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(福建省漁業(yè)資源監(jiān)測中心，福建 福州 350003)

恩諾沙星(Enrofloxacin)是人工合成的第三代喹諾酮類化合物——氟喹諾酮類藥物中的一種，具有抗菌譜廣、抗菌活性強等特點[1]，對大多數(shù)革蘭氏陰性菌、部分革蘭氏陽性菌及某些支原體、衣原體、立克次氏體等均有抑菌作用[2]，因此在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛使用。同時，恩諾沙星在動物體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物為環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin)，環(huán)丙沙星同樣也具有較強的抗菌活性，從而進一步提升了恩諾沙星作為抗菌藥的使用效果。由于此類藥物的濫用易引起致病菌耐藥性的增強，一方面將導致生態(tài)環(huán)境的惡化，另一方面也對水產(chǎn)品的食用安全帶來隱患[3]，因此在《漁藥使用規(guī)范》(SC/T 1132—2016)中將恩諾沙星列入水產(chǎn)養(yǎng)殖處方用藥品種目錄中，在使用過程中需嚴格遵守使用規(guī)定。對此我國相關部門也制定了相關要求進行控制，例如我國現(xiàn)行的《無公害食品 漁用藥物使用準則》(NY 5071—2002)中將環(huán)丙沙星列為禁用藥物；“中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告 第235號動物性食品中獸藥最高殘留限量”中規(guī)定恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星在水產(chǎn)動物肌肉中的總殘留量不得超過100 μg/kg[4]。

大黃魚(Larimichthyscrocea)是我國最大規(guī)模的海水養(yǎng)殖魚類[5]，福建為其主要養(yǎng)殖集中地區(qū)，2017年福建省大黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)量為15.05×104t，占全國大黃魚養(yǎng)殖總產(chǎn)量的84.7%[6]，2017年福建省大黃魚出口創(chuàng)匯達1.78億美元，占全國大黃魚出口額的83.2%[7]。在開放式高密度的養(yǎng)殖過程中，大黃魚常受到各種疾病的侵害，嚴重影響著大黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)量和漁民利益。其中白點病是危害大黃魚養(yǎng)殖最嚴重的病害，其治療特效藥正是恩諾沙星[8-9]，這也導致近年在相關部門的抽檢中，時常發(fā)生大黃魚恩諾沙星超標問題。目前針對恩諾沙星在水生動物體內(nèi)的藥物殘留消除研究較多，如針對大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[10-11]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[12]、鱘(Acipenser)[13]、日本鰻鱺(Anguillajaponica)[14]、中國對蝦(Fenneropenaeuschinensis)[15]、羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)[16]、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[17]、擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)[18]、烏鱧(Ophiocephalusargus)[19]、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)[20]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[21-22]等，但針對大黃魚體內(nèi)恩諾沙星和環(huán)丙沙星的殘留消除研究較少，尤其是采用最接近實際養(yǎng)殖的投喂方式開展的研究尚未見報道。

本研究以大黃魚為受試對象，模擬真實養(yǎng)殖過程，首次采用藥餌投喂方式對恩諾沙星及其代謝物環(huán)丙沙星在大黃魚體內(nèi)的殘留規(guī)律進行探索，提出養(yǎng)殖過程中恩諾沙星的給藥方案和休藥期建議，為指導大黃魚健康養(yǎng)殖和保障水產(chǎn)品質量安全提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗對象與養(yǎng)殖條件

于2017年4月，購買網(wǎng)箱養(yǎng)殖的大黃魚250尾，平均體重為(250±28)g，魚體健康。實驗前在養(yǎng)殖池(規(guī)格為長8 m×寬4 m，裝載水體20 t，材料為紅磚水泥池)中暫養(yǎng)15 d，暫養(yǎng)期間每日投喂2次，減少人為因素對大黃魚的干擾，使實驗用魚逐漸適應環(huán)境和投喂方式。暫養(yǎng)期間隨機抽取7尾實驗用魚，進行血漿、肌肉和肝臟組織中恩諾沙星及環(huán)丙沙星檢測，確認無恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留。實驗用飼料為人工配合飼料，經(jīng)檢測均不含恩諾沙星和環(huán)丙沙星。在整個實驗過程中，大黃魚養(yǎng)殖池水溫維持在(20±3)℃，養(yǎng)殖水從海區(qū)抽取經(jīng)過三級沙濾后流入養(yǎng)殖池，養(yǎng)殖過程中持續(xù)充氧，鹽度為33～35，pH為8.0～8.5。實驗期間實驗組、對照組大黃魚飼養(yǎng)成活率均為100%。

1.2 儀器與試劑

QTRAP 5500液相色譜-串聯(lián)質譜儀(美國 AB SCIEX公司)，Acquity I-Class超高效液相色譜儀(美國 Waters公司)；BP211D電子天平(德國Sartorius公司)；3-30K高速冷凍離心機(德國Sigma公司)；旋轉蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)等。

實驗用恩諾沙星原粉(純度≥98%，CNW公司)及恩諾沙星、環(huán)丙沙星標準品(純度≥98%，CNW公司)，恩諾沙星-D5、環(huán)丙沙星-D8(德國Witega公司)。肝素鈉(國藥集團化學試劑有限公司)；乙腈、乙酸銨(色譜純，Merck公司)；甲酸(色譜純，Tedia公司)；無水硫酸鈉(分析純，國藥集團)，經(jīng)650℃灼燒4 h，冷卻后貯存于密封容器中備用。

1.3 給藥方式與樣品采集

精確稱取恩諾沙星5.000 g，用適量5%冰醋酸溶解，再用超純水定容至100 mL，搖勻，得到恩諾沙星溶液濃度為50 mg/mL，噴灑于1 000 g飼料上攪拌均勻，制備成恩諾沙星含量為5 mg/g的藥餌顆粒。給藥前1 d停飼，按每日給藥量25 mg/kg魚體質量的藥餌連續(xù)飼喂5 d，其中設置1組空白對照組投喂無藥飼料。第5天藥餌投喂結束后，所有實驗池后續(xù)均使用無藥飼料進行投喂。在最后一次投喂藥餌后的8、12 h以及1、2、3、7、10、15、20和30 d，每個采樣時間點采集7尾大黃魚，分別采集大黃魚血漿、肌肉和肝臟組織，其中以尾靜脈采血的方式采集血漿，將采集的血漿轉移至2 mL預先用1%肝素鈉溶液處理過的離心管中，以3 000 r/min離心10 min，取上清液于-20℃保存待檢；肌肉和肝臟組織樣品制為均勻樣品后，于-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 檢測方法

本研究采用高效液相色譜質譜串聯(lián)法檢測恩諾沙星及環(huán)丙沙星[23]，方法簡要介紹如下：

色譜柱為Waters Acquity BEH C18柱，50 mm×2.1 mm，粒徑1.7 μm；流動相為0.1%甲酸溶液(含5 mmol/L乙酸銨)和乙腈，采用梯度洗脫分離；流速0.200 mL/min；進樣量1.00 μL。使用大氣壓噴霧電離源(ESI)，正離子模式，采用選擇反應監(jiān)測(MRM)掃描模式。

對于肌肉和肝臟樣品，參照“農(nóng)業(yè)部1077號公告-1-2008水產(chǎn)品中17種磺胺類及15種喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法”[24]的方法進行樣品前處理檢測。對于血漿樣品，取1.00 mL血漿樣品至10 mL離心管中，準確加入25 μL 1.00 mg/L內(nèi)標溶液，加入5 mL 1%甲酸-乙腈溶液(V/V)，渦旋混合1 min，再加入3 g無水硫酸鈉，再次渦旋混合1 min，以 10 000 r/min轉速離心5 min。殘渣重復提取一次，上清液轉移至25 mL雞心瓶中，40℃水浴旋蒸至近干，用1 mL流動相溶解，過0.22 μm濾膜后上機檢測。

在樣品檢測過程中，通過添加平行樣品、基質加標樣品和空白樣品進行質量控制。由于前期采樣點樣品中環(huán)丙沙星和恩諾沙星含量較高，因此可采用適當減少稱樣量，或同倍數(shù)的加大定容體積和同位素內(nèi)標加入量，確保樣液檢測濃度在檢測標準工作曲線范圍內(nèi)。

2 結果與分析

2.1 分析方法回收率與精密度[23]

本研究所用分析方法對恩諾沙星及環(huán)丙沙星在1～500 μg/L范圍內(nèi)線性關系良好，曲線方程分別為Y=1.771 0X+0.003 62和Y=1.892 67X-0.076 07，相關系數(shù)R2分別為0.999和0.998，兩種沙星在血漿、肌肉和肝臟三種組織中的檢測限分別為2 μg/L、1 μg/kg和2 μg/kg。在加標水平2～100 μg/L時，方法回收率在87.0%～109%，相對偏差小于8.7%(n=6)，結果表明本方法滿足殘留分析要求。

2.2 恩諾沙星及環(huán)丙沙星在大黃魚組織中的殘留情況

連續(xù)藥餌投喂大黃魚后，其血漿、肌肉和肝臟中的恩諾沙星和環(huán)丙沙星的含量變化均隨著休藥時間的延長逐漸下降(圖1～3)。恩諾沙星含量在大黃魚的血漿、肝臟和肌肉中較快達到最大值，達峰時間分別為8、12和12 h，濃度分別為3.068 mg/L、3.446 mg/kg和4.089 mg/kg；在給藥后的前3 d下降明顯，血漿中的恩諾沙星濃度從最高的3.068 mg/L降至0.522 mg/L，肌肉和肝臟中的恩諾沙星含量分別從最高的3.446 mg/kg和4.089 mg/kg降至0.422 mg/kg和0.276 mg/kg；之后藥物濃度下降速度明顯變慢，一直到給藥后的第30天，恩諾沙星在血漿、肌肉和肝臟中仍均可檢出，濃度分別為0.017 mg/L、0.051 mg/kg和0.025 mg/kg。

相比于恩諾沙星濃度，在大黃魚各組織中環(huán)丙沙星濃度處于較低水平，表明恩諾沙星在大黃魚體內(nèi)僅有少部分代謝成環(huán)丙沙星。血漿和肌肉中的環(huán)丙沙星峰值均出現(xiàn)在第8 h，峰濃度分別為0.104 mg/L和0.355 mg/kg，之后下降迅速。肝臟中的環(huán)丙沙星含量在12 h達到峰值，峰濃度為0.753 mg/kg，隨后3 d內(nèi)較快下降至0.059 mg/kg，之后消除速率變慢。給藥10 d后，血漿中的環(huán)丙沙星不再檢出，但直至給藥后的第30天，肌肉和肝臟中仍可檢出極低含量的環(huán)丙沙星，含量分別為5.66×10-3和2.31×10-3mg/kg。

3 討論

3.1 環(huán)丙沙星在大黃魚體內(nèi)的殘留消除規(guī)律

已有研究表明恩諾沙星進入水生生物體內(nèi)后，98%仍以原藥形式存在，作為其主要代謝產(chǎn)物的環(huán)丙沙星含量較低[25]，本研究得到的結果也再次驗證了這一現(xiàn)象。環(huán)丙沙星雖然為漁用禁用藥物，但在實際使用恩諾沙星的過程中，不可避免會代謝產(chǎn)生環(huán)丙沙星。此外，中國農(nóng)業(yè)部第235號公告[4]中的恩諾沙星殘留限量也明確規(guī)定為恩諾沙星和其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星的總殘留量。因此，研究恩諾沙星代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星在大黃魚體內(nèi)的藥物代謝動力學特征也同樣具有重要意義。

恩諾沙星有多種代謝途徑，最主要的是脫去乙基代謝成為環(huán)丙沙星，但其代謝程度存在種屬差異。鄭宗林等[22]研究恩諾沙星在中華絨螯蟹體內(nèi)的代謝規(guī)律發(fā)現(xiàn)，恩諾沙星轉化為環(huán)丙沙星的代謝率為1.4%～6.2%。Koc等[26]以10 mg/kg恩諾沙星口灌褐鱒(Salmotruttafario)，給藥后0.08～120 h，血漿中均未檢測到環(huán)丙沙星。在本研究中，環(huán)丙沙星在大黃魚血漿、肌肉和肝臟中均可檢出，但環(huán)丙沙星占恩諾沙星和環(huán)丙沙星二者總量的比值較低，說明在大黃魚中起抑菌作用的仍以恩諾沙星為主，代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星所起的作用較小。各組織間環(huán)丙沙星所占比值表現(xiàn)出了較大的差異性：在血漿、肌肉和肝臟中的環(huán)丙沙星分別占恩諾沙星和環(huán)丙沙星二者總量的比值為4.2%～7.5%、5.5%～16.7%、5.8%～23.8%，其中肝臟中環(huán)丙沙星的占比最高，其次為肌肉，血漿中的環(huán)丙沙星占比量最低，說明恩諾沙星主要是在肝臟中脫去乙基代謝成環(huán)丙沙星。

3.2 休藥期的確定

與本實驗采取藥餌給藥方式研究恩諾沙星在水生動物體內(nèi)的藥物代謝動力學不同的是，大多數(shù)研究者采取的是肌注或口灌給藥方式。肌注和口灌給藥方式可以精確控制每一個實驗個體的藥物注射劑量，但在實際養(yǎng)殖中操作難度較大，有可能對魚體造成損傷，且針對種類復雜的水生生物體無法被廣泛采用。投喂給藥與實際生產(chǎn)最為接近，且適合大面積推廣。但由于存在個體差異，投喂給藥方式下的個體食藥量無法精確控制。參考肌注或口灌給藥實驗模式，取樣時間點樣品采集較多選擇為3尾[13]或5尾[18，27-29]，本研究在每個取樣點采集大黃魚7尾，通過增加每批次實驗個體數(shù)量，最大程度地減小個體差異帶來的影響，最終得到的結果能夠較好地模擬體現(xiàn)實際養(yǎng)殖中恩諾沙星在大黃魚體內(nèi)的殘留代謝規(guī)律。

郭嬌嬌等[13]對雜交鱘(施氏鱘Acipenserschrenckii♂×達氏鰉Husodauricus♀)以10 mg/kg的劑量進行單次口灌給藥，得到休藥期至少為20 d。梁俊平等[10]以20 mg/kg的劑量對大菱鲆進行肌注和口服給藥，得到休藥期肌注應不低于30 d，口服應不低于45 d。李佳蔚等[31]以20 mg/kg的劑量對黑裙(Gephyrocharaxmelanocheir)單次灌服給藥，得到休藥期至少為35 d。徐維海等[15]以50 mg/kg的劑量對吉富羅非魚(Oreochromisniloticus)和中國對蝦連續(xù)投喂7 d，得到吉富羅非魚的休藥期為22 d，中國對蝦的休藥期為12 d。孫慧宇等[32]以20 mg/kg劑量連續(xù)飼喂泥鰍7 d，得到休藥期應不小于32 d。余開等[20]以10 mg/kg的劑量對三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)口灌給藥，得到三疣梭子蟹的休藥期為14 d。由此可見，在不同的實驗條件下，得到的恩諾沙星休藥期數(shù)據(jù)均存在一定的差異，說明休藥期與水產(chǎn)動物的種屬、給藥方式、給藥劑量以及養(yǎng)殖水溫等密切相關。

3.3 給藥方案探討

喹諾酮類藥物對常見細菌的治療效果通常與藥動學和藥效學參數(shù)有關。一般認為，當血漿中藥物的峰濃度(Cmax)與最低抑菌濃度(MIC)的比值達到10以上時，即可起到良好的治療效果，并且當Cmax/MIC=10時，效果最佳[33-34]。馬寅等[35]測得恩諾沙星對溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、最小弧菌(V.mimicus)、哈維氏弧菌(V.harveyi)、創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)等4種常見的水產(chǎn)致病弧菌的MIC為0.1～0.8 mg/L，本研究中連續(xù)藥餌投喂模式下，血漿中藥物峰濃度Cmax為3.068 mg/L，處在最佳抑菌濃度范圍內(nèi)。可見在本實驗條件下，恩諾沙星使用劑量對大黃魚常見的細菌性疾病可以起到較好的治療效果。

4 結論

在(20±3)℃水溫條件下，以25 mg/kg恩諾沙星對大黃魚采取連續(xù)藥餌投喂給藥，恩諾沙星在大黃魚體內(nèi)前期消除較快，并有少量代謝成為環(huán)丙沙星，建議在實際養(yǎng)殖過程中，連續(xù)投喂給藥后，休藥期應不少于18 d。