楊亞琴，馮書(shū)惠，胡永建，李圓圓，王會(huì)鋒，劉進(jìn)璽，鐘紅艦

氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定綠茶中草甘膦和氨甲基膦酸殘留量

楊亞琴，馮書(shū)惠，胡永建，李圓圓，王會(huì)鋒，劉進(jìn)璽，鐘紅艦*

河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（鄭州），河南 鄭州 450002

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用建立了一種檢測(cè)綠茶中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸殘留量的測(cè)定方法。綠茶樣品用水提取，經(jīng)二氯甲烷液液分配和陽(yáng)離子交換/反相吸附復(fù)合固相萃取柱凈化，與三氟乙酸酐和七氟丁醇進(jìn)行衍生化反應(yīng)后，由氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)。該方法草甘膦定量限為0.05?mg·kg-1，在2~100?ng·mL-1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線(xiàn)性（R=0.999?3），氨甲基膦酸的定量限為0.02?mg·kg-1，在1~100?ng·mL-1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線(xiàn)性（R=0.999?2）。綠茶樣品草甘膦添加濃度為0.25?mg·kg-1和0.50?mg·kg-1時(shí)，其平均回收率分別為90.8%和93.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.93%和6.74%，氨甲基膦酸添加濃度為0.10?mg·kg-1和0.20?mg·kg-1時(shí)，其平均回收率分別為85.8%和95.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為10.5%和5.16%。該方法凈化效果好，雜質(zhì)干擾小，回收率高，可滿(mǎn)足綠茶中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸的殘留檢測(cè)要求。

氣相色譜-質(zhì)譜法；草甘膦；氨甲基膦酸；綠茶

草甘膦（Glyphosate，PMG）作為一種廣譜、非選擇性、無(wú)殘留、苗后傳導(dǎo)性除草劑，因其價(jià)格低廉、除草性?xún)?yōu)良，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)田、果園、茶園等。1996年以來(lái)，隨著大豆、玉米和油菜等抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物的問(wèn)世和推廣應(yīng)用，草甘膦的使用出現(xiàn)了迅猛增長(zhǎng)[1]。雖然草甘膦毒性較低，但長(zhǎng)期使用會(huì)影響土壤正常微生物的繁殖，是潛在的環(huán)境生態(tài)危險(xiǎn)源。而且，草甘膦能夠在環(huán)境和生物體中富集，最終通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)身體健康造成危害[2]。中國(guó)是世界上茶葉種植面積和產(chǎn)量最大的國(guó)家，茶葉作為我國(guó)文化傳承的特色經(jīng)濟(jì)作物，具有較高的社會(huì)價(jià)值和較廣的消費(fèi)市場(chǎng)。近年來(lái)，有關(guān)茶葉中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸（Aminomethyl phosphonic acid，AMPA）殘留量超標(biāo)的報(bào)道時(shí)有發(fā)生。我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2016中，明確規(guī)定了茶葉中草甘膦最大殘留限量為1?mg·kg-1[3]。

由于草甘膦和氨甲基膦酸均呈弱酸性，極性較強(qiáng)，易溶于水，難溶于有機(jī)溶劑，且揮發(fā)性低，難以氣化，缺少生色基團(tuán)，對(duì)其殘留量分析的難度比較大。文獻(xiàn)報(bào)道的草甘膦常用檢測(cè)方法有分光光度法[4]、高效液相色譜法[5]、氣相色譜法[6]、離子色譜法[7]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9]、毛細(xì)管電泳法[10]、電化學(xué)分析法[11]等。國(guó)內(nèi)對(duì)于茶葉樣品中草甘膦殘留量的檢測(cè)方法則多為高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9,12-15]，主要采用柱前衍生使草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸與氯甲酸-9-芴基甲酯（FMOC-Cl）反應(yīng)形成熒光衍生物以增加極性被分析物的色譜保留。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)草甘膦分析具有較大的優(yōu)勢(shì)，草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸通過(guò)與三氟乙酸酐-七氟丁醇等衍生試劑反應(yīng)后，可生成易揮發(fā)物質(zhì)用于氣相色譜分析。毛細(xì)管色譜柱良好的分離能力結(jié)合質(zhì)譜的高靈敏度、強(qiáng)選擇性等特點(diǎn)，使得氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法成為測(cè)定草甘膦殘留量的有效方法之一。我國(guó)于2009年發(fā)布了植物性產(chǎn)品中草甘膦殘留量測(cè)定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 23750—2009）[16]，然而氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定茶葉中草甘膦殘留量卻鮮有報(bào)道。本文針對(duì)茶葉樣品基質(zhì)復(fù)雜的特點(diǎn)，擬采用純水提取綠茶中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸，經(jīng)二氯甲烷液液分配和陽(yáng)離子交換/反相吸附復(fù)合固相萃取柱凈化，三氟乙酸酐-七氟丁醇衍生化反應(yīng)后，通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行定性定量分析。該方法操作便捷、雜質(zhì)干擾小、回收率和靈敏度均可達(dá)到農(nóng)藥殘留分析要求，易于在茶葉分析檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室中推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Shimadzu GCMS-QP2010 Plus型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）；LabTech EG20A plus型微控?cái)?shù)顯電熱板（北京萊伯泰科儀器股份有限公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；飛鴿GL-21B型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)）；SK-1快速混勻器（金壇市白塔新寶儀器廠(chǎng)）。

草甘膦、氨甲基膦酸標(biāo)準(zhǔn)品，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；二氯甲烷：色譜純，上海麥克林生化科技有限公司；乙酸乙酯、甲醇：色譜純，德國(guó)默克股份兩合公司；三氟乙酸酐：分析純，北京百靈威科技有限公司（–20℃低溫儲(chǔ)存）；七氟丁醇：分析純，上海麥克林生化科技有限公司（–20℃低溫儲(chǔ)存）；濃鹽酸（12?mol·L-1），煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；檸檬醛：分析純，阿法埃莎（中國(guó)）化學(xué)有限公司；試驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

PCX固相萃取小柱（150?mg/3?mL）、HLB固相萃取小柱（150?mg/3?mL），河北津楊濾材有限公司；茶葉樣品均購(gòu)于市場(chǎng)。

1.2 樣品前處理

提取：稱(chēng)取2?g綠茶樣品，放入50?mL具塞塑料離心管中，加入20?mL水，渦旋混勻1?min，浸泡過(guò)夜，室溫下超聲提取10?min，5?000?r·min-1離心5?min，將上層清液轉(zhuǎn)移至另一離心管，加入50?μL濃鹽酸，混勻后加入5?mL二氯甲烷，渦旋2?min，5?000?r·min-1離心5?min，棄去下層二氯甲烷相，取上層清液待過(guò)柱。

凈化：PCX/HLB復(fù)合固相萃取小柱經(jīng)3?mL甲醇、3?mL水活化后，緩慢加入5?mL上述提取液，收集流出液于50?mL燒杯中，再用3?mL水淋洗復(fù)合固相萃取小柱，合并流出液，于電熱板上50℃蒸干。準(zhǔn)確加入1?mL酸化甲醇水溶液（160?mL水、2.7?mL濃鹽酸、40?mL甲醇混合液）于燒杯中，超聲復(fù)溶后，通過(guò)0.45?μm有機(jī)濾膜，收集該凈化提取液于小瓶中待衍生。

衍生化：取1.6?mL衍生試劑（三氟乙酸酐∶七氟丁醇=2∶1）于4?mL衍生小瓶，用移液器在衍生試劑液面下緩慢加入50?μL凈化提取液，加蓋混勻后立即放入冰水浴中冷卻，然后于90℃條件下衍生反應(yīng)60?min，期間每隔15?min充分搖勻1次。

衍生反應(yīng)結(jié)束后，取出衍生小瓶，用氮?dú)獯蹈桑瑴?zhǔn)確加入500?μL 0.2%檸檬醛乙酸乙酯溶液，加蓋超聲1?min，渦勻轉(zhuǎn)移至上機(jī)小瓶中待測(cè)定。

1.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：DB-5MS（30?m×0.25?mm×0.25?μm）；載氣：氦氣（純度≥99.999%），流速1.0?mL·min-1；升溫程序：80℃保持1.5?min，以30℃·min-1升至260℃保持2?min，再以30℃·min-1升至300℃保持2?min；進(jìn)樣口溫度：200℃；進(jìn)樣方式：無(wú)分流進(jìn)樣；電離方式：EI，70?eV；進(jìn)樣量：1?μL；接口溫度：270℃；離子源溫度：250℃；溶劑延遲：4?min；測(cè)定方式：選擇離子監(jiān)測(cè)法（SIM）。草甘膦和氨甲基膦酸衍生化產(chǎn)物的質(zhì)譜采集信息見(jiàn)表1。

以上機(jī)液濃度50?ng·mL-1為例，根據(jù)上述儀器條件，所得草甘膦和氨甲基膦酸標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化產(chǎn)物的監(jiān)測(cè)離子總離子流色譜圖峰型對(duì)稱(chēng)，保留時(shí)間適宜，相較于草甘膦，氨甲基膦酸衍生化產(chǎn)物的色譜峰強(qiáng)度明顯較高（圖1）。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

草甘膦和氨甲基膦酸均為強(qiáng)極性化合物，通常采用純水進(jìn)行提取[6,15-17]。由于綠茶樣品富含蛋白質(zhì)、色素、氨基酸、多酚類(lèi)等雜質(zhì)，所得純水提取液成分復(fù)雜。為有效去除基質(zhì)中雜質(zhì)干擾，本文采用向純水提取液中加入鹽酸沉淀蛋白后，用二氯甲烷去除提取液中脂溶性雜質(zhì)。對(duì)比文獻(xiàn)及標(biāo)準(zhǔn)方法中提及的CAX陽(yáng)離子交換柱，選用PCX/HLB復(fù)合固相萃取小柱可更好地去除樣品中色素等雜質(zhì)干擾，且直接收集凈化流出液可以有效避免常規(guī)方法[16]選用洗脫液進(jìn)行淋洗時(shí)目標(biāo)化合物隨雜質(zhì)共同流出造成的回收率偏低。

表1 草甘膦和氨甲基膦酸衍生化產(chǎn)物的保留時(shí)間及監(jiān)測(cè)離子信息

注：*：定量離子

Note: *: quantitative ions

在衍生化反應(yīng)條件方面，采用正交試驗(yàn)對(duì)衍生過(guò)程中的3個(gè)因素，即因素A（三氟乙酸酐∶七氟丁醇）、因素B（衍生反應(yīng)溫度）、因素C（衍生反應(yīng)時(shí)間）進(jìn)行優(yōu)化（表2）。待衍生溶液為草甘膦和氨甲基膦酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，衍生后所對(duì)應(yīng)草甘膦、氨甲基膦酸的上機(jī)液濃度分別為50?ng·mL-1、20?ng·mL-1。衍生條件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

以相同水平對(duì)應(yīng)定量離子峰面積之和Ki的極差R來(lái)分別評(píng)價(jià)不同因素對(duì)草甘膦、氨甲基膦酸衍生反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，根據(jù)極差R大小，各因素對(duì)草甘膦衍生反應(yīng)的影響作用由大到小為A>C>B，最佳衍生條件為A3B3C2；各因素對(duì)氨甲基膦酸衍生反應(yīng)的影響作用由大到小為A>B>C，最佳衍生條件為A3B2C3。綜合考慮草甘膦和氨甲基膦酸的衍生反應(yīng)效果，本文最終選擇衍生條件A3B2C2，即三氟乙酸酐∶七氟丁醇=2∶1，反應(yīng)溫度90℃，反應(yīng)時(shí)間60?min為最佳衍生條件。

2.2 線(xiàn)性方程和檢出限

將草甘膦和氨甲基膦酸用空白綠茶基質(zhì)液逐級(jí)稀釋配制成質(zhì)量濃度為1.00、0.40、0.20、0.10、0.04、0.02、0.01?μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本文1.2章節(jié)進(jìn)行衍生，所得衍生化產(chǎn)物上機(jī)液質(zhì)量濃度分別為100、40、20、10、4、2、1?ng·mL-1。以上機(jī)液濃度為橫坐標(biāo)（x，ng·mL-1），定量離子峰面積為縱坐標(biāo)建立基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖2）。結(jié)果表明，在2~100?ng·mL-1濃度范圍內(nèi)，草甘膦衍生化產(chǎn)物呈良好線(xiàn)性，其線(xiàn)性方程=11.953-15.781，相關(guān)系數(shù)R=0.999?3；在1~100?ng·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，氨甲基膦酸衍生化產(chǎn)物呈良好線(xiàn)性，其線(xiàn)性方程=102.35+17.189，相關(guān)系數(shù)R=0.999?2。

采用向空白綠茶樣品中逐級(jí)降低加標(biāo)液濃度的方法來(lái)確定檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。以3倍信噪比（S/N=3）對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物濃度作為檢出限，以10倍信噪比（S/N=10）對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物濃度作為定量限，則氨甲基膦酸的方法檢出限為0.008?mg·kg-1，定量限為0.02?mg·kg-1；草甘膦的方法檢出限為0.02?mg·kg-1，定量限為0.05?mg·kg-1。

注：AMPA為氨甲基膦酸，PMG為草甘膦。下同

表2 衍生條件正交試驗(yàn)因素水平表

注：Ki表示相同水平對(duì)應(yīng)定量離子峰面積之和，其中i代表1、2、3等3個(gè)水平；R表示同一因素下不同水平Ki的極差

Note: Ki: the sum of corresponding quantitative ion peak areas at the same level (i=1, 2, 3). R: the difference between the maximum and minimum values of Kiat three different levels under each factor

圖2 草甘膦和氨甲基膦酸衍生化產(chǎn)物的綠茶基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.3 方法精密度與回收率

選取6個(gè)草甘膦、氨甲基膦酸添加濃度分別為1.00?mg·kg-1和0.40?mg·kg-1的空白綠茶加標(biāo)樣品，按照1.2章節(jié)進(jìn)行樣品前處理，所得草甘膦、氨甲基膦酸的上機(jī)液濃度分別為50?ng·mL-1和20?ng·mL-1。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)得6個(gè)綠茶添加樣品草甘膦衍生化產(chǎn)物的定量離子峰面積分別為454、430、482、508、480、456，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為5.83%；氨甲基膦酸衍生化產(chǎn)物的定量離子峰面積分別為1?818、1?979、1?802、1?949、1?904、1?885，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為3.71%，表明方法具有較好的精密度。

選取空白綠茶樣品，在方法線(xiàn)性范圍內(nèi)對(duì)綠茶樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)。草甘膦添加濃度分別為0.25?mg·kg-1和0.50?mg·kg-1，氨甲基膦酸添加濃度分別為0.10?mg·kg-1和0.20?mg·kg-1，其平均回收率范圍為85.8%~95.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.93%~10.5%（表4），表明方法的準(zhǔn)確度較好。圖3為空白綠茶樣品中添加濃度為0.25?mg·kg-1草甘膦和0.10?mg·kg-1氨甲基膦酸衍生化產(chǎn)物的監(jiān)測(cè)離子色譜圖。

表4 草甘膦和氨甲基膦酸綠茶樣品中的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=4）

圖3 添加草甘膦（0.25?mg·kg-1）和氨甲基膦酸（0.10?mg·kg-1）綠茶樣品衍生化產(chǎn)物的監(jiān)測(cè)離子色譜圖

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用本文所建立的方法對(duì)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的51個(gè)綠茶樣品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，有16個(gè)樣品檢出草甘膦，其含量范圍在0.085~0.49?mg·kg-1；除草甘膦含量最高（0.49?mg·kg-1）的樣品同時(shí)檢出氨甲基膦酸（0.026?mg·kg-1）外，其余樣品均未檢出氨甲基膦酸。該樣品草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸含量的測(cè)定結(jié)果總和以草甘膦計(jì)為0.53?mg·kg-1，小于國(guó)家規(guī)定草甘膦在茶葉中的最大殘留限量（1?mg·kg-1）。

3 結(jié)論

本文采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀建立了綠茶中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸的殘留測(cè)定方法，通過(guò)衍生反應(yīng)使強(qiáng)極性的草甘膦和氨甲基膦酸生成能被氣相色譜柱分離測(cè)定的衍生化產(chǎn)物。試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法雜質(zhì)干擾小、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高、檢出限低，可滿(mǎn)足綠茶中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸的殘留檢測(cè)要求。

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Determination of Glyphosate and Aminomethyl Phosphonic Acid Residue in Green Tea by Gas Chromatography-Mass Spectrometry

YANG Yaqin, FENG Shuhui, HU Yongjian, LI Yuanyuan, WANG Huifeng,LIU Jinxi, ZHONG Hongjian*

Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology, Henan Academy of Agricultural Sciences; Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Agro-Products (Zhengzhou), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Zhengzhou 450002, China

An efficient method for the determination of glyphosate and its metabolite aminomethyl phosphonic acid (AMPA) in green tea was developed based on gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Green tea samples were extracted with water, preliminary purified by dichloromethane and followed by purification with PCX and HLB combined solid phase extraction columns, derived with trifluoroacetic anhydride (TFAA) and 2,2,3,3,4,4,4-heptafluoro-1-butanol (HFB), then determined by GC-MS. For glyphosate, the limit of quantification (LOQ) was 0.05?mg·kg-1, showing good linearity with coefficientR=0.999?3 in the concentration range from 2-100?ng·mL-1. For AMPA, itsLOQ was 0.02?mg·kg-1, showing good linearity with coefficientR=0.999?2 in the concentration range from 1-100?ng·mL-1. At the spiked levels of 0.25?mg·kg-1and 0.50?mg·kg-1, the average recoveries of glyphosate in green tea were 90.8% and 93.2%, with relative standard deviation (RSD) of 4.93% and 6.74%. At the spiked levels of 0.10?mg·kg-1and 0.20?mg·kg-1, the average recoveries of AMPA in green tea were 85.8% and 95.4%, with RSD of 10.5% and 5.16%. The proper impurity purification, small impurity interference and high recovery rate made this method suitable for residue detection of glyphosate and its metabolite APMA in green tea.

chromatography-mass spectrometry, glyphosate, aminomethyl phosphonic acid, green tea

S571.1；S482

A

1000-369X(2020)01-125-08

2019-04-07

2019-08-07

河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目（YNK201710609、YNK20177513）

楊亞琴，女，助理研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)技術(shù)及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究。

80456811@163.com