許桂丹　肖樹榮　韋武均　彭彬　農(nóng)順強(qiáng)　鄧益斌

【摘要】 目的 針對HBV C編碼鏈設(shè)計(jì)合成反基因鎖核酸（locked nucleic acid，LNA）片段，以HepG2.2.15細(xì)胞為研究對象，篩選并鑒定出能特異性阻斷HBV復(fù)制和表達(dá)的有效治療靶點(diǎn)藥物。

方法 利用RNAstructure 5.0軟件針對HBV C區(qū)編碼鏈1914～1928 nt、1969～1983 nt、2002～2016 nt、2053～2067 nt、2069～2073 nt、2162～2176 nt和2404～2418 nt位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成7條反基因LNA片段（分別以SQ1～SQ7表示），以陽離子脂質(zhì)體lipofectamine 3000（lipo3000）介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，隔3天對應(yīng)給藥，連續(xù)給藥3次，分別于給藥后第3、6、9 天收集培養(yǎng)上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測HBeAg水平;實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（FQPCR）測定HBVDNA濃度。

結(jié)果 針對HBV C區(qū)編碼鏈2162～2176 nt（SQ6）和2404～2418 nt（SQ7）位點(diǎn)的反基因LNA片段對HBVDNA復(fù)制和HBeAg表達(dá)的抑制效果最明顯，用藥后第3、6、9天，SQ6對HBeAg的平均抑制率分別為43.91%、59.95%和59.07%，HBVDNA則分別為42.91%、50.09%和51.14%;SQ7對HBeAg的平均抑制率分別為44.18%、60.81%和60.02%，HBVDNA則分別為47.28%、54.16%和52.22%。

結(jié)論 針對HBV C區(qū)編碼鏈2162～2176 nt和2404～2418 nt位點(diǎn)的反基因LNA片段體外能有效抑制HBV的復(fù)制和表達(dá)，為抗HBV治療提供一定的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 乙型肝炎;乙型肝炎病毒;鎖核酸;基因治療

中圖分類號：R512.6+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.3969/j.issn.10031383.2020.01.003

【Abstract】 Objective Antigene locked nucleic acid（LNA） fragment were designed and synthesized for the HBV C coding chain.HepG2.2.15 cells were used as the research object to screen and identify effective therapeutic target drugs that could specifically block HBV replication and expression.

Methods Using RNAstructure 5.0 software to design and synthesize 7 HBV C region coding strands 1914～1928 nt，1969～1983 nt，2002～2016 nt，2053～2067 nt，2069～2073 nt，2162～2176 nt and 2404～2418 nt loci.Antigenic LNA fragments（represented by SQ1 to SQ7，respectively） were transfected into HepG2.2.15 cells with cationic liposome lipofectamine 3000（lipo3000），and the corresponding administration was performed every 3 days，the administration was continued 3 times respectively.Culture supernatants were collected on days 3，6，and 9 after administration.HBeAg levels were measured with an enzymelinked immunosorbent assay（ELISA）;HBVDNA concentration was measured by FQPCR.

Results Antigene LNA fragments targeting the 2162 to 2176 nt（SQ6） and 2404 to 2418 nt（SQ7） loci of the HBV C region coding chain have the most significant inhibitory effects on HBVDNA replication and HBeAg expression.The average inhibition rates of SQ6 on HBeAg were 43.91%，59.95%，and 59.07%;the average inhibiton rates on HBVDNA were 42.91%，50.09%，and 51.14%;the average inhibition rates of SQ7 on HBeAg were 44.18%，6081%，and 60.02%;the average inhibition rates on HBVDNA was 47.28%，54.16% and 52.22%，respectively.

Conclusion Antigenic LNA fragments targeting the 2162～2176 nt and 2404～2418 nt sites of the HBV C region coding chain can effectively inhibit HBV replication and expression in vitro，and provide theoretical and experimental support for antiHBV therapy.

【Key words】 Hepatitis B;hepatitis B virus;locked nucleic acid;gene therapy

HBV感染是全球性的健康問題，探索出徹底治愈乙肝的抗HBV特效藥一直是乙肝相關(guān)研究的熱點(diǎn)[1～2]。近年來，乙肝基因治療引起人們的重視[3～4]，但是目前國內(nèi)外還沒有探索出徹底清除HBV復(fù)制模板cccDNA的藥物。針對HBV各靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的基因藥物抗HBV效果不斷被報(bào)道[5～6]，然而，針對HBV C保守區(qū)的反基因鎖核酸（locked nucleic acid，LNA）片段對HBV復(fù)制和轉(zhuǎn)錄效果國內(nèi)外至今尚未見報(bào)道。本研究利用生物信息學(xué)軟件針對HBV C編碼鏈設(shè)計(jì)反基因藥物7條并進(jìn)行LNA修飾，用lipofectamine 3000（lipo3000）介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（FQPCR）技術(shù)對其潛在的抗HBV活性進(jìn)行驗(yàn)證和篩選，旨在探索出新的抗HBV作用靶標(biāo)，為新型抗病毒靶向藥物的篩選提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 材料

HepG2.2.15細(xì)胞購自上海通派生物細(xì)胞庫，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，2～3天換液1次，5～7天傳代1次。雙向通風(fēng)超凈工作臺（Esco biotech）;CO2培養(yǎng)箱（日本三洋 MCO18AIC）;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、OptiMEM培養(yǎng)基（Gibco）;Lipofectamine 3000（Invitrogen）;乙型肝炎病毒核酸定量測定試劑盒（湖南圣湘生物科技有限公司）;HBeAg診斷試劑盒（珠海麗珠試劑股份有限公司）;7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI）;正、倒置顯微鏡（Leica）。

1.2 方法

1.2.1 HBV C編碼鏈的反基因LNA藥物的設(shè)計(jì)與合成

HepG2.2.15細(xì)胞的HBV基因型為ayw型，利用RNAstructure 5.0軟件，設(shè)計(jì)出互補(bǔ)于HBV C編碼鏈的寡核苷酸片段7條（下文分別以SQ1～SQ7表示），Blast分析序列特征和同源性后，交由上海生物工程技術(shù)有限公司合成、純化并進(jìn)行LNA修飾。見表1。

1.2.2 反基因LNA的給藥處理

1.2.2.1 轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備

將狀態(tài)優(yōu)良的對數(shù)生長期的HepG2.2.15細(xì)胞接種至6孔板中，每個(gè)孔加入1×105 cells/mL細(xì)胞濃度的細(xì)胞懸液2 mL，5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)，細(xì)胞融合至50%～60%時(shí)可開始轉(zhuǎn)染。6孔板先用PBS漂洗2次，以除盡完全培養(yǎng)基，再用OptiMEM培養(yǎng)基潤洗1次。將6孔板的HepG2.2.15細(xì)胞隨機(jī)分成8組，即SQ1～SQ7藥物組和空白對照組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.2.2.2 lipo3000包裹基因藥物的配制

按照5 μg DNA∶7.5 μL lipo3000比例進(jìn)行基因藥物的配制。A液（10 cm2 6孔板一個(gè)孔的量）：基因藥物5 μg放入一個(gè)無菌離心管中，作好標(biāo)記，用OptiMEM補(bǔ)足至125 μL。B液（10 cm2 6孔板一個(gè)孔的量）：lipo3000轉(zhuǎn)染試劑7.5 μL放入一個(gè)無菌離心管中，作好標(biāo)記，用OptiMEM補(bǔ)足至125 μL。以上A液中各加5 μL的P3000，輕輕混勻。在另一個(gè)新的無菌離心管輕輕混合A液B液，作好標(biāo)記，室溫靜置5 min，備用。

1.2.2.3 轉(zhuǎn)染及處理

將配制好的藥物對應(yīng)加入上述備好的6孔板中，并用OptiMEM補(bǔ)足至2 mL，作好標(biāo)記，5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)6 h后，換正常完全細(xì)胞培養(yǎng)液。隔3天收集培養(yǎng)上清液后再次給藥，連續(xù)給藥3次，連續(xù)收集培養(yǎng)上清液3次。

1.2.3 培養(yǎng)上清液HBeAg的測定

采用ELISA方法檢測，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀于450 nm波長處讀取OD值。

1.2.4 培養(yǎng)上清液HBVDNA的測定

（1）試劑盒中各組分室溫平衡后，混勻備用。（2）根據(jù)待測培養(yǎng)上清液、陽性對照、陰性對照以及定量參考品A～D總數(shù)量，按[（反應(yīng)液38 μL+酶混合液2 μL+內(nèi)標(biāo)0.2 μL）/每人份]的比例取相應(yīng)量的反應(yīng)液、酶混合液及內(nèi)標(biāo)，充分混勻成PCR混合液，瞬時(shí)離心后備用。（3）PCR反應(yīng)管中加入5 μL核酸釋放劑，加入5 μL待測培養(yǎng)上清液，用槍頭吹打5下，靜置10 min（陰性對照、陽性對照以及定量參考品A～D同步處理）。（4）每管加入40 μL PCR混合液，蓋上管蓋（可用手指彈擊，去除氣泡），2000 rpm離心30 s。（5）PCR擴(kuò)增：將擴(kuò)增管放入ABI7500PCR儀中，循環(huán)條件如下：50℃ 2 min，94℃ 5 min;[94℃ 15 s→57℃ 31 s] 45cycles;25℃10 s。判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效后由計(jì)算機(jī)軟件根據(jù)定量參考品和樣本的熒光信號自動(dòng)計(jì)算出HBVDNA含量。并按以下公式計(jì)算HBVDNA抑制率：抑制率=[（n空白組-n實(shí)驗(yàn)組）/n空白組]×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，并根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果采用SNKq檢驗(yàn)進(jìn)行組間對比，組內(nèi)不同給藥時(shí)間的比較采用重復(fù)測量的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 反基因LNA給藥后對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBeAg的影響

加入LNA藥物后，SQ6和SQ7對HBeAg抑制效果最顯著，給藥后第3、6、9天，SQ6對HBeAg的平均抑制率分別為43.91%、59.95%和59.07%，SQ7對HBeAg的平均抑制率分別為44.18%、60.81%和60.02%（見表2及圖1）。

2.2 反基因LNA給藥后對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBVDNA的影響

給藥后，SQ6和SQ7對HBVDNA抑制效果最顯著，給藥后第3、6、9天，SQ6對HBVDNA的平均抑制率分別為42.91%、50.09%和51.14%，SQ7則分別為47.28%、54.16%和52.22%（見表3及圖2）。

3 討論

抗HBV基因治療，包括反義治療、衣殼蛋白靶向滅活、顯性負(fù)性突變體、反基因治療、新型基因編輯等技術(shù)[7]。其中，新型基因編輯等技術(shù)是近幾年的研究熱點(diǎn)，二十幾年的反義治療是比較成熟的技術(shù)[8]，它能顯著抑制HBV復(fù)制，但是反義治療技術(shù)主要針對mRNA，在翻譯水平上阻斷HBV，容易出現(xiàn)停藥“反跳”問題。反基因治療是由外源特定脫氧寡聚核苷酸與病毒雙鏈DNA專一性結(jié)合形成三鏈DNA，從轉(zhuǎn)錄水平上阻斷靶基因的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，與反義治療策略相比，具有從源頭阻斷病毒基因復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的優(yōu)勢。 LNA是核酸研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)，它具有熱穩(wěn)定性和脂溶性好，分子雜交能力和抗核酸酶降解能力強(qiáng)以及細(xì)胞毒性低等優(yōu)勢[9]。

盡管血清型和基因型不同[10]，HBV都是由約3.2 kb組成的具有包膜的部分雙鏈松弛環(huán)狀DNA嗜肝病毒，有P、X、S和C四個(gè)開放讀碼區(qū)，其中，S和C區(qū)序列在各型HBV間是十分保守的，因而是基因治療的理想靶位。S 區(qū)包括前S1基因、前S2基因和S基因，課題組曾做過前S1基因的反基因LNA抗HBV效果研究[11]，也做過S基因一些靶位的體內(nèi)研究[5，12]，結(jié)果證實(shí)前S1基因和S基因抗病毒效果均比較明顯。同樣作為保守區(qū)，C區(qū)包括C基因和前C基因，兩者共同編碼HBeAg和HBcAg，與HBV裝配、成熟和分泌密切相關(guān)[13]，以C區(qū)為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的反義LNA能有效抑制HBV的復(fù)制與表達(dá)[14]，研究也證實(shí)，反基因治療策略比反義治療效果更顯著[5，12]。因此，本研究根據(jù)反基因寡核苷酸的作用原理，設(shè)計(jì)出互補(bǔ)于HBV C編碼鏈的寡核苷酸片段7條，并進(jìn)行LNA修飾，旨在找出新的抗HBV作用靶標(biāo)。由于該細(xì)胞株培養(yǎng)上清液HBV活性鑒定HBeAg和HBVDNA表達(dá)較高，而HBsAg表達(dá)偏低，其具體原因有待進(jìn)一步研究，因此藥效實(shí)驗(yàn)我們選用HBeAg、HBVDNA指標(biāo)來評價(jià)。

lipo3000與lipo2000、XtremeGENE HP和FuGENE HD另外幾種轉(zhuǎn)染試劑相比，具有毒性低、轉(zhuǎn)染高效、經(jīng)濟(jì)效益高的優(yōu)勢[15]。因此本研究選擇lipo3000進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，按照7.5 μL lipo3000∶5 μg DNA的比例進(jìn)行C編碼鏈7個(gè)基因藥物的轉(zhuǎn)染，結(jié)果SQ6和SQ7對HBeAg和HBVDNA的抑制效果最顯著，SQ6用藥后第3、6、9天對HBeAg的平均抑制率分別為43.91%，59.95%和59.07%，SQ7則分別達(dá)44.18%、60.81%和60.02%;SQ6用藥后第3、6、9天對HBVDNA的平均抑制率分別為42.91%、50.09%和51.14%，SQ7則分別為47.28%、54.16%和52.22%。

綜上，針對HBV C區(qū)編碼鏈2162～2176 nt和2404～2418 nt位點(diǎn)的反基因LNA片段在體外能有效抑制HBV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，為抗HBV治療提供一定的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2019-09-06 修回日期：2019-10-11）

（編輯：王琳葵 梁明佩）