 r/min)；無氧運動采用溫蓋特(Wingate)無氧運動模式[5]，即：運動員完成30 s最大速度踏騎運動，負荷按照測試者體重設定；每組運動包含1次有氧運動和1次無氧運動，中間間隙休息時間為1 min；重復運動組數(shù)為3組，組間休息時間為3 min；運動方案見圖1所示。

運動員在進行30 min的熱身活動后開始上述重復的復合運動，同時佩戴polar表(RS800sd，芬蘭)記錄運動員不同時間點的心率；此外，記錄運動員每組運動后的最大攝氧量(VO2 max)、平均無氧功率和RPE值。運動性疲勞的判定標準：運動后RPE量表達到 17～19級[6,7]，并且測定運動當日晨、運動后3 h和次日晨的尿蛋白，確定測試者尿蛋白當日晨顯陰性、運動后3 h顯陽性且次日晨顯陰性[1]，確保運動員運動性疲勞的造模成功。

Fig. 1 Exercise protocol of teenage football players

1.3 尿樣采集

為了避免飲食與體力活動等對代謝組學檢測造成干擾，在實驗前1 d開始，12名研究對象統(tǒng)一飲食、進行日?；顒雍头谴髲姸冗\動。分別于準備活動前30 min和整個模型運動結束后3 h采集運動員的中段尿液1 ml，加入質量體積為0.5/1000(w/v)的疊氮鈉防腐，之后置于-80℃保存待測。

1.4 GC-MS法檢測

取100 μl尿液樣本，每管加入L-2-氯苯丙氨酸20 μl(內標)，離心10 min(10 000 r/min)取上，干燥后加入80 μl甲氧胺鹽80℃孵育30 min；再加入100 μl的N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺 70℃孵育120 min后冷卻至室溫，再加入10 μl飽和脂肪酸甲酯標準混合液，混勻后上機檢測。檢測儀器為Agilent 7890氣相色譜-質譜聯(lián)用儀；測試條件：進樣量1 μl，采用不分流模式；柱溫50℃保持1 min，以10℃/min的速率增加到300℃，維持7 min；離子源溫度220℃，掃描方式50～500 m/z。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 運動員在運動中的VO2 max和平均無氧功率的比較

少年足球運動員在3組運動中的VO2 max和平均無氧功率測試結果見表 1。

Tab. 1 Results of VO2 max and average anaerobic power after exercise n=12)

表 1 結果顯示，測試對象在3組的運動中VO2 max值維持在一個恒定的水平，變化不明顯；運動員在第1組和第2組運動的平均無氧功率值之間變化不顯著，但是第3組運動后平均無氧功率值與第1組運動后相比較，呈顯著下降趨勢(P<0.05)。說明在本實驗的3組運動中，運動員的有氧運動能力變化不明顯，而其無氧運動能力有一定程度下降。

2.2 尿液差異代謝物篩選結果

2.2.1 尿液樣本采集與GC-MS檢測結果 通過對運動員進行3組運動末RPE量表的詢問，結果均為18～19級；且所有測試者尿蛋白在整個運動模型結束后顯陽性，次日晨11名測試者尿蛋白恢復至陰性，提示其運動性疲勞有較好的恢復；另外有1人次日晨尿蛋白依然顯示陽性，提示其運動性疲勞沒有很好的恢復，為了檢測數(shù)據(jù)的準確性，對該運動員運動后的尿液樣本不予GC-MS測試。樣本經(jīng)過處理后進行GC-MS的檢測，得到的總離子流色譜圖(total ion current, TIC)如圖2所示。

圖2是整個運動模型前后運動員尿液樣本的GC-MS總離子流質譜圖。運動前和運動后總計檢測出635個代謝物的質譜峰，從樣本代謝物的總離子流色譜圖結果來看，兩組代謝物的質譜峰群的差異性較明顯，其中運動前的代謝物的質譜峰群較為密集，說明運動員在參與該運動模型后，機體內物質與能量代謝系統(tǒng)產(chǎn)生了較大變化。

Fig. 2 Total ion chromatograms of GC-MS detection

2.2.2 代謝物質譜峰數(shù)據(jù)的PCA和OPLS-DA分析 對上面得到的635個代謝物的數(shù)據(jù)進行標準化處理和過濾，再使用SIMCA軟件對數(shù)據(jù)進行歸一化后，對數(shù)據(jù)進行PCA分析和OPLS-DA分析。PCA分析和OPLS-DA分析的結果如圖3所示。

Fig. 3 PCA and OPLS-DA analysis of urine metabolites

PCA得分圖是對原始數(shù)據(jù)樣品分布的一個總體呈現(xiàn)，從得分圖(圖3 A)可以看出，運動前的樣本PCA得分分布在Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ象限，運動后的樣本PCA得分分布在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ象限，二者在第Ⅰ象限有重疊部分，因此，為了完全分開這兩種情況下的差異代謝物信號，需進一步對數(shù)據(jù)進行OPLS-DA分析，過濾掉相關性不高的差異代謝物正交信號。OPLS-DA分析結果見圖3 B所示， 運動前的OPLS-DA得分分布在Ⅱ、Ⅲ象限，而運動后的OPLS-DA得分分布在Ⅰ、Ⅳ象限，說明在OPLS-DA分析篩選后，兩組差異代謝物的分離效果比較理想。

2.2.3 差異代謝物的篩選 將OPLS-DA分析后的代謝物數(shù)據(jù)信息輸入KEGG數(shù)據(jù)庫，根據(jù)代謝物的信息與KEGG數(shù)據(jù)庫中對應的代謝物信息進行比對，依據(jù)代謝物的相似度大于700、代謝物貢獻值VIP大于1和組間比較的t檢驗概率P值小于0.05作為差異代謝物的篩選標準，最終篩選到25個差異代謝物(表2)。

Tab. 2 Selected differential metabolites after exercise

被篩選的差異代謝物與氨基酸代謝有關。運動疲勞后，羥胺(hydroxylamine)、檸檬酸(citric acid)和山梨糖醇(sorbitol)這3個差異代謝物與運動前相比較，其信號強度呈現(xiàn)顯著性升高(P<0.05，P<0.01)，三者依次與氮代謝、三羧酸代謝、半乳糖代謝相關。其余22個差異代謝物的信號強度在運動后均不同程度顯著性下降。

2.2.4 差異代謝物的代謝通路歸屬 上述25個差異代謝物所涉及的代謝通路較多，需要將其輸入MetPA數(shù)據(jù)庫進行代謝通路權重得分比較，才能確定這些差異代謝物所影響的主要通路。上述差異代謝物的代謝通路歸屬結果見圖4。

圖4結果顯示，以差異代謝物在相應代謝通路中的權重影響力得分大于0.05作為其代謝通路歸屬的篩選標準，有5條代謝通路符合篩選標準，按照其權重影響力大小排序，依次是：甘氨酸-絲氨酸-蘇氨酸代謝(glycine, serine and threonine metabolism)、三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle)、酪氨酸代謝(tyrosine metabolism)、氮代謝(nitrogen metabolism)和甘油磷酯代謝(glycerophospholipid metabolism)，這幾條代謝通路歸屬于蛋白質代謝、三羧酸循環(huán)和脂代謝等通路。

Fig. 4 The impact score of the metabolic pathways

3 討論

從物質與能量代謝的角度，足球運動是一項典型的有氧與無氧代謝相結合的復合性運動項目。優(yōu)秀的足球運動員必須具備較好的有氧代謝能力和無氧代謝能力。本研究實驗對象選取的少年足球運動員是陜西省足球隊的預備隊員，對其運動能力與訓練監(jiān)控研究對于提高我省足球競技水平具有重要的意義。本研究通過功率自行車建立有氧運動和無氧運動結合的運動模型，模擬少年足球運動員在實戰(zhàn)中的運動強度，最終達到運動性疲勞。實驗結果顯示，在該運動模型下，運動員均達到運動性疲勞的狀態(tài)；在3組的運動訓練中，運動員的最大攝氧量均維持在恒定水平，但其平均無氧功率呈現(xiàn)下降趨勢。代謝組學是目前常用的生物檢測手段。同時，國內外很多研究將其應用在運動訓練中，包括有氧運動[10,11]、無氧運動[12,13]以及普通人群的體育鍛煉中[14]。從運動模型的角度來分析相關的代謝通路，一般高強度間歇訓練可檢測到生物能量代謝通路的變化，例如脂代謝、蛋白質代謝、三羧酸循環(huán)等。而中等強度的持續(xù)性訓練，則不會出現(xiàn)上述代謝通路的變化[15]，因此，運動強度可能是引起運動員機體代謝通路出現(xiàn)變化的關鍵因素。本研究設計的運動模型是有氧運動和無氧運動結合的模型，屬于大強度間隙訓練，訓練結束后運動員產(chǎn)生運動性疲勞。

本實驗結果證實，少年足球運動員運動后出現(xiàn)顯著變化的代謝與蛋白質代謝、三羧酸循環(huán)和脂代謝紊亂相關，這個結果與Shlomit等[16]的研究結果具有相似性。在大強度運動中，糖原是肌肉收縮的主要能源物質，隨著運動時間的延長，一定量的蛋白質分解代謝會發(fā)生，其釋放的能量來補充糖原供能的不足，隨著運動型疲勞的產(chǎn)生程度，蛋白質代謝的程度也相應增加。本研究結果顯示，在運動性疲勞后均明顯降低的標記物有：甘氨酸-絲氨酸-蘇氨酸代謝中的肌氨酸、L-別蘇氨酸、肌酸、絲氨酸；酪氨酸代謝中的琥珀酸和4-羥基苯乙酸；而氮代謝中的羥胺含量反而明顯增加，提示少年足球運動員發(fā)生運動型疲勞之后，其甘氨酸-絲氨酸-蘇氨酸、酪氨酸代謝通路可能出現(xiàn)紊亂情況，同時氮代謝通路紊亂顯示其存在“負氮平衡”的可能性。類似的研究也證明，舉重運動員疲勞后，其組氨酸和甘氨酸相對含量降低，而耐力運動員組氨酸和酪氨酸含量降低[17]；對于少年運動員有氧運動后代謝物變化的研究發(fā)現(xiàn)：甘氨酸-絲氨酸-蘇氨酸、支鏈氨基酸等多種氨基酸含量降低[16]。上述研究結果說明不同運動類型引起的差異代謝物也不同，而對于少年運動員來說，運動型疲勞導致的氨基酸代謝紊亂以及“負氮平衡”依然是主要特征。

三羧酸循環(huán)是運動時能源物質代謝的中間環(huán)節(jié)，而琥珀酸和檸檬酸是該代謝通路中關鍵的代謝物。有研究表明，耐力運動員運動性疲勞后琥珀酸含量顯著降低而檸檬酸含量顯著增加，而力量運動員未發(fā)現(xiàn)同樣的變化[17]。本實驗結果顯示，運動員運動后尿液差異代謝物中，琥珀酸顯著降低而檸檬酸顯著增加，說明有氧與無氧運動結合的復合運動模型導致的運動性疲勞與三羧酸循環(huán)紊亂有關。

眾所周知，脂肪酸通常是長時間的中、低強度運動的主要能量來源[18]。目前研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酸代謝系列中的甘油磷脂代謝，在劇烈運動后會受到明顯的影響[19]。由于甘油磷脂是細胞膜的主要成分，對細胞膜識別蛋白質以及生物信號傳導等功能發(fā)揮重要作用[20]。因此，推測劇烈運動引起的機體細胞傳導功能紊亂可能與該通路紊亂有關。同樣，本次實驗的結果證實少年足球運動員在運動型疲勞后，其尿液樣本代謝物中乙醇胺的含量顯著下降，該物質也是甘油磷酯代謝通路中關鍵代謝物，提示乙醇胺可作為該運動模型下甘油磷酯代謝的一個生物標記物。

綜上所述，本研究通過有氧與無氧運動結合的運動模型，篩選出少年足球運動員發(fā)生運動性疲勞后的差異代謝物，可能與機體的部分氨基酸代謝、甘油磷酯代謝以及三羧酸循環(huán)紊亂有關。上述代謝通路中發(fā)生顯著變化的差異代謝物為肌氨酸、L-別蘇氨酸、肌酸、絲氨酸、琥珀酸、檸檬酸、4-羥基苯乙酸、羥胺和乙醇胺，這些差異代謝物在后續(xù)的研究中，可通過靶標代謝組學的檢測方法進行定量化研究后，有望成為評估少年足球運動員運動性疲勞的生物標記物。