蘇 晴，陰懷清2，劉文俊，王 婷

新生兒由于其膽紅素代謝的生理特點，加之各種病理因素的綜合作用，未結(jié)合膽紅素增多的高膽紅素血癥在臨床上很常見[1]，嚴重者可能遺留膽紅素腦損害，發(fā)生失聰、軀體運動功能障礙、智能障礙等嚴重后果，同時加重了家庭、社會的負擔(dān)[2]。近年來，研究表明，胰島素樣生長因子-1(IGF-1)是神經(jīng)元結(jié)構(gòu)、功能和可塑性調(diào)節(jié)中的重要因子，在整個生命周期中對維持適當(dāng)?shù)哪X功能起著關(guān)鍵作用[3]。本實驗的目的是建立高膽紅素血癥模型，觀察IGF-1干預(yù)后腦細胞凋亡和Bcl-2和Bax表達的動態(tài)變化，探討IGF-1腦保護的可能機制，為高膽紅素血癥的臨床防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 7 d齡新生SD清潔級大鼠120只(由山西醫(yī)科大學(xué)動物實驗基地提供)，體重12～17 g，雌雄不限，隨機分成對照組(A組)、高膽紅素血癥模型組(B組)和IGF-1干預(yù)組(C組)，每組40只，各組再根據(jù)人工處死大鼠時間(6 h、12 h、24 h、48 h和72 h)分為5個亞組，每個亞組8只。

1.2 膽紅素液體制備[4]在遮光的環(huán)境下，精確稱量膽紅素晶體(購自美國Sigma公司)50 mg，溶于1 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉溶液中，加入9 mL雙蒸水，用0.5 mol/L鹽酸將pH值調(diào)至8.5，濃度為85.5 μmol/L，并于1 h內(nèi)使用。

1.3 造模及干預(yù)方法 造模：B組和C組腹腔內(nèi)注射新鮮配制的膽紅素液100 μg/g，建立高膽紅素血癥模型，A組腹腔內(nèi)注入等體積的膽紅素溶劑。干預(yù)方法：C組于造模后立即腹腔內(nèi)注入IGF-1(購自武漢博士德生物技術(shù)公司)200 μg/g，A組、B組腹腔內(nèi)注入等體積的生理鹽水。給藥后各組動物返回原飼養(yǎng)環(huán)境由母鼠母乳喂養(yǎng)至相應(yīng)時間點[4]。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 行為學(xué)觀察 每組動物在處理后，肉眼觀察不同時刻大鼠的異常行為變化(如尖叫、抽搦、翻騰、俯臥及刺激后是否發(fā)生躲避等)。

1.4.2 病理學(xué)觀察 新生大鼠在模型建立后的不同時間點左心室灌注后(注意留取左心室血液，離心后取上清液，測定血漿中膽紅素濃度，確認高膽紅素血癥模型制備成功)，斷頭取腦，小心解剖獲得完整腦組織，并置于甲醛溶液中保存，常溫條件下，行固定、石蠟包埋(視交叉及其后5 mm，包含海馬區(qū))、冠狀位切片及HE染色，在顯微鏡下檢測模型是否制備成功及大腦海馬部位細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，選擇與蘇木素-伊紅(HE)相鄰切片做免疫組化及TUNEL檢測(由武漢博士德生物技術(shù)公司提供)。免疫組化法：兔Bax和Bcl-2單抗體(一抗)，SABC免疫組化試劑(二抗)，嚴格按照說明書步驟檢測Bax和Bcl-2表達；TUNEL檢測法：嚴格遵守TUNEL試劑盒說明，觀察凋亡的陽性表達及計算凋亡率或凋亡指數(shù)(凋亡細胞個數(shù)/全部細胞個數(shù)×100%)。

1.4.3 圖像處理 應(yīng)用美國Aperio公司Scanscope數(shù)字病理掃描系統(tǒng)，對每張腦組織病理切片任意選取4個視野進行掃描、取圖和分析。由計算機檢測大腦海馬部位細胞Bcl-2和Bax表達的灰度值，取其均數(shù)，并計算其OD值(OD值=logA/B，其中A=240，B為灰度值)。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)行為改變 A組新生大鼠無異常神經(jīng)行為變化，B組造模后8 h左右出現(xiàn)明顯異常行為表現(xiàn)，如尖叫、抽搦、翻騰、俯臥及刺激后躲避遲緩等，C組約12 h出現(xiàn)上述變化，但異常表現(xiàn)不如B組明顯。

2.2 HE染色 A組大腦海馬部位細胞形態(tài)正常，排列規(guī)則，細胞核清晰可見，無細胞缺失；B組、C組均見大腦海馬部位細胞變少、變形，結(jié)構(gòu)混亂，細胞核縮小、溶解、破碎，符合凋亡的形態(tài)改變，但與C組同一時刻比較，B組的變化更為明顯。詳見圖1。

圖1 各組大鼠海馬區(qū)腦組織病理圖(HE×400)

2.3 Bax表達變化 陽性表達Bax的細胞胞質(zhì)或胞核被棕黃色染色，A組Bax陽性表達較少，B組Bax表達于6 h開始逐漸增多，48 h繼續(xù)增高，72 h表達處于高峰；C組Bax表達明顯較同時間B組減少，但仍高于同時間A組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1、圖2。

組別6 h 12 h 24 h 48 h72 hA組161.743±0.698161.901±0.847 161.662±0.977161.862±0.784161.141±0.729B組154.884±0.313①154.205±0.623① 153.905±0.562①153.585±0.437①153.485±0.437①C組 159.562±0.414①② 158.674±0.397①② 158.570±0.392①② 157.605±0.484①② 157.306±0.310①②F值243.433 177.284 160.444 246.926269.421P <0.05<0.05 <0.05 <0.05 <0.05

與A組比較，①P<0.05；與B組比較，②P<0.05。

圖2 各組大鼠腦組織不同時間Bax表達情況(DAB×400)

2.4 Bcl-2表達變化 細胞中有Bcl-2陽性表達時，其胞質(zhì)或胞膜呈棕黃色染色，A組Bcl-2陽性表達極少；B組Bcl-2表達于6 h開始加強，后逐漸加強，48 h達到峰值，72 h處于恒定高值； C組Bcl-2表達明顯較同時間A組、B組增多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2、圖3。

組別6 h12 h24 h48 h 72 hA組 161.763±0.688 161.902±0.772 161.862±0.771 161.662±0.507 161.482±0.537B組 159.642±0.335① 158.674±0.397①158.630±0.363① 158.005±0.535① 157.626±0.636①C組 154.884±0.313①② 154.310±0.406①② 154.105±0.481①② 153.785±0.465①② 153.625±0.402①②F值265.401 236.905 237.844 306.603 270.852P <0.05<0.05 <0.05 <0.05 <0.05

與A組比較，①P<0.05；與B組比較，②P<0.05。

圖3 各組大鼠腦組織不同時間Bcl-2表達情況(DAB×400)

2.5 大腦海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡 A組大腦海馬區(qū)極少細胞凋亡，B組6 h后可見大腦海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡，12～24 h增加，48 h明顯增加，72 h達到峰值，C組各時間大腦海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡較B組少，但仍高于A組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3、圖4。

組別 6 h12 h24 h48 h 72 hA組 1.067±0.711 1.075±0.7211.087±0.725 1.087±0.724 1.089±0.729B組 6.505±0.589① 9.951±0.615① 11.361±0.425① 12.943±0.603①14.723±0.371①C組 3.794±0.787①② 6.441±0.589①② 9.216±0.694①② 9.765±0.468①② 12.578±1.489①②F值60.268192.497296.842407.884223.907P <0.05 <0.05<0.05 <0.05<0.05

與A組比較，①P<0.05；與B組比較，②P<0.05。

圖4 各組大鼠腦組織海馬區(qū)不同時間點神經(jīng)細胞凋亡情況

3 討 論

高膽紅素血癥動物模型有多種制備方法，本實驗選擇最常用的腹腔注射膽紅素的方法制備模型，操作簡易，成功率高[4]。7 d齡新生大鼠腦組織和新生兒腦組織的發(fā)育在組織學(xué)方面相似[5]，發(fā)育不完善的血-腦屏障是血中游離膽紅素增高易致膽紅素腦損害的重要因素[6]，因此，本研究選擇7 d齡新生SD大鼠制備高膽紅素血癥疾病模型。

高膽紅素血癥腦損害的具體機制錯綜復(fù)雜，但研究證明膽紅素對腦的損傷是有選擇性的，并且海馬區(qū)、下丘及大腦皮質(zhì)對膽紅素表現(xiàn)出了特殊的敏感性，膽紅素神經(jīng)細胞毒性的發(fā)揮可能是在質(zhì)膜擾動、興奮毒性、神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激和細胞周期阻滯等多因素的聯(lián)合作用下，最終導(dǎo)致了細胞凋亡[7]。在分離的腦細胞培養(yǎng)中可以觀察到，在游離膽紅素作用下，神經(jīng)元樹突受到損害同時小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞被誘導(dǎo)釋放促炎性細胞因子[8]。

凋亡是復(fù)雜基因控制下維持存活/死亡平衡的編程性細胞死亡[9]，在維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中有重要意義，發(fā)現(xiàn)凋亡的具體機制對于探索疾病防治方法有重要價值。通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，Bcl-2家系在凋亡的信號調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，包括對抗凋亡基因(Bcl-2為代表)和促進凋亡基因(Bax為代表)，對抗凋亡的基因與促進凋亡的基因的相對數(shù)量(尤其是Bcl-2/Bax比率)組成了凋亡的分子開關(guān)，其結(jié)構(gòu)多樣，功能復(fù)雜，至今仍未完全揭秘[10-11]。在本實驗中，人工制作高膽紅素血癥動物模型，觀察隨時間推移Bcl-2和Bax表達的變化，揭示膽紅素的神經(jīng)損害作用，在模型組中可以看到：Bcl-2表達早期開始增加，48 h增加至高峰，72 h處于平穩(wěn)；與此同時，Bax的表達是增加的，于72 h達高峰，Bcl-2/Bax比率降低，TUNEL法測定的凋亡指數(shù)逐漸增加，于72 h達高峰，這進一步證實了Bcl-2對抗凋亡及Bax促進凋亡的作用。

IGF-1是一種多肽類營養(yǎng)神經(jīng)的物質(zhì)，與胰島素的分子結(jié)構(gòu)相似，可調(diào)節(jié)細胞的生長和分化，維護腦組織的正常功能[12]。IGF-1還可抑制凋亡，有助于受損組織功能的復(fù)原。劉芳等[13]研究發(fā)現(xiàn)，新生兒發(fā)生高膽紅素血癥時血清IGF-1濃度下降，且降低程度和血清膽紅素水平成反比；尹路等[14]研究顯示，36名第1天出生的早產(chǎn)兒IGF-1水平與所需光療時間成反比，表明IGF-1水平與機體對膽紅素的處理能力相關(guān)。在本實驗中，在動物模型中應(yīng)用IGF-1干預(yù)后，與模型組相比，各時間細胞凋亡減少， Bcl-2表達增加，Bax表達降低，這說明IGF-1可能通過增高Bcl-2的表達，降低Bax的表達發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用，但是具體的機制還有待進一步研究。

綜上所述，本實驗觀察到高膽紅素血癥新生大鼠大腦中，隨時間推移Bcl-2、Bax表達和凋亡的關(guān)系，而神經(jīng)細胞營養(yǎng)因子IGF-1，可能通過增高Bcl-2的表達、降低Bax的表達而抑制受損腦組織的凋亡，發(fā)揮腦保護作用。這為IGF-1在臨床中防治新生兒高膽紅素血癥應(yīng)用的可能性提供了新的思路，但尚需國內(nèi)外大量研究和臨床試驗的支持。