韋 穎，王 建，任思陳，楊玉雪,2，王 丹,2，文建霞,2，謝 倩，魏士長,2，趙艷玲

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137； 2.中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心藥學(xué)部，北京 100039)

胃癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一，西醫(yī)治療以外科手術(shù)為主，結(jié)合輔助放化療等綜合措施，但存在明顯不良反應(yīng)[1]。胃癌在中醫(yī)學(xué)中可歸屬于“反胃”“積聚”“伏梁”及“胃脘痛”等范疇，具有不同證型[2]。文獻(xiàn)報(bào)道，胃癌的證型多為肝胃不和證[3]。辨證分型論治是現(xiàn)代中醫(yī)治療胃癌的有效手段[4]。中醫(yī)藥治療協(xié)同化療能夠提高患者的生活質(zhì)量，抗腫瘤作用顯著[5]。吳茱萸始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有溫中止痛、止嘔和止泄的功效，適用于胃脘痛、嘔吐吞酸等，古代醫(yī)家常用吳茱萸配伍不同中藥治療胃腸道疾病[6-8]。現(xiàn)代研究結(jié)果顯示，吳茱萸具有抗腫瘤、降血脂、抗炎鎮(zhèn)痛和抑制潰瘍等藥理作用。鑒于胃癌的中醫(yī)范疇及證型，結(jié)合吳茱萸的古今應(yīng)用及相關(guān)抗胃癌報(bào)道[9-10]，本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討吳茱萸抗胃癌潛在的有效成分和作用機(jī)制，進(jìn)一步分析其在治療胃癌方面是否具有合理性及針對性，以期為后續(xù)研究及臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 吳茱萸藥物靶點(diǎn)篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php/)，獲得吳茱萸所含的活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)；再通過中草藥活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(herbal ingredients’ targets database，HIT)(http://lifecenter.sgst.cn /hit/)和治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database，TTD)(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)進(jìn)行靶點(diǎn)篩選，建立吳茱萸藥物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集[11]。

1.2 胃癌疾病靶點(diǎn)篩選

通過人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man，OMIM)(http://www.omim.org/)篩選胃癌相關(guān)基因和蛋白靶點(diǎn)，建立胃癌靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集，其中靶點(diǎn)連接蛋白通過交互蛋白數(shù)據(jù)庫(database of interacting protein，DIP)(http://dip.Doe-mbi.Ucla.edu)獲得[12]。為便于分析，均將上述所有靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化為UniProt數(shù)據(jù)庫識別碼格式。

1.3 “成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

為進(jìn)一步探索中藥吳茱萸的活性成分與胃癌靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系，將搜集到的上述吳茱萸化合物成分、藥物作用靶點(diǎn)和疾病作用靶點(diǎn)通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(protein-protein interaction，PPI)進(jìn)行分析，將分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行可視化分析，對各靶點(diǎn)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行分析。

1.4 基因本體(gene ontology，GO)富集分析

為說明中藥化合物的靶點(diǎn)蛋白在基因功能中的作用，利用Cytoscape 2.8.3軟件對蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，分別從功能、參與的生物途徑及細(xì)胞中的定位對基因產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化描述，并繪制GO分析條目圖。

1.5 京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路注釋分析

將“1.3”項(xiàng)下所得的直接作用靶點(diǎn)的UniProt數(shù)據(jù)庫識別碼導(dǎo)入功能注釋工具DAVID中進(jìn)行KEGG通路注釋分析，得出交互網(wǎng)絡(luò)中的直接作用靶點(diǎn)相關(guān)通路。

2 結(jié)果

2.1 吳茱萸和胃癌的靶點(diǎn)篩選

基于數(shù)據(jù)庫構(gòu)建方法，本研究共篩選出31個吳茱萸化學(xué)成分和407個直接作用靶點(diǎn)，7個胃癌直接作用靶點(diǎn)和67個交互蛋白靶點(diǎn)，以上藥物靶點(diǎn)被用來進(jìn)一步構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。

2.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和通路分析

為全面客觀地揭示吳茱萸抗胃癌的可能有效成分及潛在的作用靶點(diǎn)，對上述數(shù)據(jù)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行可視化分析，將吳茱萸抗胃癌的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)呈現(xiàn)出來，并對各靶點(diǎn)的相關(guān)參數(shù)進(jìn)一步分析，見圖1—2；圖1中，三角形代表吳茱萸中可能的有效活性成分，圓形代表藥物與疾病的作用靶點(diǎn)，方形代表藥物和疾病共同直接作用的靶點(diǎn)。經(jīng)分析，共篩出3個吳茱萸治療胃癌潛在的主要活性成分和6個直接作用靶點(diǎn)，見表1—2。表2中所列的直接作用靶點(diǎn)包括細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2 A、腫瘤抑制因子ARF、干擾素調(diào)節(jié)因子1、細(xì)胞腫瘤抗原p53、酪氨酸激酶受體2和白細(xì)胞介素1β，故認(rèn)為上述6個蛋白是吳茱萸抗胃癌的重要潛在蛋白靶點(diǎn)。

圖1 吳茱萸治療胃癌的“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)Fig 1 “Ingredients-Target-Disease” interactive network of Wuzhuyu in the treatment of gastric cancer

圖2 吳茱萸治療胃癌的“成分-靶點(diǎn)-疾病”直接作用交互網(wǎng)絡(luò)Fig 2 “Ingredients-Target-Disease” interactive network of direct targets of Wuzhuyu in the treatment of gastric cancer

表1 吳茱萸治療胃癌潛在化學(xué)成分Tab 1 Potential chemical ingredients of Wuzhuyu in the treatment of gastric cancer

表2 吳茱萸治療胃癌的“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)中直接作用靶點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)分析Tab 2 Topological parameter analysis of “Ingredients-Target-Disease” interactive network of direct targets of Wuzhuyu in the treatment of gastric cancer

2.3 GO分析

對相關(guān)蛋白靶點(diǎn)在基因功能中的作用進(jìn)行研究，共得到GO分析條目23個，見圖3。根據(jù)吳茱萸抗胃癌作用預(yù)測靶點(diǎn)的GO分析結(jié)果，對生物過程進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并按照相關(guān)度排列，發(fā)現(xiàn)吳茱萸主要通過調(diào)控4種生物過程進(jìn)而發(fā)揮對胃癌的治療作用，可知相關(guān)蛋白涉及的基因功能包括“regulation of execution phase of apoptosis”(調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段)、“negative regulation of T cell differentiation”(T細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)節(jié))、“regulation of protein export from nucleus”(細(xì)胞核蛋白輸出的調(diào)節(jié))和“regulation of cell cycle arrest”(細(xì)胞周期停滯的調(diào)節(jié))等方面，見圖4。

圖3 吳茱萸抗胃癌作用的GO分析Fig 3 GO analysis of Wuzhuyu in the treatment of gastric cancer

圖4 吳茱萸生物調(diào)節(jié)相關(guān)度分析Fig 4 Correlation analysis of biological regulation of Wuzhuyu

2.4 KEGG通路注釋分析

基于上述分析結(jié)果，篩選出13個直接作用靶點(diǎn)作為本次KEGG通路注釋分析的參與靶點(diǎn)。將符合篩選條件的直接作用靶點(diǎn)呈遞到DAVID數(shù)據(jù)庫(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)進(jìn)行KEGG通路注釋分析。結(jié)果顯示，共篩選出8條信號通路，分別為 “MicroRNAs in cancer”(惡性腫瘤中的微小RNA)、“Cell cycle”(細(xì)胞周期)、“p53 signaling pathway”(p53信號通路)、“Pathways in cancer”(惡性腫瘤通路)、“Viral carcinogenesis”(病毒致癌作用)、“Thyroid hormone signaling pathway”(甲狀腺激素信號通路)和“Proteoglycans in cancer”(惡性腫瘤中的蛋白多糖)，見圖5。

圖5 吳茱萸治療胃癌直接作用靶點(diǎn)的KEGG通路分析Fig 5 KEGG pathway analysis of direct targets of Wuzhuyu in the treatment of gastric cancer

3 討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步探索了吳茱萸治療胃癌的可能有效成分及潛在作用機(jī)制。結(jié)果顯示，篩出3個吳茱萸治療胃癌潛在的主要活性成分，分別為“gossypetin”(棉黃素)、“Gravacridoneshlirine”和“quercetin”(槲皮素)。其中，棉黃素已被證實(shí)具有抗突變、抗氧化、抗菌和抗動脈粥樣硬化作用，還可通過其自由基清除活性改善輻射誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和DNA損傷，并可調(diào)控凋亡和自噬發(fā)揮抗惡性腫瘤活性[13-14]；Gravacridone-shlirine相關(guān)研究資料較少，在劉鑫馗等[15]對吳茱萸湯作用機(jī)制分析的研究中，其作為吳茱萸湯中活性成分存在，該成分更待進(jìn)一步研究；大量研究結(jié)果表明，槲皮素可通過多種途徑對多種腫瘤具有抗腫瘤特性[16]。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，許多研究結(jié)果證實(shí)了吳茱萸其他成分也具有抗惡性腫瘤活性，甚至表現(xiàn)出抗胃癌的作用，如吳茱萸堿、吳茱萸次堿等[9-10]。分析結(jié)果提示，仍需繼續(xù)研究吳茱萸的有效成分及作用靶點(diǎn)，吳茱萸確實(shí)具有一定的抗胃癌潛力，可能其抗胃癌作用并不僅作用于疾病的直接靶點(diǎn)。

通過直接靶點(diǎn)和相關(guān)交互蛋白分析可見，“MicroRNAs in cancer”(惡性腫瘤中的微小RNA)、“Cell cycle”(細(xì)胞周期)、“p53 signaling pathway”(p53信號通路)、“Pathways in cancer”(惡性腫瘤通路)、“Viral carcinogenesis”(病毒致癌作用)、“Thyroid hormone signaling pathway”(甲狀腺激素信號通路)和“Proteoglycans in cancer”(惡性腫瘤中的蛋白多糖)可作為吳茱萸抗癌潛在的信號通路。其中，惡性腫瘤中的微小RNA在胃癌中的研究較廣，而吳茱萸調(diào)控微小RNA未見報(bào)道，有待進(jìn)一步研究剖析。

總之，本研究基于吳茱萸古方配伍應(yīng)用及現(xiàn)代藥理研究，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，預(yù)測出吳茱萸治療胃癌的3個可能的活性成分及6個潛在的作用靶點(diǎn)，初步揭示了吳茱萸治療胃癌可能的作用網(wǎng)絡(luò)，為吳茱萸治療胃癌的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用提供了參考。