莫金鋼 張碩 李海峰 宋凱

摘? ?要：為了研究大蒜提取液拮抗納米金對蠶豆根尖細(xì)胞的遺傳毒性效應(yīng)，以100 μg/mL納米金溶液對蠶豆根尖進(jìn)行染毒處理，分別以濃度為0～1 g/mL的大蒜提取液作為拮抗效應(yīng)物。利用蠶豆根尖細(xì)胞微核檢測技術(shù)，研究不同濃度大蒜對納米金處理下蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂行為的影響。試驗結(jié)果表明，納米金具有一定的遺傳毒性，且隨著大蒜提取液濃度的不斷增加，蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)、微核率和染色體畸變率均呈現(xiàn)顯著減少的趨勢（P<0.05），表明大蒜提取液對納米金引起的蠶豆根尖細(xì)胞毒害作用具有一定的拮抗作用，且最適拮抗?jié)舛葹?.25 g/mL。同時，試驗結(jié)果還表明，高濃度的大蒜提取液對蠶豆根尖細(xì)胞的有絲分裂具有一定的抑制作用。

關(guān)鍵詞：大蒜;納米金;蠶豆根尖細(xì)胞微核;拮抗作用

納米材料是指在材料的三維立體結(jié)構(gòu)中，任何一維達(dá)到納米級的尺寸（1～100 nm）或由它們組成的物質(zhì)，其大小介于原子簇與宏觀物體的尺寸之間。由于納米材料具有化學(xué)活性高、吸附能力強(qiáng)等獨(dú)特的理化特性，已作為一種新興的材料廣泛應(yīng)用于人們生活的各個領(lǐng)域[1]，因此，納米材料在生產(chǎn)、運(yùn)輸、使用和回收處理等環(huán)節(jié)被有意或無意地釋放到環(huán)境中。研究表明，納米材料可與植物組織相互作用產(chǎn)生生物毒性[2]。

納米金是利用物理、化學(xué)或生物技術(shù)合成的金的超微顆粒，因其具有較高的電子密度、良好的生物相容性、優(yōu)異的催化作用和獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，而被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)[3]、免疫檢測[4]等多個領(lǐng)域。然而，眾多研究表明，納米金具有一定的生物毒性效應(yīng)，可誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡。

蠶豆根尖細(xì)胞微核試驗是一種具有代表性的體外遺傳毒性檢測方法，早在1986年就已被我國環(huán)境保護(hù)總局編入《生物監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》（水環(huán)境部分），已在全國水質(zhì)監(jiān)測中推廣應(yīng)用。

本研究以納米金為誘變劑，利用蠶豆根尖細(xì)胞微核檢測技術(shù)檢測不同濃度大蒜提取液對納米金處理下蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂行為的影響，為納米金毒性效應(yīng)研究提供試驗依據(jù)。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗材料與試劑

納米金（長春師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生態(tài)學(xué)實(shí)驗室提供，濃度為400 μg/mL）。大蒜和蠶豆均選用市售2018年新種優(yōu)質(zhì)大蒜和青皮蠶豆;鹽酸、乙醇、改良苯酚品紅染液等試劑均為國產(chǎn)分析純或生化試劑。

1.2? ?試驗方法

1.2.1? ?納米金的制備

采用檸檬酸三鈉還原氯金酸的方法制備納米金顆粒溶液。取48 mL去離子水和1%氯金酸溶液2 mL置于燒杯中，攪拌并加熱至沸騰，加入5%檸檬酸三鈉溶液1 mL，快速攪拌至溶液變?yōu)榉€(wěn)定的酒紅色，得濃度為400 μg/mL的納米金溶液。

1.2.2? ?大蒜提取液的制備

準(zhǔn)確稱量大蒜160 g，加入去離子水80 mL。用組織搗碎機(jī)將大蒜充分搗碎得到大蒜粗提取液，經(jīng)抽濾后得到濃度為2 g/mL的大蒜提取液。

1.2.3? ?蠶豆根尖細(xì)胞微核試驗

參見莫金鋼等的方法稍作改進(jìn)。蒸餾水浸泡青皮蠶豆后催根，待蠶豆根尖長到1.5 cm 左右時開始處理，試驗組共分5個處理組，蠶豆根尖細(xì)胞微核誘變劑均為100 μg/mL納米金溶液，大蒜提取液濃度分別為0 g/mL、0.05 g/mL、0.25 g/mL、0.5 g/mL、1 g/mL，設(shè)3次重復(fù)。各組處理24 h后轉(zhuǎn)移至去離子水中恢復(fù)培養(yǎng)24 h。剪取1.5 cm 左右的蠶豆根尖，并用新配制的卡諾固定液固定24 h后轉(zhuǎn)移至70%乙醇溶液中保存。鏡檢時采用6 mol/L 的鹽酸溶液室溫水解10 min，改良苯酚品紅染液染色15 min，常規(guī)壓片后光學(xué)顯微鏡下鏡檢，每個根尖觀察不少于1 000個細(xì)胞。

1.3? ?數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和作圖，SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。并根據(jù)下式計算平均有絲分裂指數(shù)、微核率及染色體畸變率。

有絲分裂指數(shù)（%）=（分裂期細(xì)胞數(shù) / 觀察的細(xì)胞總數(shù)）×100

微核率（‰） = （含有微核的細(xì)胞數(shù)/觀察的細(xì)胞總數(shù)）×1 000

染色體畸變率（‰） = （含有畸變?nèi)旧w的細(xì)胞數(shù)/觀察的細(xì)胞總數(shù)）×1 000。

2? ?結(jié)果與分析

相關(guān)結(jié)果見圖1～圖3。

2.1? ?大蒜拮抗下納米金對蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)的影響

由圖1可以看出，隨著大蒜提取液濃度的不斷升高，蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，各處理組有絲分裂指數(shù)均顯著低于對照組（P<0.05）。表明隨著大蒜提取液濃度的升高，蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂受到的抑制作用不斷加強(qiáng)。當(dāng)大蒜提取液濃度高于0.05 g/mL時，處理組間未達(dá)到顯著性差異（P>0.05）。

2.2? ?大蒜拮抗對納米金引起蠶豆根尖細(xì)胞微核率的影響

由圖2可以看出，隨著大蒜提取液濃度的升高，蠶豆根尖細(xì)胞微核率呈現(xiàn)先下降再升高然后再下降的趨勢，且加入大蒜提取液處理組的微核率均顯著低于未加入大蒜提取液的處理組（P<0.05），且當(dāng)大蒜提取液濃度為0.25 mg/L時，蠶豆根尖細(xì)胞微核率的值較低。

2.3? ?大蒜拮抗對納米金引起蠶豆根尖細(xì)胞染色體畸變率的影響

由圖3可以看出，隨著大蒜提取液濃度的升高，蠶豆根尖細(xì)胞染色體畸變率呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，且加入大蒜提取液處理組的染色體畸變率均顯著低于未加入大蒜提取液的金納米溶液處理組（P<0.05），且當(dāng)大蒜提取液濃度高于0.05 g/mL 時，處理組間未達(dá)到顯著性差異（P>0.05）。

由此可以看出，隨著大蒜提取液濃度的升高，會導(dǎo)致納米金引發(fā)的蠶豆根尖細(xì)胞染色體的畸變率逐漸下降，表明大蒜對納米金的遺傳毒性具有拮抗作用。

3? ?結(jié)論

當(dāng)納米金溶液的濃度達(dá)到100 μg/mL時，具有很強(qiáng)的生物毒性，可以破壞細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，使細(xì)胞產(chǎn)生微核，并且可以使大蒜根尖細(xì)胞分裂異常，所以在納米金的生產(chǎn)、運(yùn)輸、使用或回收的過程中，應(yīng)該嚴(yán)格控制納米金向環(huán)境中的排放量。

大蒜對納米金遺傳毒性的拮抗作用十分明顯，其最佳拮抗?jié)舛葹?.25 g/mL，且大蒜具有抑制蠶豆根尖細(xì)胞分裂的作用，大蒜提取液的濃度越高，抑制效果越明顯。這可能與大蒜的功能性成分蒜氨酸有關(guān)，也可能與大蒜富含硒元素有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[ 1 ] 苗令占，王沛芳，侯俊，等.金屬納米材料對不同微生物聚集體的毒性研究進(jìn)展[J]. 水資源保護(hù)，2019，35（1）：73-78.

[ 2 ] 施夏明，高超，喬寧寧，等.納米金對綠豆種子萌發(fā)和幼苗生長的影響及其生理機(jī)制[J].生態(tài)學(xué)雜志，2019，38（4）：945-952.

[ 3 ] Xiaoying Z.Gold Nanoparticles：Recent Advances in theBiomedical Applications[J].Cell Biochemistry and Biophysics，2015，72（3）：771-775.

[ 4 ] 陸晨熠，莊貞靜，邱飛.納米金的藥用研究進(jìn)展[J].中國藥學(xué)雜志，2017，47（7）：481-485.

基金項目：吉林省教育廳“十三五”科學(xué)技術(shù)研究規(guī)劃項目（JJKH20181186KJ）、（JJKH20170657KJ）。

作者簡介：莫金鋼（1979-），男，湖南常德人，博士，副教授，研究方向為作物生物技術(shù)。

通訊作者：宋凱（1979-），男，吉林大安人，博士，副教授，研究方向為生物技術(shù)。