尹超云， 張 垚，陳振威，張安偉，張旋風(fēng)，張日亭，步雪峰

(1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 血管外科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212000； 2.江蘇大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 3.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院 普外科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212002)

胃癌(gastric cancer)是中國(guó)常見(jiàn)的消化道腫瘤之一，居于第2位[1]。腫瘤的轉(zhuǎn)移是影響腫瘤預(yù)后重要的原因之一，而腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移能力是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。IFN λ 家族是一組新型人白細(xì)胞介素(interleukin，IL)，又名Ⅲ型 IFN，包 括 IL-29 (IFN-λ1)、IL-28A(IFN-λ2) 和 IL-28B(IFN-λ3)，具有抗增殖、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)活性[2]。有研究表明，表達(dá)IL-29 的重組新城疫病毒LoSota 株(recombinant Newcastle disease virus LoSota strain expressing IL-29， rL-IL29) 抑制肺腺癌A549 細(xì)胞的增殖及遷移與AKT途徑有關(guān)[3]，對(duì)于IL-29 是否能抑制胃癌細(xì)胞增殖與遷移尚不清楚。在多種癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)ERK(extracellular signal regulated kinase,ERK)的被異常激活，是腫瘤發(fā)生的重要因素之一。研究表明胃癌患者血清中磷酸化ERK蛋白水平升高，且隨著胃癌分期的增加其表達(dá)量也增加[4]。同時(shí)ERK與AKT在腫瘤轉(zhuǎn)移的通路中具有重要的作用。本實(shí)驗(yàn)探討IL-29對(duì)胃癌BGC細(xì)胞增殖和遷移的影響及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法：

1.1 材料

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV) (哈爾濱獸醫(yī)研究所)；rL-IL29(本實(shí)驗(yàn)組構(gòu)建)；人胃癌細(xì)胞系BGC(中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心)；RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(維森特生物技術(shù)南京公司)；兔抗IL-29、MMP2(72、66 ku)、p-AKT抗體(美國(guó)博士德生物公司)；兔抗P-ERK1/2、HRP標(biāo)記的抗雞(Abbkine公司)；HRP標(biāo)記羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG(均上?？禐槭兰o(jì)公司)；Alexa Flour 488標(biāo)記羊抗鼠IgG、Cy3標(biāo)記羊抗鼠IgG(KLP公司)；CCK-8試劑盒(南京厚載生物科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理:將BGC細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的RPMI 1640(加100 U/mL青-鏈霉素)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)增殖的BGC細(xì)胞隨機(jī)種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h，待BGC細(xì)胞覆蓋6孔板孔80%左右時(shí)將6孔板隨機(jī)分為PBS組(即對(duì)照組)、rL-IL29組及NDV組。用1640培養(yǎng)基將IL-29及NDV稀釋至10 000倍感染6孔板內(nèi)BGC細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后為下一步實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備，每組樣本重復(fù)3次。

1.2.2 CCK8法檢測(cè)BGC細(xì)胞活力：在96孔板每孔中加入BGC細(xì)胞懸液100 μL (約5 000～10 000個(gè)細(xì)胞)，邊緣孔用PBS填充，在恒溫培養(yǎng)箱中孵育12 h。將IL-29及NDV病毒稀釋倍數(shù)為為原液的10-2、10-3、10-4、10-5和10-6，每孔加入上述濃度10 μL的稀釋病毒液，培養(yǎng)箱孵育24 h。再在每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱孵育4 h。設(shè)置無(wú)胃癌細(xì)胞的空白孔(培養(yǎng)基和CCK-8溶液)，有胃癌細(xì)胞的對(duì)照孔(不加培養(yǎng)基和CCK-8溶液)，每組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔。測(cè)定450 nm各孔的吸光度值。細(xì)胞活力=(實(shí)驗(yàn)組a-空白組a)/(對(duì)照組a-空白組a)

1.2.3 病毒滴度測(cè)定: 將細(xì)胞增殖狀態(tài)良好的BGC 細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后稀釋至1×105個(gè)/mL，加入96孔板，100 μL/孔(37 ℃，5% CO2)，培養(yǎng) 24 h 后加病毒。在1.5 mL離心管中，設(shè)置6個(gè)稀釋度，第一管加90 μL培養(yǎng)液，然后加入10 μL病毒原液，混勻后吸取10 μL加入第2個(gè)離心管中，以此類(lèi)推，培養(yǎng)24 h后觀察其死亡(或陽(yáng)性)數(shù)，然后計(jì)算出各稀釋點(diǎn)引起死亡累積數(shù)的死亡率。所求得的值就寫(xiě)為EID50。其算法為:lgEID50=高于 50%死亡的稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)+稀釋系數(shù)的對(duì)數(shù)×距離比距離比=(高于50%的死亡率-50%) /(高于50%的死亡率-低于50%的死亡率)

1.2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖：將6孔板孔分為對(duì)照組、IL-29 組及NDV 組細(xì)胞，按每孔1 500 個(gè)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)接種對(duì)數(shù)增殖的BGC細(xì)胞， 每組設(shè)立3 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h 后予以換液，每隔2～3 d 換1 次培養(yǎng)基，培養(yǎng)10 d后，結(jié)晶紫染液進(jìn)行染色，計(jì)數(shù)并拍照。按公式計(jì)算: 克隆形成率(%)=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%(以50個(gè)細(xì)胞以上為一個(gè)集落)。

1.2.5 Western blot檢測(cè)IL-29、NDV、MMP2、p-ERK和p-AKT蛋白：將1.2.1中準(zhǔn)備好的6孔板里的細(xì)胞提取蛋白。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，再轉(zhuǎn)膜，5% BSA封閉1 h，分別加入雞抗NDV蛋白抗體(1∶800)、兔抗IL-29、MMP2、p-AKT(1∶300)、兔抗P-ERK(1∶400)及β-肌動(dòng)蛋白抗體(1∶2 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。加入羊抗鼠或羊抗兔或羊抗雞 HRP-IgG(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL顯色掃描，LANE.1D軟件進(jìn)行條帶吸光度值定量分析。

1.2.6 免疫熒光檢測(cè)p-ERK的表達(dá)： 24孔板內(nèi)對(duì)數(shù)增殖的BGC細(xì)胞經(jīng)病毒處理培養(yǎng)24 h 后，在室溫下經(jīng)4%多聚甲醛固定4 h，PBS洗3次，0.5% Triton×100室溫下處理細(xì)胞30 min，PBS洗3次，經(jīng)5% BSA封閉1 h，p-ERK一抗4 ℃孵育過(guò)夜。PBS洗3次，Cy3標(biāo)記的兔二抗(1：200)染色1 h，PBS洗3次；Hoechst 33342 染色細(xì)胞核10 min，PBS洗3次后置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲：用無(wú)血清 DMEM 配制成約1×105個(gè)/mL的BGC細(xì)胞懸液，取 200 μL滴入24孔板Transwell小室的上室，下室分別加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基稀釋的PBS(對(duì)照組)、NDV及rL-IL29(1∶1 000)各500 μL，每組均設(shè)立2個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培育 24 h。用棉簽擦去 Transwell 上室聚碳酸酯膜表面的細(xì)胞，PBS洗2遍，將上室置于4%多聚甲醛中固定15min。PBS洗2遍后，結(jié)晶紫染色20 min，再用PBS洗2遍后，倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)10個(gè)不同視野的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。

1.2.8 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移：24孔板中的BGC細(xì)胞用含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基進(jìn)行培育，待細(xì)胞覆蓋率達(dá)80% ～ 90% 時(shí)，用無(wú)菌10 μL 的加樣槍頭在細(xì)胞層中緩緩的縱向劃一條直線(xiàn)，同時(shí)保持劃痕的寬度均勻一致; 再用PBS 洗3遍，用1640培養(yǎng)基將病毒rL-IL29、NDV分別稀釋到10 000倍，將稀釋后rL-IL29、NDV病毒稀釋液加入到24孔板中作為rL-IL29組和NDV組，同時(shí)用1640培養(yǎng)基作為對(duì)照組。分別于劃痕后0、24 h 在倒置顯微鏡下觀察劃痕間距。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CCK8檢測(cè)病毒對(duì)BGC活力的影響

隨著病毒的稀釋倍數(shù)降低時(shí)，胃癌細(xì)胞的活力降低，當(dāng)病毒稀釋液濃度為10-2、10-3時(shí)細(xì)胞活力<80%。選用細(xì)胞活力>80%時(shí)的滴度[5]，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)病毒稀釋液選擇10-4作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的工作濃度，此時(shí)La Sota系NDV病毒液及rL-IL29 病毒液的滴度都在雞胚半數(shù)感染量 (50% egg infective doses，EID50) 為109.8 EID 50 /mL左右(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with the NDV group圖1 不同濃度的rL-IL29及NDV病毒對(duì)BGC胃癌細(xì)胞活力的影響Fig 1 Effects of different concentrations of rL-IL29 and NDV viruses on the cell vitality in gastric cell

2.2 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)rL-IL29感染對(duì)BGC細(xì)胞增殖的影響

將兩種稀釋后的病毒感染胃癌細(xì)胞BGC培養(yǎng)10 d 后，rL-IL29、NDV病毒抑制了胃癌細(xì)胞BGC的增殖，同時(shí)rL-IL29組的胃癌細(xì)胞較NDV及PBS組受到明顯的抑制 (P<0.05)(圖2)。

2.3 NDV、IL-29、p-ERK、MMP2和pAKT蛋白的表達(dá)

NDV蛋白在rL-IL29 組及NDV組穩(wěn)定表達(dá)，rL-IL29組的 IL-29 蛋白表達(dá)較NDV 組及PBS組明顯升高(P<0.05)，p-ERK蛋白在rL-IL29組、NDV組的相對(duì)表達(dá)量較PBS組明顯降低(P<0.05)，且rL-IL29組的p-ERK蛋白表達(dá)量低于NDV組(P<0.05)；MMP2及pAKT得到了相似的結(jié)論(圖3)。

*P<0.05 compared with the PBS group；#P<0.05 compared with the NDV group圖2 rL-IL29 感染對(duì)BGC細(xì)胞增殖的影響Fig 2 Effect of rL-IL29 infection on proliferation in gastric cell line

*P<0.05 compared with the PBS group；#P<0.05 compared with the NDV group圖3 感染 rL-IL29 后對(duì) BGC 細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白的影響Fig 3 Effect of rL-IL29 on the migration-related protein in gastric cell line

2.4 P-ERK的免疫熒光檢測(cè)

P-ERK蛋白在rL-IL29組的蛋白表達(dá)量明顯低于NDV組及PBS組(P<0.05)，p-ERK蛋白在NDV組的蛋白表達(dá)量明顯低于PBS組(P<0.05)(圖4)。

2.5 rL-IL29 抑制 BGC 胃癌細(xì)胞侵襲能力：

rL-IL29 組穿過(guò)Transwell 小室的胃癌細(xì)胞數(shù)明顯少于 NDV 組及 PBS組(P<0.05)，NDV 組的胃癌細(xì)胞穿過(guò) Transwell 小室的細(xì)胞數(shù)明顯少于 PBS 組(P<0.05) (圖5)。

2.6 rL-IL29 抑制BGC細(xì)胞的遷移能力

48 h 后rL-IL29 組 BGC 細(xì)胞的遷移距離明顯低于 NDV 組和 PBS 組，NDV 組 BGC 細(xì)胞的遷移距離明顯低于 PBS組 (P<0.05)(圖6)。

3 討論

新城疫病毒(NDV) 具有很好的溶瘤作用且對(duì)人的致病性極低，可以促進(jìn) NK 細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ從而上調(diào) NK 細(xì)胞 TRAIL 蛋白表達(dá)，致使腫瘤細(xì)胞的凋亡與壞死[6]。 IL-29 在人體多種細(xì)胞中均有表達(dá)，同時(shí)它的活性最強(qiáng)， IL-29 通過(guò)與 IL-28R1 結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[7]。IFN λ 可以明顯抑制鼠的皮下瘤肺轉(zhuǎn)移的作用[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在rL-IL29轉(zhuǎn)染BGC胃癌細(xì)胞24H后，IL-29 蛋白表達(dá)明顯高于其他組，可以表明rL-IL29穩(wěn)定表達(dá)IL-29。 同時(shí)從細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwel可以看出rL-IL29明顯抑制了胃癌細(xì)胞的增殖與遷移作用，且 rL-IL29的抑制效果較 NDV更明顯。

ERK是一類(lèi)絲/蘇氨酸激酶，在細(xì)胞的增殖、遷移、分化和凋亡等多種過(guò)程發(fā)揮了重要作用，當(dāng)受到細(xì)胞外信號(hào)刺激時(shí)，可激活ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路，參與了細(xì)胞外信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)的經(jīng)典途徑[9]。有研究表明異常激活的磷酸化的ERK在胃癌、肺癌等多種惡性腫瘤中均能發(fā)現(xiàn)，同時(shí)ERK通路也涉及惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及惡化過(guò)程[10]。本研究中rL-IL29組ERK蛋白磷酸化水平(p-ERK)較NDV組及PBS組下調(diào)，說(shuō)明rL-IL29可以下調(diào)p-ERK從而抑制了ERK的信號(hào)傳導(dǎo)通路?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs) 是一類(lèi)細(xì)胞外蛋白水解酶，可以將細(xì)胞外基質(zhì)中的各種蛋白成分降解[11]。MMP2 作為其家族中的一員，在基底膜的降解以及腫瘤細(xì)胞遷移、浸潤(rùn)中起著至關(guān)重要的作用[12]，MMP2 表達(dá)強(qiáng)度與胃癌分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[13]。AKT 是 PI3K/AKT信號(hào)通路中的原癌基因，PDK1可以激活PI3K/AKT， 活化的 AKT可以調(diào)節(jié)其下游的多條通路，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、抗凋亡以及遷移[14]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)rL-IL29可以下調(diào)MMP2和p-AKT的水平，從而進(jìn)一步證明rL-IL29可以抑制BGC胃癌細(xì)胞的遷移，同時(shí)也表明rL-IL29的抑制腫瘤細(xì)胞的機(jī)制與下調(diào)MMP2和p-AKT蛋白有關(guān)。

*P<0.05 compared with the PBS group；#P<0.05 compared with the NDV group圖4 感染 rL-IL29 后對(duì) BGC 細(xì)胞p-ERK蛋白的影響Fig 4 Effect of rL-IL29 on p-erk protein in gastric cell line

*P<0.05 compared with the PBS group；#P<0.05 compared with the NDV group圖5 感染 rL-IL29 后對(duì) BGC 細(xì)胞侵襲性的影響Fig 5 Effect of rL-IL29 infection on the invasiveness in gastric cell line

*P<0.05 compared with the PBS group；#P<0.05 compared with the NDV group圖6 感染 rL-IL29 后對(duì) BGC 細(xì)胞遷移的影響Fig 6 Effect of rL-IL29 infection on migration in gastric cell line

綜上，本研究表明 rL-IL29 可能通過(guò)阻礙ERK, PI3K /Akt信號(hào)通路，下調(diào)MMP2蛋白的表達(dá)，從而抑制 BGC胃癌細(xì)胞的增殖與遷移，但兩條通路的具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。