溫奇龍，銀喆，羅育，蔡丹昭

1.廣西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，廣西 南寧 530021；

2.廣西醫(yī)科大學廣西高校生物分子醫(yī)學研究重點實驗室，廣西 南寧 530021

扶芳藤為衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬常綠藤本灌木，具有行氣活血、止血化瘀、治腰肌勞損、關節(jié)酸痛、月經(jīng)不調及創(chuàng)傷出血等功效[1]。黃酮類、三萜、兒茶素類、多糖為扶芳藤主要成分[2-4]，查閱相關文獻，發(fā)現(xiàn)關于扶芳藤總三萜的相關研究比較少。研究發(fā)現(xiàn)，機體許多重要的生物大分子—核酸、蛋白質和脂質等易被具有強氧化反應能力的自由基氧化損傷，導致機體損傷，且不可逆轉[5]。在細胞衰老過程中，機體內(nèi)抗氧化能力隨機體活性氧自由基的升高而減弱，線粒體、脂肪酸受外界環(huán)境刺激可產(chǎn)生過氧化氫、超氧陰離子等各種過氧化因子，觸發(fā)過氧化反應，誘導細胞內(nèi)物質發(fā)生過氧化，引起細胞凋亡，加速衰老進程[6]。2017年9月至2018年4月，本研究觀察了扶芳藤總三萜對D-半乳糖誘導衰老小鼠血清及各組織中總抗氧化能力(T-AOC)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)等抗氧化指標的影響，為探討其抗氧化作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：健康清潔級雄性昆明小鼠75只，體質量20~23 g，周齡6~7周，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供(許可證號SCXK-桂2014-0002)。(2)主要試劑：扶芳藤總三萜由本實驗室取莖葉制備，純度≥64.5%，所用扶芳藤原料購自廣西中醫(yī)藥公司，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學韋松基教授定為衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬植物扶芳藤。過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)檢測試劑盒、總抗氧化(T-AOC)檢測試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司，D-半乳糖(0.2 mg/mL，純度＞99%)購于北京索萊寶科技有限公司，黃芪多糖(純度≥50%)購于西安錦鴻生物科技有限公司，其他試劑均為市售分析純。(3)主要儀器：美國BioTek公司EPOCH2型紫外可見分光光度計，德國Hettich公司Mikro220R型離心機。

1.2 建模及分組處理 選擇雄性昆明小鼠75只，室溫(26±1)℃、晝夜各12 h、常規(guī)飼料適應性喂養(yǎng)1周。將小鼠按單純隨機抽樣法分為對照組、模型組、扶芳藤總三萜高、低劑量組及黃芪多糖組，每組15 只。除對照組外其余4 組均建立衰老模型，即按照小鼠重量于頸背部皮下注射D-半乳糖溶液0.25 mL/10 g，對照組注射等量生理鹽水，連續(xù)14 d。配制扶芳藤總三萜高、低劑量溶液及黃芪多糖溶液，濃度分別為2.1 mg/mL、1.7 mg/mL、8.0 mg/mL。建模第15 天，扶芳藤總三萜高、低劑量組及黃芪多糖組按體質量分別給予扶芳藤總三萜高、低劑量溶液及黃芪多糖溶液0.25 mL/10 g灌胃，模型組和對照組均給予等量純水灌胃，連續(xù)35 d。

1.3 血清T-AOC、GSH-Px水平檢測 采用灌胃給藥第49天，經(jīng)75%乙醇消毒后，摘取眼球。收集眼球血1 mL于離心管中，室溫條件放置20 min，3 500 r/min離心10 min，取上清液，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?T-AOC、GSH-Px 活性均采用酶法檢測，并嚴格按照試劑盒操作步驟說明書進行操作。

1.4 心臟、肝臟、骨骼肌組織中T-AOC、CAT、GSH-Px 表達檢測 各組摘取眼球后采用頸椎脫臼法處死小鼠，迅速取心臟、肝臟、腓腸肌處骨骼肌組織，用預冷的生理鹽水沖洗2 次，濾紙拭干。將組織剪碎后，加入預冷的生理鹽水，冰上制成10%組織勻漿。2 500 r/min離心10 min，取上清液，置于-20 ℃保存待用。 T-AOC、CAT、GSH-Px 活性采用酶法檢測,并嚴格按照試劑盒操作步驟說明書進行操作。蛋白質含量采用考馬斯亮蘭法測定，以紫外可見分光光度計于595 nm波長處測定吸光度，空白對照為蒸餾水，以吸光度為縱坐標，蛋白質濃度為橫坐標繪制標準曲線，求得線性回歸方程y=2.039 7x－0.000 8，R2=0.996 2。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS23.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料呈正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差(x-±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組血清中T-AOC、GSH-Px 水平比較 由表1可知，與對照組比較，低劑量組及黃芪多糖組血清中的T-AOC水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，低劑量組及黃芪多糖組血清中的T-AOC水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與高劑量組比較，黃芪多糖組血清中的T-AOC 水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組血清中的GSH-Px 水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，黃芪多糖組血清中的GSH-Px水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，高、低劑量組及黃芪多糖組血清中的GSH-Px 水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與高劑量組比較，黃芪多糖組血清中的GSH-Px 水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高、低劑量組血清中T-AOC、GSH-Px水平整體低于黃芪多糖組，其中低劑量組血清中T-AOC、GSH-Px水平整體高于扶芳藤總三萜高劑量組。

images/BZ_13_207_686_1207_719.png組別對照組模型組扶芳藤總三萜低劑量組扶芳藤總三萜高劑量組黃芪多糖組F值P值只數(shù)15 15 15 15 15 T-AOC(U/mL)7.82±2.51 3.78±0.82 13.94±5.17ab 8.38±1.92 15.61±8.58abd 8.019<0.01 GSH-Px(U/mL)46.52±23.27 12.75±5.19a 81.66±37.09b 49.28±39.59b 87.59±40.90abc 7.738<0.01注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與扶芳藤總三萜低劑量組比較，cP<0.05；與扶芳藤總三萜高劑量組比較，dP<0.05。

2.2 各組心臟組織中T-AOC、CAT、GSH-Px 水平比較 由表2 可知，與對照組比較，模型組心臟組織中T-AOC 水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，高、低劑量組心臟組織中T-AOC 水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，高、低劑量組及黃芪多糖組心臟組織中T-AOC 水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與高劑量組比較，黃芪多糖組心臟組織中T-AOC 水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組心臟組織中CAT 水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，高劑量組及黃芪多糖組心臟組織中CAT 水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，高、低劑量組及黃芪多糖組心臟組織中CAT 水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與低劑量組比較，黃芪多糖組及高劑量組心臟組織中CAT 水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組心臟組織中GSH-Px 水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，高、低劑量組及黃芪多糖組心臟組織中GSH-Px 水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高劑量組心臟組織中T-AOC、CAT、GSH-Px 整體水平高于黃芪多糖組及低劑量組。

表2 各組心臟組織中T-AOC、CAT、GSH-Px水平比較)

表2 各組心臟組織中T-AOC、CAT、GSH-Px水平比較)

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與扶芳藤總三萜低劑量組比較，cP<0.05；與扶芳藤總三萜高劑量組比較，dP<0.05。

組別對照組模型組扶芳藤總三萜低劑量組扶芳藤總三萜高劑量組黃芪多糖組F值P值只數(shù)15 15 15 15 15 T-AOC(U/mg)48.43±11.68 31.41±6.14a 66.21±12.93ab 69.14±11.59ab 55.59±18.44bd 10.642<0.01 CAT(U/mg)57.82±23.28 38.80±14.32a 57.87±17.03b 86.93±19.55abc 78.98±16.69abc 7.695<0.01 GSH-Px(U/mg)619.40±297.65 258.14±78.54a 1 025.37±606.30b 1 007.55±641.67b 801.11±350.91b 4.956<0.01

2.3 各組肝臟組織中T-AOC、CAT、GSH-Px水平比較 由表3可知，與對照組比較，模型組肝臟組織中T-AOC水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，高、低劑量組及黃芪多糖組肝臟組織中T-AOC 水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組肝臟組織中CAT 水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高劑量組肝臟組織中CAT 水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，高、低劑量組及黃芪多糖組肝臟組織中CAT水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與高劑量組比較，黃芪多糖組肝臟組織中CAT水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組肝臟組織中GSH-Px水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),高劑量組肝臟組織中GSH-Px 水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，高、低劑量組及黃芪多糖組肝臟組織中GSH-Px 水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與低劑量組比較，高劑量組肝臟組織中GSH-Px 水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與高劑量組比較，黃芪多糖組肝臟組織中GSH-Px 水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高劑量組肝臟組織中T-AOC、CAT、GSH-Px 水平整體高于黃芪多糖組及低劑量組。

表3 各組肝臟組織中T-AOC、CAT、GSH-Px水平比較

表3 各組肝臟組織中T-AOC、CAT、GSH-Px水平比較

組別對照組模型組扶芳藤總三萜低劑量組扶芳藤總三萜高劑量組黃芪多糖組F值P值只數(shù)15 15 15 15 15 T-AOC(U/mg)48.89±16.63 31.25±8.95a 53.12±15.01b 58.51±13.59b 53.88±19.28b 4.361<0.01 CAT(U/mg)377.27±15.52 314.25±17.23a 407.93±22.78b 427.13±35.56ab 385.29±26.82bd 25.050<0.01 GSH-Px(U/mg)2 864.08±348.37 2 214.16±187.25a 3 153.94±559.59b 3 682.64±571.14abc 3 159.91±453.22bd 11.660<0.01images/BZ_13_207_3244_2086_3278.png

2.4 各組骨骼肌組織中T-AOC、CAT、GSH-Px水平比較 由表4可知，與對照組比較，模型組骨骼肌組織中T-AOC 水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，高、低劑量組及黃芪多糖組骨骼肌組織中T-AOC水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，高、低劑量組及黃芪多糖組骨骼肌組織中T-AOC水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組骨骼肌組織中CAT水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，高劑量組骨骼肌組織中CAT水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，高、低劑量組及黃芪多糖組骨骼肌組織中CAT水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組骨骼肌組織中GSH-Px 水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，黃芪多糖組及高劑量組骨骼肌組織中GSH-Px水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，高、低劑量組及黃芪多糖組骨骼肌組織中GSH-Px水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高劑量組骨骼肌組織中T-AOC、CAT水平高于黃芪多糖組及低劑量組，高、低劑量組骨骼肌組織中GSH-Px水平均低于黃芪多糖組。

表4 各組骨骼肌組織中T-AOC、CAT、GSH-Px水平比較(

表4 各組骨骼肌組織中T-AOC、CAT、GSH-Px水平比較(

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與扶芳藤總三萜低劑量組比較，cP<0.05；與扶芳藤總三萜高劑量組比較，dP<0.05。

組別對照組模型組扶芳藤總三萜低劑量組扶芳藤總三萜高劑量組黃芪多糖組F值P值只數(shù)15 15 15 15 15 T-AOC(U/mg)16.56±4.57 12.58±3.58a 21.49±5.82ab 22.66±6.97ab 21.31±5.31ab 5.805<0.01 CAT(U/mg)60.94±16.50 44.41±14.50a 81.24±24.46b 89.73±37.31ab 67.92±36.09b 3.248<0.05 GSH-Px(U/mg)1 481.86±420.03 1 157.51±308.14a 1 814.51±343.82b 1 854.44±302.47ab 1 940.30±919.66ab 2.637<0.05

3 討論

三萜類化合物是一類具有抗腫瘤、抗病毒、鎮(zhèn)靜、抗菌、抗炎等多種功效的重要天然抗氧化活性物質[7-9]。研究發(fā)現(xiàn)，大量自由基可損傷DNA 和生物膜，破壞免疫系統(tǒng)功能，與腎結石、白血病、腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切關系[10-12]。學者發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖劑量增加可使脾脂褐素顆粒的凝聚力與分布減少，且黃芪多糖不僅可抑制與衰老相關的β-半乳糖甘酶(SAβ-gal)表達，還可降低SAβ-gal的活性[13-15]。因此，本研究選擇黃芪多糖作為抗衰老藥物的對照。

研究表明，生物在其生理過程中產(chǎn)生的氧化自由基與疾病的產(chǎn)生及生物病變有著最直接的關系[16]。機體對自由基的清除能力可通過抗氧化指標T-AOC、CAT 及GSH-Px 體現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，細胞外自由基的清除反應及機體體內(nèi)抗氧化劑之間的相互協(xié)作可通過T-AOC 的強弱反映，且機體的健康、衰老及疾病等也可通過T-AOC的強弱反映，因此T-AOC是衡量生物機體內(nèi)抗氧化能力的最優(yōu)指標之一[17-18]，陳鷺穎等[19]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病、原發(fā)性及腎性高血壓患者檢測血漿中T-AOC 水平均低于健康組。CAT 是一種存在于紅細胞及某些組織細胞的微粒體中的酶，其成分鐵卟啉可使超氧化物歧化酶催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應，繼而使過氧化氫分解成水和氧分子，使機體免受自由基損傷[20]，李彬先等[21]研究發(fā)現(xiàn)胰腺炎患者血清中CAT升高程度與患者的病情呈平行關系。在機體的抗脂質過氧化過程中，GSH-Px 可阻止機體內(nèi)自由基引起的膜脂質過氧化，清除丙二醛(MDA)及多種過氧化產(chǎn)物，并分解過氧化氫，GSH-Px是重要的過氧化物分解酶[22]。白桂芹等[23]研究發(fā)現(xiàn)，肝細胞被乙型、丙型肝炎病毒感染后，硒蛋白GSH-Px表達改變，并與硒結合蛋白相互作用，使脂質過氧化作用被干擾，引起病毒性肝炎。

通過皮下注射D-半乳糖，小鼠細胞代謝紊亂[24]，不僅導致肝、腦、脾臟和胸腺等器官衰退[25-26]，還引發(fā)血液、心肌和骨骼肌等組織的病理改變[27-28]，這一過程與機體的自然衰老過程相似，因此可通過檢測衰老模型小鼠血清、心臟、肝臟及骨骼肌等組織抗氧化指標的變化進行抗衰老研究。本研究結果顯示，與對照組T-AOC、CAT、GSH-Px 水平比較，除小鼠血清模型組T-AOC水平降低，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)外，小鼠血清模型組GSH-Px水平及小鼠心臟、肝臟、骨骼肌組織模型組T-AOC、CAT、GSH-Px 水平均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明建模成功。該模型結果穩(wěn)定，具有價格低廉、簡單易行和成模時間短等優(yōu)點，是衰老研究中常用的一種動物模型[29]。本研究中血清CAT 數(shù)值誤差偏大，因操作中時間誤差及室內(nèi)溫度變化引起，后經(jīng)討論決定舍棄。本研究結果發(fā)現(xiàn)，扶芳藤總三萜可升高衰老小鼠機體的T-AOC、CAT、GSH-Px 水平，其中扶芳藤總三萜低劑量組血清中T-AOC、GSH-Px 水平高于扶芳藤總三萜高劑量組，而扶芳藤總三萜高劑量組心臟、肝臟、骨骼肌組織中T-AOC、CAT、GSH-Px 水平整體又高于扶芳藤總三萜低劑量組，經(jīng)討論分析出現(xiàn)該現(xiàn)象與扶芳藤總三萜純度較低、其他成分影響及扶芳藤總三萜在血清和不同組織中的量效關系不同有關。

綜上所述，扶芳藤總三萜可提高衰老小鼠模型的T-AOC、CAT、GSH-Px水平，從而增強小鼠機體的抗氧化能力。本研究可為扶芳藤資源的進一步開發(fā)和利用提供參考。