李桂榮，沈忱悠，楊振坤，談建新，趙晶晶，鄒 健，聶曉偉，陳靜瑜

肺泡巨噬細(xì)胞是肺組織中的天然免疫細(xì)胞，占肺組織常駐細(xì)胞的85%以上，具有分泌、吞噬、促炎、抗炎和組織修復(fù)的功能，是肺組織的第一道防御[1-4]。多樣性和可塑性是巨噬細(xì)胞的顯著特征，能夠根據(jù)周圍組織微環(huán)境的變化呈現(xiàn)不同的表型。巨噬細(xì)胞表型分類有兩種：一種是經(jīng)典的M1型，表型標(biāo)志蛋白有iNOS、TNF-α、IL-12、IL-6等，是促炎的表型，釋放促炎因子及介質(zhì)，促進(jìn)炎癥的發(fā)展；另一種是可替代性的M2型，表型標(biāo)志蛋白有精氨酸酶1(Arg1)、IL-10、發(fā)現(xiàn)于炎癥分子區(qū)1(FIZZ1)等，是抗炎的表型，能夠釋放抑炎因子及介質(zhì)，促進(jìn)組織的修復(fù)。因此，肺泡巨噬細(xì)胞在肺組織炎癥的生理發(fā)展過程中有關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)作用[5-6]。在巨噬細(xì)胞活化的過程中，一些蛋白分子對其表型有關(guān)鍵的調(diào)控作用，如IRF5蛋白作為干擾素調(diào)節(jié)因子家族的一個重要成員，對炎癥性的巨噬細(xì)胞表型有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。在M2型巨噬細(xì)胞中過表達(dá)IRF5導(dǎo)致M2型轉(zhuǎn)化成M1型，在M1巨噬細(xì)胞中敲掉IRF5巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致M1巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化成M2巨噬細(xì)胞[7]。p38MAPK信號途徑是MAPK信號通路的關(guān)鍵分支之一，參與到細(xì)胞周期、細(xì)胞應(yīng)激以及炎癥等多種病理生理過程。p38MAPK在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平參與到炎癥介質(zhì)的合成，是抗炎治療的靶標(biāo)之一。SB203580能夠特異性地抑制p38MAPK的磷酸化，抑制p38MAPK信號通路。本研究旨在探討SB203580對肺泡巨噬細(xì)胞極化作用的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料：配制SDS-PAGE電泳膠的試劑有30%丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺(30%Acr-Bis)、分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液、過硫酸銨、TEMED以及二抗(HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。抗體如IRF5、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、Arg1購自Abcam公司，內(nèi)參抗體β-actin購自康為世紀(jì)生物公司。熒光二抗、含DAPI染料的防淬滅封片劑購自Invitrogen公司。胎牛血清、胰酶、雙抗，購自BI公司，F(xiàn)-12K培養(yǎng)基購自Thermo公司。肺泡巨噬細(xì)胞NR8383購自復(fù)旦IBS細(xì)胞資源中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 炎癥細(xì)胞模型的建立：從液氮中取出凍存肺泡巨噬細(xì)胞NR8383進(jìn)行復(fù)蘇，用含15%胎牛血清的培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)；細(xì)胞傳至2～3代后鋪6孔板，LPS刺激細(xì)胞，給藥濃度2 μg/mL，形成炎癥細(xì)胞模型；在SB203580抑制劑組，提前30 min給予SB203580，給藥濃度50 μM，然后用LPS刺激。對照組給予與實驗組相同體積的PBS。每個實驗組設(shè)3個平行樣，24 h后，收集細(xì)胞，用于后續(xù)實驗。

1.2.2 Western blot實驗：收集6孔板中的細(xì)胞，每孔給予150 μl 裂解液，置于冰上，裂解10 min，12 000 r/min，4 ℃離心，取上清液，得到裂解的細(xì)胞蛋白溶液。加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min，SDS-PAGE電泳，70 V電壓轉(zhuǎn)膜2 h，5%牛奶室溫封閉1 h，一抗IRF5、iNOS、p-NFκB p65、IκBα及內(nèi)參β-actin分別孵育，4 ℃過夜。TBST洗滌3次后，在室溫孵育HRP標(biāo)記的二抗1.5 h，洗滌后ECL底物發(fā)光顯色。G：Box 凝膠成像系統(tǒng)曝光，采集數(shù)據(jù)，Image J 軟件對條帶進(jìn)行灰度分析，分別計算目標(biāo)蛋白和內(nèi)參蛋白β-actin的灰度值，目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin的比值作為各組實驗依據(jù)。

1.2.3 細(xì)胞免疫熒光實驗：細(xì)胞建模后，收集懸浮的肺泡巨噬細(xì)胞，PBS洗滌后重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度1×106個/mL，取30 μl細(xì)胞懸液滴在載玻片上，風(fēng)干后以4%多聚甲醛固定，用含0.2% TritonX100的PBS洗滌3次，10 min/次，5%的牛奶封閉30 min，在含有1% BSA的PBS溶液中孵育兔源一抗iNOS，4 ℃過夜。PBS洗滌3次，山羊抗兔的熒光二抗Alexa Flour 488室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，含DAPI染料的防淬滅封片劑封片。用萊卡共聚焦顯微鏡拍照。

2 結(jié)果

2.1 SB203580對肺泡巨噬細(xì)胞中IRF5蛋白表達(dá)的影響：Western blot檢測肺泡巨噬細(xì)胞中IRF5蛋白表達(dá)變化，LPS組中 IRF5蛋白與β-actin內(nèi)參蛋白條帶的灰度比值為0.496 3，對照組為0.395 4，SB203580處理組為0.305 7。用LPS刺激后，細(xì)胞中IRF5蛋白表達(dá)增加，蛋白條帶灰度分析與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。給予SB203580后，IRF5蛋白表達(dá)顯著被抑制，蛋白條帶灰度分析結(jié)果顯示，與LPS刺激組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1(目錄后)。

2.2 SB203580對肺泡巨噬細(xì)胞M1表型標(biāo)志蛋白的影響：巨噬細(xì)胞M1表型的標(biāo)志蛋白iNOS在LPS刺激后表達(dá)增加(與內(nèi)參條帶灰度比為0.8185)，與對照組(與內(nèi)參條帶灰度比為0.0832)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；給予抑制劑SB203580處理后(與內(nèi)參條帶灰度比為0.66)iNOS的表達(dá)下降，與LPS刺激組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)胞免疫熒光實驗顯示在LPS處理后，細(xì)胞中iNOS的熒光強度增加；SB203580處理后，細(xì)胞中iNOS的熒光強度減弱。因此，SB203580抑制了肺泡巨噬細(xì)胞NR8383的促炎表型，見圖2(目錄后)。

2.3 SB203580對肺泡巨噬細(xì)胞中NFκB信號通路的影響：LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞后，NFκB信號通路被激活，p-NFκB p65高表達(dá)(與內(nèi)參條帶灰度比為1.222)，與對照組(與內(nèi)參條帶灰度比為0.360 1)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；給予SB203580后，抑制了LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞中NFκB信號通路的激活，p-NFκB p65表達(dá)被抑制(與內(nèi)參條帶灰度比為0.679 7)，與LPS刺激組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

肺泡巨噬細(xì)胞是肺組織常駐細(xì)胞，在肺組織的穩(wěn)態(tài)和各種肺部疾病的免疫防御中發(fā)揮重要的作用，如在急性呼吸窘迫綜合征、慢性阻塞性肺疾病、囊性纖維化等疾病中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[8-9]。多樣性和可塑性是巨噬細(xì)胞的顯著特征，在不同的環(huán)境下，肺泡巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)出不同的表型，即經(jīng)典的M1和可選擇性的M2型，發(fā)揮不同的免疫調(diào)節(jié)作用。IFN-γ，TNF或Toll-like receptor(TLR)的配體刺激巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)M1表型，釋放促炎的因子，加劇組織的損傷；IL-4，IL-13或M-CSF刺激巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)M2型，釋放抗炎的因子，促進(jìn)組織的修復(fù)。不同的微環(huán)境下，巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)不同的表型，同時涉及各種蛋白的過表達(dá)及各種信號通路的激活。本研究在體外的肺泡巨噬細(xì)胞炎癥模型中，給予p38MAPK信號通路的抑制劑SB203580，抑制了肺泡巨噬細(xì)胞的促炎表型；此外，SB203580還抑制了肺泡巨噬細(xì)胞中NFκB信號途徑的激活，這說明在LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞的炎癥表型中，伴隨著NFκB信號途徑的激活。

IRF5是干擾素家族的一個重要成員，表達(dá)在很多細(xì)胞中，如巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞和B細(xì)胞[10]。IRF5在確定M1型炎癥巨噬細(xì)胞中起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，在人單核細(xì)胞和鼠骨髓細(xì)胞分化成炎癥巨噬細(xì)胞期間，IRF5被誘導(dǎo)表達(dá)，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)促炎因子[7，11]。本研究中，LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞NR8383后，IRF5表達(dá)顯著增加，M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白iNOS表達(dá)顯著增加，給予p38MAPK抑制劑SB203580后，IRF5表達(dá)被抑制，iNOS表達(dá)顯著下調(diào)，表明SB203580顯著地抑制了肺泡巨噬細(xì)胞的促炎表型。

NFκB信號途徑被認(rèn)為典型的促進(jìn)炎癥反應(yīng)的信號通路，能夠上調(diào)促進(jìn)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子，趨化因子和黏附分子的表達(dá)，在肺部疾病的炎癥反應(yīng)中有關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)作用[12-13]。在本研究中，LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞炎癥模型中，NFκB信號途徑被激活，p-NFκB p65表達(dá)顯著增加，給予SB203580后，p-NFκB p65表達(dá)下調(diào)，NFκB信號途徑的激活被抑制。SB203580對肺泡巨噬細(xì)胞促炎表型的抑制作用可能依賴于NFκB信號途徑激活。因此，SB203580具有通過抑制體內(nèi)肺泡巨噬細(xì)胞的促炎表型，進(jìn)而抑制細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)炎癥反應(yīng)的NFκB信號通路的激活，達(dá)到治療肺組織炎癥疾病的目的。

總之，SB203580能夠體外抑制誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞的促炎表型，同時也抑制NFκB信號途徑的激活，這為臨床通過抑制肺泡巨噬細(xì)胞的促炎表型降低肺組織炎癥損傷提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。