尚蓉霞余欣石鴻宇吳漢武立權(quán)*李娟

（1安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，合肥230036；2安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥230036；3安徽省淠史杭灌區(qū)灌溉試驗(yàn)總站，安徽六安 237158；4安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心，合肥 230036；第一作者：18235445708＠163.cm；*通訊作者：Wlq-001＠163.com；lj_welcome_ok＠126.com）

植物內(nèi)源激素是指由植物自身合成的一類生物活性物質(zhì)。它們只以微小計量（含量一般為組織鮮質(zhì)量的10-9～10-7數(shù)量級）即可對植物的生長發(fā)育、細(xì)胞分化、開花結(jié)果、抗逆性以及器官衰老過程進(jìn)行調(diào)控[1-2]。在正常環(huán)境條件下，植物在各種激素相對平衡的調(diào)節(jié)下進(jìn)行正常的生長發(fā)育和新陳代謝；但當(dāng)遭遇逆境時，激素間的平衡遭到破壞，就會使植物的生長發(fā)育紊亂、新陳代謝失調(diào)[3]。

由于植物內(nèi)源激素含量極低，性質(zhì)不穩(wěn)定、易分解，且前處理過程不能完全消除植物組織中復(fù)雜的基質(zhì)干擾，因此獲得一種靈敏度高、專一性強(qiáng)、操作簡便、耗時短的檢測方法一直是國內(nèi)外諸多學(xué)者研究的熱點(diǎn)[4]。傳統(tǒng)的檢測方法有生物檢測法、免疫檢測法和基于光譜或色譜的理化分析法。生物鑒定法最早用于檢測植物激素，它利用當(dāng)激素作用于植物組織與器官時會產(chǎn)生特異性反應(yīng)這一原理實(shí)現(xiàn)對植物激素的測定。生物鑒定法雖然方法簡便，但對樣品純度要求較高，需要復(fù)雜的樣品前處理作為支撐，同時由于其專一性、重復(fù)性較差，這類方法的應(yīng)用逐漸減少[5]。免疫檢測法中以酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）最為常用，ELISA法需購買不同的試劑盒，這就使得被測組分和同一激素不同組分的定量分析被限制，且各組分之間存在交叉反應(yīng)，降低了其靈敏度和選擇性，從而影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性[6]。最早的光譜法是用比色法測定IAA，但是靈敏度和專一性較低，目前基本不再使用該方法。后來開發(fā)了紅外吸收光譜法、紫外吸收光譜法及熒光法等，雖然檢測的靈敏度得以提升，但其專一性較差，因而往往應(yīng)用于對激素分子的結(jié)構(gòu)鑒定及定性分析，定量分析較少采用該類方法[7]?，F(xiàn)代分析植物激素最常見的色譜技術(shù)主要包括液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）、氣相色譜法（GC）和高效液相色譜法（HPLC）。LC-MC費(fèi)用頗高；GC法靈敏度高，但不同類激素要求不同的前處理和衍生化方法，難以同時測定多個激素，進(jìn)而增加了材料的用量[8]；HPLC是一種高效分離純化技術(shù)，具有靈敏度、分辨率都高，專一性強(qiáng)和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于植物激素測定（除乙烯外）[9-11]。

水稻是我國的主要糧食作物。在水稻生產(chǎn)過程中，其產(chǎn)量和品質(zhì)常常會遭受高（低）溫、干旱、鹽漬等非生物逆境的影響[12-13]。了解水稻內(nèi)源激素在應(yīng)對不同逆境脅迫中的調(diào)節(jié)規(guī)律，可為其抗逆栽培提供重要的生產(chǎn)實(shí)踐價值。但測定水稻中5種內(nèi)源激素方法的研究很少。因此，筆者建立HPLC法來檢測水稻中的5種內(nèi)源激素。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與試劑

Waters600高效液相色譜系統(tǒng)（美國Waters公司）；超純水制備系統(tǒng)（美國Millipore公司）；JW-3021HR高速冷凍離心機(jī)（嘉文）；ZHWY-200B恒溫培養(yǎng)振蕩器；Centrifuge 5417R超速冷凍離心機(jī)（eppendorf）；MGC-300H人工氣候箱。ProElut SPE C18200 mg/3 mL。C185 um×4.6×250 nm。

玉米素（Z）（純度＞98%，aladdin）、3-吲哚乙酸（IAA）、水楊酸（SA）（純度＞99%，aladdin）、赤霉素（GA）和反式脫落酸（ABA）（純度分別≥96%和＞98%，MACKLIN）、甲醇和乙酸（色譜純，美國TEDIA公司）、石油醚（分析純），其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水（18.2 MΩ·cm）。所有試劑在使用前均用 0.22 μm 有機(jī)膜過濾。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精確稱取Z、GA、IAA、ABA和SA標(biāo)準(zhǔn)品分別為0.2 mg、2 mg、0.2 mg、0.1 mg 和 0.4 mg 于 2 mL 的容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度，配制濃度分別為0.1 mg/mL Z、1 mg/mL GA、0.1 mg/mL IAA、0.05 mg/mL ABA和0.2 mg/mL SA的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。用甲醇將儲備液依次稀釋2倍，連續(xù)進(jìn)行4次，配成5份濃度依次相差2倍的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以實(shí)際注入標(biāo)準(zhǔn)物的量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)作圖。

1.3 樣品前處理

試驗(yàn)于2017年5月26日在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科技樓人工氣候室進(jìn)行，以秈稻品種Nagina 22（Oryza sativaaus）為試驗(yàn)材料。選種、消毒、浸種和催芽，選取發(fā)芽均勻一致的籽粒種于帶網(wǎng)格的塑料盆（高30 cm，內(nèi)徑25 cm）中，每盆3株，一共72盆，置于人工氣候室培養(yǎng)；盆內(nèi)盛有國際水稻Hoagland營養(yǎng)液（霍格蘭配方）[14]，每3 d更換1次營養(yǎng)液；氣候室生長條件為晝/夜溫度為30℃/25℃，晝/夜光周期為12 h/12 h，相對濕度為75%，光照強(qiáng)度為3 000 Lx。本試驗(yàn)各處理除溫度和模擬干旱外，其余環(huán)境設(shè)置均相同。試驗(yàn)設(shè)正常生長（CK）、單一干旱（DT）、單一高溫（HT）及干旱–高溫同時（DH）4個處理。以葉齡余數(shù)法[15]診斷幼穗發(fā)育進(jìn)程，此時大多數(shù)稻穗進(jìn)入花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期[16-17]。其中，（1）正常對照：Hoagland營養(yǎng)液中不添加10% PEG-6000，晝夜溫度為 30℃/25℃；（2）單一干旱處理：在已有文獻(xiàn)[18]和前期預(yù)備試驗(yàn)基礎(chǔ)上，明確了10% PEG-6000可使水稻達(dá)到中度干旱脅迫程度，故本研究確定采用10% PEG-6000 Hoagland澆灌模擬中度干旱脅迫，每處理重復(fù)3次，每重復(fù)6盆，培養(yǎng)3 d；（3）單一高溫處理：除人工氣候室晝夜溫度變?yōu)?8℃/25℃外，其它條件不變[19]，高溫連續(xù)處理3 d，每處理重復(fù)3次，每重復(fù)6盆；（4）干旱-高溫同時處理：用10% PEG-6000 Hoagland澆灌，且設(shè)高溫38℃/25℃處理3 d，每處理重復(fù)3次，每重復(fù)6盆。脅迫結(jié)束后，取水稻劍葉用超純水洗凈、擦干。準(zhǔn)確稱取水稻劍葉樣品1g放入研缽，用液氮研磨，再轉(zhuǎn)移到5 mL的離心管中，加入3 mL 80%的冷甲醇，置于4℃冰箱浸提過夜。加1 g的 PVPP，以 10℃震蕩 20 min，之后以 12 000 rpm、4℃離心10 min，取上清于新離心管。向殘雜中加入1 mL 80%的冷甲醇，重復(fù)上一步，取上清合并，并過SPE C18柱（先分別用甲醇和70%的甲醇各5 mL活化）去雜純化，再用0.22 μm的微孔有機(jī)濾膜過濾，然后收集濾液，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｓ眠^的SPE C18柱可以采用純甲醇和乙醚洗去親酯色素，以便重復(fù)利用。

1.4 色譜條件

色譜柱：C18反相色譜柱（5 μm×4.6×250 nm）；流動相A為甲醇，C為0.5%乙酸的水溶液；流速為0.9 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；紫外檢測波長設(shè)置為272 nm、236 nm和254 nm以及全掃波段；柱溫為30℃。洗脫梯度見表1。

2 結(jié)果與分析

表1 流動相的洗脫梯度比例 （%）

2.1 色譜條件的優(yōu)化2.1.1 流動相的選擇

分別采用甲醇-水和甲醇-乙酸水作為流動相進(jìn)行分析測定。結(jié)果表明，以甲醇-水為流動相時，色譜峰分離效果不是很好；以甲醇-乙酸水為流動相時5種標(biāo)品能得到很好的分離，且色譜峰的峰形尖銳、理想。因此，選擇甲醇-乙酸水為流動相。配制了體積分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和 0.5%的乙酸水溶液。色譜峰分離結(jié)果表明，當(dāng)乙酸水溶液為0.5%時，5種激素可獲得較好的分離效果和色譜峰形。

表2 植物內(nèi)源激素洗脫條件

2.1.2 流動相pH值、配比的選擇

用乙酸分別調(diào)節(jié)流動相 pH 值為 2.5、3.0、3.5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動相的pH值變化直接影響化合物的分離效果，當(dāng)流動相pH值為3.0時，各化合物獲得最佳分離效果。因此選擇pH值為3.0的乙酸水溶液。

本實(shí)驗(yàn)考察了流動相甲醇與水的比例對5種標(biāo)準(zhǔn)品激素的洗脫速度和分離度的影響。流動相洗脫時間與比例如表2所示，與方法一、二和三相比，方法四使得5種標(biāo)準(zhǔn)品的分離效果較好。因此，我們選擇方法四。

2.1.3 吸收波長的選擇

我們設(shè)置5個波長，分別是236 nm、240 nm、246 nm、254 nm和272 nm，發(fā)現(xiàn)水楊酸在236 nm時波形尖銳、理想；玉米素、生長素和脫落酸在波長為272 nm時，峰型效果好；但由于赤霉素含量很低，因此，我們選擇赤霉素的最大吸收波長，為254 nm。而波長為240 nm和246 nm不能滿足峰型尖銳。因此，我們將本試驗(yàn)的檢測波長設(shè)為為236 nm、254 nm和272 nm。5種激素的標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖如圖1所示。

圖1 五種植物內(nèi)源激素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及其線性范圍

標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度范圍在3.125～1 000 mg/kg之間，設(shè)置5個梯度，在上述色譜條件下進(jìn)行檢測，以質(zhì)量濃度（x）與峰面積（y）進(jìn)行線性回歸，得出各激素標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線（見表 2），相關(guān)系數(shù) R2＞0.9996，以 3 倍信噪比（S/N=3）求得5種激素的檢出限，并以線性范圍的下限濃度作為本試驗(yàn)實(shí)測樣品的定量限。結(jié)果表明，5種激素標(biāo)準(zhǔn)品在3.125～1 000 mg/kg范圍內(nèi)線性良好，可滿足定量分析的要求?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品出峰如圖1。

2.3 回收率和精密度試驗(yàn)

為減少實(shí)驗(yàn)過程的人為污染，確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，需要對水稻劍葉樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率的測定。稱取已知含量的樣品3份，精密加入Z、GA、IAA、SA和ABA標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液高濃度、中濃度和低濃度3個濃度1 mL，按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作測定，每個樣做3次平行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)加入標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度與檢出質(zhì)量濃度計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表4。5種激素的回收率在 45.73%～116.70%之間，RSD 范圍為 0.75%～26.72%，回收效果較好，精密度較高。

2.4 水稻劍葉樣品的測定

按1.3樣品提取、純化方法處理樣品，利用建立的方法對高溫、干旱及高溫干旱同時脅迫處理的水稻劍葉內(nèi)源激素的含量進(jìn)行測定。結(jié)果（表5）顯示，與CK相比，HT、DT和DH處理的水稻劍葉Z、GA和IAA含量都下降，而SA和ABA含量明顯上升。脅迫處理下，Z的含量比 CK 分別低 8.63%、35.08%和 39.27%；GA 的含量比 CK 分別低 40.85%、34.76%和 76.22%；IAA 的含量比 CK 分別低 38.62%、21.26%和 43.78%；SA 的含量比 CK 分別高 16.54%、25.78%和 18.28%；ABA 的含量比 CK 分別高 30.00%、48.75%和 171.25%。DH 處理下，Z、IAA、GA和SA含量基本上低于DT和HT處理，而ABA含量明顯高于DT和HT處理。

表3 回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢測范圍、檢出限和定量限

表4 五種植物內(nèi)源激素加標(biāo)回收率（n=3）

表5 不同脅迫處理下孕穗期水稻劍葉各內(nèi)源激素的含量 （μg/g）

3 討論

本文通過高效液相色譜法快速、有效地檢測不同脅迫處理孕穗期水稻劍葉內(nèi)源激素的含量。峰形尖銳、分離效果理想，加標(biāo)回收率達(dá) 45.73%～116.70%，方法能滿足內(nèi)源激素定量測定的要求，為進(jìn)一步檢測水稻生長過程中內(nèi)源激素的變化與水稻生長、衰老等相關(guān)性研究提供了關(guān)鍵技術(shù)。運(yùn)用此方法測定高溫、干旱以及高溫干旱同時脅迫孕穗期水稻劍葉內(nèi)源激素的含量，結(jié)果表明，Z、IAA和GA的含量脅迫處理要比正常生長的低，且復(fù)合脅迫處理比單獨(dú)脅迫的還要低，說明復(fù)合脅迫增強(qiáng)了對小穗的傷害。