程小麗， 趙余珠， 王志旺△， 丁茂鵬， 韋凌霞， 潘 虹

((1.甘肅中醫(yī)藥大學, 蘭州 730000; 2. 甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院, 蘭州 730000)

肝纖維化是多種肝病過程中肝細胞外基質(zhì)異常增生、沉積的病理過程[1]。在肝“體陰而用陽”、“陽常有余而陰常不足”等中醫(yī)理論指導下，四川名中醫(yī)朱正平教授提出補肝腎之陰血、散氣血之瘀滯是治療肝纖維化的基礎治法，在上述中醫(yī)理論的指導下，擬定七味育肝復方并制成顆粒劑(七味育肝顆粒，QYG)，在臨床上取得了較好的療效[2]。基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)具有降解纖維膠原的活性，而基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)是MMP-13的特異性抑制劑，MMP-13/TIMP-1失衡在肝纖維化過程中發(fā)揮重要作用[3]。本研究采用復合因素復制肝纖維化大鼠模型，觀測QYG對肝纖維化的治療作用，同時，從基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)/基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)失衡的角度探討QYG抗肝纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

七味育肝顆粒(QYG)，由甘肅中醫(yī)藥大學藥理教研室提供，批號：20171028。秋水仙堿，西雙版納版納藥業(yè)責任有限公司，國藥準字H53021369，批號：20170904。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase, ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase, AST)試劑盒是南京建成生物工研究所生產(chǎn)，批號：20180702、20180604；透明質(zhì)酸(hyaluronic acid, HA)、Ⅲ型前膠原(Ⅲ procollagen, PCⅢ)、Ⅳ型膠原(Type IV collagen, C-Ⅳ)ELISA試劑盒是北京北方生物技術(shù)研究所生產(chǎn)，批號：180403、180502、180401；基質(zhì)金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13, MMP-13)；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1)試劑盒是北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：AD04205689、AH09264155。

1.2 儀器

高速冷凍離心機(TGL-16G型)，上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品；分光光度計(722型)，上海第三分析儀器廠產(chǎn)品；光學顯微鏡(CH-212型)，日本奧林巴斯株式會社產(chǎn)品；醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)(BI-2000型)，成都泰盟科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 動物

SPF級SD大鼠，♂♀各半，體質(zhì)量200～230 g，中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供并進行實驗，許可證號：SCXK(甘)2015-0001。

1.4 分組、造模并給藥

將SD大鼠隨機分為6組，即空白對照組(Control)、模型對照組(Model)、秋水仙堿組(Colchicine, 1.0×10-4g/kg)、QYG藥物干預組(QYG-H、QYG-M、QYG-L, 14.8、7.4、3.7 g/kg)，每組8只，雌雄各半。除空白對照組外根據(jù)預實驗及文獻復制肝纖維化模型[4]，采用皮下注射40%四氯化碳橄欖油(第1次5.0 ml/kg，后續(xù)每次3.0 ml/kg)，2次/周，連續(xù)6周；同時灌胃乙醇15 ml/kg(乙醇濃度第1周 5%、第2周10%、第3周15%、第4～6周20%)?？瞻讓φ战M按上述方法皮下注射橄欖油、灌胃純凈水。從造模開始各治療組按上述劑量灌胃給藥15 ml/kg，1次/d，連續(xù)6周，空白對照組與模型對照組大鼠灌胃等體積純凈水。

1.5 觀測指標

實驗第43日麻醉大鼠，股靜脈取血，分離血清測定肝功能(ALT、AST)。處死大鼠后取肝臟，于固定位置取肝組織2份，第1份肝組織經(jīng)勻漿、離心，取上清液嚴格按照試劑盒說明書測定纖維化相關(guān)指標(HA、PCⅢ、C-Ⅳ)；第2份肝組織經(jīng)多聚甲醛固定、切片，采用Masson染色和免疫組化染色，觀察肝組織纖維化病理變化，對MMP-13、TIMP-1表達水平進行半定量分析。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 QYG對肝纖維化大鼠肝功能的影響

模型對照組大鼠血清ALT、AST顯著升高，與空白對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.01，表1)。在QYG的干預下，ALT、AST明顯下降，與模型對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05, 0.01)；隨著劑量的增加，上述指標的下降更加明顯，但QYG藥物干預組之間的差異尚無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

Tab. 1 The effects of QYG on liver function in rats with hepatic fibrosis (U/L， n=8)

2.2 QYG對肝纖維化大鼠肝組織病理學的影響

空白對照組大鼠的肝臟表面光滑、色澤均勻，模型對照組大鼠的肝臟表面呈淺黃色或黃褐色顆粒狀，QYG各劑量組大鼠的肝臟出現(xiàn)不同程度的改善。肝組織Masson染色在光鏡下如圖1所示，空白對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞排列整齊有序，肝小葉內(nèi)纖維組織少見。模型對照組纖維組織充滿視野，肝臟膠原纖維組織增生明顯，纖維間隔增厚并連接成片，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞并形成大量假小葉，肝組織纖維化程度高。QYG各劑量組與模型對照組相比肝纖維化程度明顯減輕，尤其是QYG高劑量組的改善作用更加明顯，肝纖維組織沉積明顯減少，纖維間隔變薄，局部肝細胞連接成片，肝小葉結(jié)構(gòu)趨于完整。

Fig. 1 The effects of QYG on histopathology of liver in rats with hepatic fibrosis (Masson staining ×10)

2.3 QYG對大鼠肝纖維化相關(guān)指標的影響

模型對照組大鼠肝組織中HA、PCⅢ、C-Ⅳ顯著升高，與空白對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.01，表2)。在QYG的干預下，HA、PCⅢ、C-Ⅳ明顯下降，與模型對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05, 0.01)，但QYG藥物干預組之間對上述指標的影響尚無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4 QYG對肝纖維化大鼠肝組織MMP-13、TIMP-1表達的影響

如圖2、圖3所示，MMP-13、TIMP-1免疫組化染色后在鏡下以棕褐色為陽性表達，主要分布于肝細胞的胞質(zhì)與胞漿中。模型對照組MMP-13、TIMP-1表達顯著增加，MMP-13/TIMP-1顯著降低，與空白對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05, 0.01，表3)。在QYG的干預下，MMP-13、MMP-13/TIMP-1明顯增加，而TIMP-1表達明顯降低，與模型對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與QYG中劑量組比較，QYG高、低劑量組TIMP-1降低、MMP-13/TIMP-1增加的幅度更大(P<0.01)。

Fig. 2 The effects of QYG on the expression of MMP-13 in rats with hepatic fibrosis (×40)

Fig. 3 The effects of QYG on the expression of TIMP-1 in rats with hepatic fibrosis (×40)

Tab. 2 The effects of QYG on fibrotic indexes of hepatic tissue in rats (μg/L, n=8)

Tab. 3 The effects of QYG on MMP-13 and TIMP-1 of liver in rats with hepatic fibrosis n=8)

3 討論

肝纖維化(hepatic fibrosis)是肝組織對炎癥損傷的修復反應，是多種慢性肝病的重要病理特征和發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)階段。肝纖維化是可逆的，但發(fā)展為肝硬化就很難逆轉(zhuǎn)，故抗肝纖維化治療是防治慢性肝病發(fā)展至肝硬化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5,6]，因此肝臟病理學家Hans Popper說“誰能阻止或延緩肝纖維的發(fā)生，誰就將治愈大多數(shù)慢性肝病”。中醫(yī)理論認為肝“體陰”但“陰常不足”，肝病過程中病邪消耗肝之陰血，致使肝陰不足而相火妄動，進一步耗損陰血，故肝陰不足成為肝纖維化的基礎病機；然淤血聚于肝經(jīng)，血瘀之癥成為臨床常見癥狀，故陰虛血瘀是肝纖維化的主要矛盾[7]。在育陰化瘀、消癥軟肝治則指導下擬定七味育肝復方并制成顆粒劑(QYG)，臨床上對慢性肝炎、肝纖維化以及早期肝硬化有明顯的療效[2,8]。本次研究在飼以高脂飼料的基礎上，利用四氯化碳與乙醇的肝毒性來復制肝纖維化動物模型，結(jié)果顯示，QYG可明顯降低血清ALT、AST，改善肝功能；在病理學研究中發(fā)現(xiàn)QYG可緩解肝組織病理學變化，抑制纖維組織異常沉積，肝纖維化相關(guān)指標肝組織中透明質(zhì)酸、Ⅲ型前膠原及Ⅳ型膠原的水平亦相應的減低，其中QYG高劑量組的結(jié)果與陽性藥物秋水仙堿的作用相似。上述結(jié)果為QYG臨床治療肝纖維化提高了實驗依據(jù)。

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)是降解細胞外基質(zhì)的水解酶，包括間質(zhì)膠原酶、明膠酶以及基質(zhì)分解素等，而MMP-13是目前已發(fā)現(xiàn)的唯一能降解纖維類膠原的酶類，在抗肝纖維化中有著重要意義[9]?；|(zhì)金屬蛋白酶抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMPs)是MMPs的特異性抑制劑，而TIMP-1為MMP-13的抑制物，主要來源于肝星狀細胞，通過抑制I型、III型膠原的降解而促進肝纖維化[3]。因此，MMP-13活性不足和/或TIMP-1異常激活導致MMP-13/TIMP-1失衡在肝纖維化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[10]。本次研究結(jié)果顯示，在QYG的干預下，MMP-13的活性升高、TIMP-1的活性降低，且QYG對TIMP-1、MMP-13/TIMP-1的影響有一定量效關(guān)系的趨勢，提示改善MMP-13/TIMP-1的失衡狀態(tài)是QYG抗肝纖維化的作用機制之一。