汪 楠 李 巖

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院GCP辦公室，遼寧 沈陽 110032)

膽汁反流性胃炎(bile reflux gastritis，BRG)是多種原因引起胃黏膜組織損傷的一種疾病，由十二指腸胃反流(duodenogastric reflux，DGR)現(xiàn)象異常增多導(dǎo)致[1]，屬消化內(nèi)科常見疾病之一，其發(fā)生與幽門功能下降、胃竇清除能力降低、十二指腸動(dòng)力異常等因素有關(guān)[2]。這些因素的存在既可增加DGR，又可延緩胃排空，延長胃黏膜與反流液的接觸時(shí)間，從而加重胃黏膜損傷。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)BRG的治療主要應(yīng)用促胃動(dòng)力藥、胃黏膜保護(hù)劑及抑酸劑等，增加了耐藥性及藥物副作用的可能，不宜長期服用。大量臨床實(shí)踐表明，中藥具有療效高、靶點(diǎn)多、副作用小等優(yōu)勢，更有益于BRG的治療。和胃反流康是我院脾胃病科多年臨床觀察篩選的效方，廣泛用于治療各類消化性疾病，如慢性非萎縮性胃炎、BRG、非潰瘍性消化不良等，有疏肝利膽、益氣健脾、和胃降逆功效，可明顯緩解患者胃痛、胃脹、反酸、燒心、嘈雜等癥狀。炎癥細(xì)胞因子在BRG的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，在眾多炎癥細(xì)胞因子中，白細(xì)胞介素6(IL-6)、IL-8的作用表現(xiàn)尤為突出。本實(shí)驗(yàn)通過比較BRG模型大鼠血清及胃黏膜IL-6、IL-8的含量及表達(dá)水平變化，了解和胃反流康對(duì)胃黏膜炎性損害的改善，從而觀察其對(duì)胃黏膜的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(遼)2010-0001。飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物室，常規(guī)顆粒飼料飼養(yǎng)，室溫(20±2) ℃，相對(duì)濕度45%，12 h晝夜節(jié)律，自由食水。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 和胃反流康藥物組成：柴胡15 g，陳皮10 g，白芍10 g，枳殼10 g，香附15 g，炒白術(shù)15 g，茯苓10 g，黃連6 g，蒲公英20 g，半夏10 g，甘草10 g。以上中藥均購自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥局，水煎濃縮，分別制成含量為5.46、2.73、 1.37 g生藥/mL的高、中、低混懸液。多潘立酮片(西安楊森制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20093426)，制成含量為0.278 mg/mL的混懸液。?；悄懰徕c(北京博奧拓達(dá)科技有限公司)；胰酶(美國Amresco公司)；卵磷脂(美國Sigma公司)；4%多聚甲醛溶液(南京森貝伽生物科技有限公司)；10%水合氯醛溶液(上海聯(lián)碩生物科技有限公司)；IL-6、IL-8酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；IL-6免疫組化試劑盒含試劑(武漢云克隆科技股份有限公司)；IL-8免疫組化試劑盒含試劑(美國Sigma公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備 離心機(jī)(C4-12型，法國捷安公司)；酶標(biāo)儀(Antho2010型，奧地利安圖公司)；移液器(美國熱電公司)；水浴恒溫振蕩器(SHA-B型，常州國華儀器設(shè)備廠)；全自動(dòng)脫水機(jī)、包埋機(jī)、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、Q550CW圖象采集和分析系統(tǒng)(德國Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 反流液配制 依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[3]，將牛磺膽酸鈉2.5 g、胰酶1.5 g、卵磷脂0.25 g溶于蒸餾水100 mL中配制成反流液。

1.2.2 動(dòng)物分組 將60只Wistar大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為6組，即空白組、模型組、對(duì)照組及和胃反流康高、中、低劑量組，每組10只。

1.2.3 動(dòng)物造模 除空白組外，其余各組大鼠用配制好的反流液灌胃造模，給藥容積為15 mL/kg，每日1次，連續(xù)5周。

1.2.4 給藥 各給藥組自造模第2周開始至造模結(jié)束，每日造模結(jié)束6 h后灌胃給藥，每日1次[4]。和胃反流康高、中、低劑量組分別予和胃反流康54.6、27.3、13.7 g生藥/kg灌胃；對(duì)照組予多潘立酮片2.78 mg/kg灌胃；空白組、模型組予等容積蒸餾水灌胃。

1.3 取材及指標(biāo)檢測 (1)血清IL-6、IL-8含量檢測。各組大鼠末次給藥前1 d，禁食不禁水24 h，末次給藥后，10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，采集腹主動(dòng)脈全血，常溫下靜置1 h后，于4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清液，-20 ℃凍存，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測血清IL-6、IL-8含量。(2)采集完腹主動(dòng)脈全血后，免疫組化法檢測胃竇部胃黏膜組織IL-6、IL-8表達(dá)水平。每組隨機(jī)取6只大鼠，無菌操作剖腹取胃，將胃內(nèi)容物用冰0.9%氯化鈉注射液漂洗干凈，浸泡于4%多聚甲醛溶液中，4 ℃保存?zhèn)溆?。常?guī)制備石蠟切片，將固定好的胃竇組織取出，自來水下充分沖洗，沖洗后經(jīng)全自動(dòng)脫水機(jī)脫水；透明、浸蠟和包埋(包埋機(jī)上進(jìn)行)；輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片，脫蠟、水化，微波修復(fù)，血清封閉，分別加相應(yīng)的一抗孵育，4 ℃過夜，加二抗后顯色。選擇染色良好的區(qū)域，封片。每只大鼠觀察4張切片，每張切片選取5個(gè)互不重疊視野，顯微鏡下(40×10)觀察IL-6、IL-8表達(dá)水平，陽性表達(dá)為棕黃色顆粒沉著。應(yīng)用Q550CW圖象采集和分析系統(tǒng)，測定單位面積陽性細(xì)胞表達(dá)的平均光密度值(AOD)作為其水平表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清IL-6、IL-8含量比較 見表1。

表1 各組大鼠血清IL-6、IL-8含量比較

由表1可見，模型組大鼠血清IL-6、IL-8水平均高于空白組(P<0.05)；和胃反流康高、中、低劑量組及對(duì)照組大鼠血清IL-6、IL-8水平均低于模型組(P<0.05)；和胃反流康高劑量組大鼠血清IL-6水平低于對(duì)照組(P<0.05)，和胃反流康低劑量組大鼠血清IL-6水平高于對(duì)照組(P<0.05)，和胃反流康中劑量組大鼠血清IL-6水平與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。和胃反流康低劑量組大鼠血清IL-8水平高于對(duì)照組(P<0.05)；和胃反流康高、中劑量組與對(duì)照組大鼠血清IL-8水平兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組大鼠胃黏膜組織IL-6、IL-8 AOD比較 見表2。

表2 各組大鼠胃黏膜組織IL-6、IL-8 AOD比較

由表2可見，模型組大鼠胃黏膜組織IL-6、IL-8 AOD均高于空白組(P<0.05)；和胃反流康高、中、低劑量組及對(duì)照組大鼠胃黏膜組織IL-6 AOD均低于模型組(P<0.05)；和胃反流康高、中劑量組及對(duì)照組大鼠胃黏膜組織IL-8 AOD均低于模型組(P<0.05)；和胃反流康高、中劑組及對(duì)照組大鼠胃黏膜組織IL-6、IL-8 AOD均低于和胃反流康低劑量組(P<0.05)；和胃反流康高、中劑量組及對(duì)照組大鼠胃黏膜組織IL-6、IL-8 AOD兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 各組大鼠胃黏膜組織IL-6表達(dá)免疫組化觀察 各組大鼠胃黏膜組織的上皮細(xì)胞和浸潤的炎癥細(xì)胞均能表達(dá)IL-6，其中空白組大鼠胃黏膜組織細(xì)胞漿內(nèi)未見明顯棕黃色顆粒沉著；模型組大鼠胃黏膜組織細(xì)胞漿內(nèi)可見大量棕黃色顆粒，細(xì)胞核亦可見棕黃色著色，提示IL-6表達(dá)水平較高；和胃反流康高、中、低劑量組及對(duì)照組大鼠胃黏膜組織細(xì)胞漿內(nèi)雖有棕黃色顆粒沉著，但顏色淺、顆粒少，提示IL-6表達(dá)水平較低。見圖1。

圖1 各組大鼠胃黏膜組織IL-6表達(dá)(免疫組化染色，×400)

2.4 各組大鼠胃黏膜組織IL-8表達(dá)免疫組化觀察 各組大鼠胃黏膜組織的上皮細(xì)胞和浸潤的炎癥細(xì)胞均能表達(dá)IL-8，其中空白組大鼠胃黏膜組織細(xì)胞漿內(nèi)未見明顯棕黃色顆粒沉著；模型組大鼠胃黏膜組織細(xì)胞漿內(nèi)可見大量棕黃色顆粒，細(xì)胞核亦可見棕黃色著色，提示IL-8表達(dá)水平較高；和胃反流康高、中劑量組及對(duì)照組大鼠胃黏膜組織細(xì)胞漿內(nèi)雖有棕黃色顆粒沉著，但顏色淺、顆粒少，提示IL-8表達(dá)水平較低；和胃反流康低劑量組在細(xì)胞膜、細(xì)胞漿及細(xì)胞外間質(zhì)均可見較多棕黃色顆粒沉著，與和胃反流康高、中劑量組及對(duì)照組比較，黃棕色顆粒沉著范圍較大，顏色較深，但與模型組比較，黃棕色顆粒沉著范圍較小，顏色相對(duì)較淺，提示和胃反流康低劑量組IL-8表達(dá)水平高于和胃反流康高、中劑量組及對(duì)照組，低于模型組。見圖2。

3 討 論

BRG屬中醫(yī)學(xué)胃脘痛、膽癉、嘈雜、嘔吐等范疇，病位在胃，與肝、膽、脾功能失調(diào)密切相關(guān)，其病因主要包括外邪侵襲、飲食不節(jié)、情志失調(diào)、久病體虛等，基本病機(jī)為氣機(jī)不利，胃失和降。氣機(jī)不利日久，氣郁而化火灼津，以致胃失和降，膽汁隨胃氣上逆，灼傷胃絡(luò)，此為導(dǎo)致BRG發(fā)生的主要原因之一。常見臨床表現(xiàn)有上腹部飽脹不適，胸骨后燒灼感及疼痛感，可與腹脹、噯氣、反酸、燒心、嘈雜、惡心等癥狀同時(shí)出現(xiàn)，本病病程較長，癥狀緩解困難且易復(fù)發(fā)，因此給患者身心造成極大的壓力與痛苦[5]。隨著消化內(nèi)鏡廣泛應(yīng)用于臨床，BRG檢出率也隨之上升，約占同期胃鏡檢出率的22.6%～50.0%[6]。

在BRG形成過程中，膽汁酸是造成黏膜損傷的最主要因素，胰酶和溶血卵磷脂次之。膽汁酸是膽汁的主要成分，屬親脂性類固醇，其“皂化”特性極強(qiáng)，胃黏膜屏障也因此受損[7]。大量研究表明，長時(shí)間反流與胃黏膜活動(dòng)性炎癥、萎縮、腸上皮化生相關(guān)，尤其與幽門螺桿菌(Hp)感染同時(shí)存在時(shí)，胃黏膜腸上皮化生的可能性會(huì)大大增加[8-10]。炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程中，炎癥因子起著重要作用，其中IL-6、IL-8表現(xiàn)尤為突出。作為具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，IL-6對(duì)于炎癥、防御、腫瘤形成等免疫反應(yīng)均有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)功能。同時(shí)，作為重要介質(zhì)，IL-6參與機(jī)體炎性反應(yīng)和一系列病理生理過程，可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞分化，從而增強(qiáng)單核細(xì)胞及自然殺傷(NK)細(xì)胞的殺傷功能。在IL-6參與下，部分腫瘤壞死因子(TNF)如TNF-ɑ可誘導(dǎo)凝血酶形成，使上皮細(xì)胞表面由抗凝轉(zhuǎn)為促凝，導(dǎo)致因微血栓形成而引起的胃黏膜血液循環(huán)障礙，從而大大削弱胃黏膜的防御修復(fù)機(jī)制[11]。目前已知，作為最強(qiáng)的多形核白細(xì)胞趨化和激活因子，IL-8主要生物學(xué)效應(yīng)為刺激中性粒細(xì)胞向炎性組織聚集，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的吞噬作用，使溶酶體酶的生物活性提高，并促進(jìn)其釋放，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)，生成活性氧代謝物，從而加劇局部組織炎癥和潰瘍[12]。此外，IL-8還可趨化其他白細(xì)胞亞類，如嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等[13]。目前研究表明，IL-8可作用于多種細(xì)胞，加速炎性反應(yīng)進(jìn)程，促進(jìn)有絲分裂，刺激血管形成，調(diào)節(jié)宿主免疫功能，在多種炎性反應(yīng)性疾病、腫瘤及免疫相關(guān)疾病的起病過程中發(fā)揮重要作用[14]。研究認(rèn)為，IL-8與胃黏膜損傷的嚴(yán)重程度及炎癥分級(jí)具有一定相關(guān)性[15]。本實(shí)驗(yàn)采用BRG大鼠模型，進(jìn)一步研究和胃反流康對(duì)炎癥因子IL-6、IL-8含量及表達(dá)的影響，探討其對(duì)胃黏膜組織損傷的修復(fù)和改善作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，和胃反流康可降低大鼠胃黏膜組織中IL-6、IL-8含量(P<0.05)，抑制IL-6、IL-8表達(dá)水平(P<0.05)。

圖2 各組大鼠胃黏膜組織IL-8表達(dá)(免疫組化染色，×400)

綜上所述，和胃反流康可顯著減少BRG大鼠血清IL-6、IL-8含量，抑制胃黏膜組織IL-6、IL-8表達(dá)，減輕反流液對(duì)胃黏膜的炎性損害，有助于胃黏膜組織損傷的修復(fù)和改善，從而更好地保護(hù)胃黏膜，為其在臨床上治療BRG提供了現(xiàn)代藥理學(xué)依據(jù)，為進(jìn)一步擴(kuò)大其臨床適應(yīng)證、加速其臨床推廣提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。