張建勇，陳琳，崔宏春，王偉偉，薛金金，熊春華，江和源*

PBD和RSM聯(lián)用優(yōu)化聚酯型兒茶素A化學(xué)合成技術(shù)參數(shù)

張建勇1,2，陳琳2，崔宏春3，王偉偉2，薛金金2，熊春華1*，江和源2*

1. 浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；3. 杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院茶葉研究所，浙江 杭州 310024

為探明化學(xué)合成條件對聚酯型兒茶素A（Theasinensin A，TSA）得率的影響，通過單因素試驗和Plackett-Burman Design（PBD）確定TSA化學(xué)合成關(guān)鍵因子，然后采用響應(yīng)面法（Response surface methodology，RSM），進一步優(yōu)化TSA化學(xué)合成技術(shù)參數(shù)。結(jié)果表明，氯化銅用量、甲醇體積分數(shù)、溫度對TSA得率的影響差異極顯著，主因素效應(yīng)為甲醇體積分數(shù)>氯化銅用量>溫度，最優(yōu)條件為氯化銅用量43%，甲醇體積分數(shù)26%，溫度15℃，聚酯型兒茶素得率為59.12%，與模型預(yù)測值59.34%接近。PBD和RSM聯(lián)用優(yōu)化TSA化學(xué)合成工藝可行，預(yù)測性較好，可為其他種類兒茶素氧化聚合物的高效化學(xué)合成提供借鑒和理論依據(jù)。

TSA；EGCG；化學(xué)合成；PBD；RSM；優(yōu)化

聚酯型兒茶素（Theasinensins）是紅茶、黑茶、烏龍茶等發(fā)酵茶類中含量高于茶黃素（Theaflavins，TFs）的兒茶素二聚類氧化產(chǎn)物[1]，由Roberts E.A.H于1957年最先發(fā)現(xiàn)[2]，1959年Roberts E.A.H提出其結(jié)構(gòu)式[3]，之后Nonaka等[4]、Hashimoto等[5]、Shii等[1]陸續(xù)分離鑒定出8種聚酯型兒茶素單體，分別是Theasinensin A（TSA）、Theasinensin B、Theasinensin C、Theasinensin D、Theasinensin E、Theasinensin F、Theasinensin G、Theasinensin H，其中TSA因其含量顯著高于其他聚酯型兒茶素類物質(zhì)，受到國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。聚酯型兒茶素具有多種生物活性，在抗氧化[6-10]、防癌抗癌[11-13]、抗炎[14-19]、降脂減肥[20-23]、降膽固醇[24]、降血糖[25]、保肝[26-27]等方面活性高于部分茶葉兒茶素和茶黃素，是近年來茶葉化學(xué)研究領(lǐng)域的研究熱點之一。但是，由于聚酯型兒茶素不易從茶葉中大量提取制備，無法滿足后續(xù)功能活性、作用機理、風味化學(xué)等研究的需要。

聚酯型兒茶素的體外合成途徑主要包括酶促合成和化學(xué)合成。酶促合成具有高效性、專一性、溫和性的特點，受到國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。Tanaka等[28-29]、Matsuo等[30]、Li等[31]、薛金金[32]、徐斌等[33]、施莉婷等[34]采用茶葉、梨等不同來源多酚氧化酶氧化EGCG，初步明確聚酯型兒茶素酶促合成機理，即EGCG氧化形成鄰醌EGCGQ，鄰醌進一步形成DTSA（脫氫聚酯型兒茶素A），DTSA通過氧化還原歧化反應(yīng)形成TSA。盡管酶促合成可以得到TSA，但是由于多酚氧化酶專一性催化形成TSA效率不高、酶促氧化體系底物競爭關(guān)系復(fù)雜等原因，酶促合成法制備的TSA得率不高，目前已報道的得率均低于30%[28-30]。經(jīng)典化學(xué)合成理論顯示，相對于酶促合成，化學(xué)合成法副產(chǎn)物更多，不易得到高含量和高得率的產(chǎn)物。但是，Takuya等[35]研究發(fā)現(xiàn)，采用氯化銅催化的化學(xué)合成法，其聚酯型兒茶素得率顯著高于酶促合成法，為聚酯型兒茶素高效合成提供了一項新策略。由此可見，與酶促合成相比，雖然化學(xué)合成法底物競爭關(guān)系復(fù)雜，但是通過控制化學(xué)合成條件，仍然可以提高目標產(chǎn)物得率。然而，目前催化劑用量、溶劑含量、溫度、催化時間等化學(xué)合成關(guān)鍵因子對TSA得率和底物當量變化的影響尚不明晰。

近年來，Plackett-Burman Design（PBD）和響應(yīng)面分析法（Response surface Methodology，RSM）在茶葉化學(xué)成分提制方面研究方興未艾。趙熙等[36]在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman和Box-Behnken設(shè)計，對綠茶總黃酮工藝進行響應(yīng)面優(yōu)化，確定總黃酮最佳提取條件為乙醇質(zhì)量分數(shù)77%、液固比42∶1、提取次數(shù)2次，提取率為3.76%，與模型預(yù)測值3.79%基本相符。Liu等[37]采用響應(yīng)面法，分析了浸出條件對綠茶茶湯的化學(xué)成分浸出、感官特性和抗氧化活性的影響，得出最優(yōu)浸出條件為沖泡溫度82℃、沖泡時間5.7?min、茶水比70?mL·g-1、粒度1?100?μm。Guo等[38]在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計和響應(yīng)面法優(yōu)化茶葉中茶多酚和茶多糖同步提取條件，得出最佳提取條件為溫度99℃、提取時間175?min、液料比46?mL·g-1。由此可見，盡管PBD、RSM在茶葉總黃酮、茶多酚、茶多糖提取方面得到了應(yīng)用，但是針對TSA化學(xué)合成技術(shù)參數(shù)優(yōu)化的研究鮮有報道。

本文從不同因子條件下底物和目標產(chǎn)物當量變化規(guī)律角度出發(fā)，解析化學(xué)合成法TSA得率較高的原因，并采用PBD和RSM聯(lián)用法，研究溫度、催化時間、氯化銅用量、溶劑體積分數(shù)等關(guān)鍵因子對TSA形成的影響，獲得最佳TSA化學(xué)合成技術(shù)參數(shù)，以期為TSA的批量高效合成制備提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和材料

Epigallocatechin gallate（EGCG）購于無錫太陽綠寶科技有限公司（純度≥98.0%）；TSA單體由日本Tanaka教授友情提供；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）購自德國Merck公司；氯化銅、抗壞血酸、甲醇、磷酸等試劑均為國產(chǎn)分析純；大孔吸附樹脂HP20購于北京華威銳科化工有限公司。

Waters 2695-600-717 HPLC（美國Waters公司），HH-W420S恒溫水浴鍋（上海精科實業(yè)有限公司）、MR3001磁力攪拌器（Heidoph公司），R-124旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞典BUCHI公司），5810R離心機（德國Eppendorf公司），KQ-300DE數(shù)控超聲波清洗器（中國昆山市超聲儀器有限公司），LGJ-50真空冷凍干燥機（中國北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 TSA化學(xué)合成

稱取1?mmol的EGCG于500?mL三角錐瓶中，加入甲醇溶液充分溶解，加入氯化銅催化，搖勻至完全溶解，1?000?r·min-1磁力攪拌反應(yīng)24?h后，加入過量抗壞血酸，5?000?r·min-1離心10?min，取上清液，大孔吸附樹脂HP20分離，洗脫劑為80%甲醇溶液，將富集TSA的組分濃縮，真空冷凍干燥得TSA，HPLC檢測。

TSA得率=TSA質(zhì)量÷EGCG用量×100%

1.2.2 TSA化學(xué)合成條件的單因素試驗和工藝優(yōu)化

氯化銅用量對TSA得率的影響：氯化銅用量分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%（氯化銅用量=氯化銅質(zhì)量÷EGCG質(zhì)量×100%，下同），EGCG為1?mmol，溶劑體系為30%甲醇溶液，溫度為20℃，催化時間為24?h。

甲醇體積分數(shù)對TSA得率的影響：溶劑體系分別為純水（0%甲醇）、10%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇，氯化銅用量為40%，EGCG為1?mmol，溫度為20℃，催化時間為24?h。

溫度對TSA得率的影響：設(shè)置溫度分別為–10℃、0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃，溶劑體系為30%甲醇，氯化銅用量為40%，EGCG為1?mmol，催化時間為24?h。

催化時間對TSA得率的影響：設(shè)置催化時間分別為6、12、18、24、28、32?h，溶劑體系為30%甲醇，氯化銅用量為40%，EGCG為1?mmol，溫度為20℃。

TSA化學(xué)合成技術(shù)參數(shù)優(yōu)化：在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過PBD統(tǒng)計分析（因素水平設(shè)計見表1和表2），篩選出對TSA得率具有顯著影響的因子，然后采用RSM方法（因素水平設(shè)計見表3），建立TSA得率回歸方程，通過響應(yīng)面優(yōu)化法，優(yōu)化TSA化學(xué)合成技術(shù)參數(shù)。

1.2.3 HPLC分析條件

色譜柱：日本cosmosil 5C18-AR-Ⅱ柱（4.6?mm×250?mm×5?μm）。流動相：A相為50?mmol·L-1磷酸，B相為100%乙腈。洗脫梯度：0~39?min，B相由4%線性升至30%；39~54?min，B相由30%線性升至75%；54~55?min，B相由75%線性降至4%。進樣量10?μL，流速為0.8?mL·min-1，柱溫為35℃，檢測波長為280?nm。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Minitab 19.0進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，統(tǒng)計分析方法包括差異顯著性分析、主因素效應(yīng)分析、方差分析、回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TSA化學(xué)合成單因素試驗結(jié)果

2.1.1 氯化銅用量對TSA化學(xué)合成的影響

由圖1可知，隨著氯化銅用量的增加，TSA得率呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，當氯化銅用量為40%時，聚酯型兒茶素得率達到最大值59.00%，且與20%、30%、50%、60%、70%氯化銅用量條件下的TSA得率均達到差異顯著水平；氯化銅用量在50%、60%、70%條件下，TSA得率低于59.00%，且差異不顯著，故確定氯化銅用量為40%。

比較不同氯化銅用量對底物原料EGCG消耗率影響可以看出，氯化銅用量小于50%時，EGCG消耗率不斷提高，差異顯著；氯化銅用量大于50%時，EGCG消耗率不再增加，且差異不顯著，其原因可能是，雖然氯化銅用量40%條件下TSA得率相對較高，但是EGCG除了形成TSA之外，還可能形成其他氧化聚合副產(chǎn)物[1,21]，導(dǎo)致其在氯化銅用量50%時消耗率才達到最大。

2.1.2 甲醇體積分數(shù)對TSA化學(xué)合成的影響

由圖2知，聚酯型兒茶素得率先隨甲醇體積分數(shù)的增加而提高，但當甲醇體積分數(shù)達到30%時，隨著甲醇體積分數(shù)繼續(xù)增加TSA得率逐漸下降，且差異呈顯著水平，原因可能是甲醇體積分數(shù)小于30%，EGCG化學(xué)合成主要向目標物TSA轉(zhuǎn)化，但是超過30%時，化學(xué)合成副反應(yīng)增多，TSA可能發(fā)生異構(gòu)或降解作用[24]，從而導(dǎo)致其得率急劇下降。因此，確定甲醇體積分數(shù)為30%。

比較甲醇體積分數(shù)對EGCG消耗率影響可以看出，EGCG消耗率隨甲醇體積分數(shù)的增加而逐漸提高，且差異呈顯著水平；當甲醇體積分數(shù)達到30%以后，EGCG消耗率不再增加，其原因可能是，在甲醇/水的反應(yīng)溶劑體系中，EGCG持續(xù)消耗，在甲醇體積分數(shù)為30%時EGCG當量不再發(fā)生變化。

2.1.3 反應(yīng)體系溫度對TSA化學(xué)合成的影響

由圖3可知，TSA得率先隨反應(yīng)體系溫度的升高而提高，但當溫度達到20℃時，隨著溫度繼續(xù)升高TSA得率迅速下降，且差異呈顯著水平，原因可能是，溫度過高條件下，底物EGCG可能發(fā)生降解，導(dǎo)致TSA形成量減少，且溫度過高易誘發(fā)聚酯型兒茶素發(fā)生降解或異構(gòu)化，進一步加劇TSA得率的下降[28]。因此，確定反應(yīng)體系溫度為20℃。

比較溫度對EGCG消耗率影響可以看出，EGCG消耗率隨溫度的升高而逐漸提高，且在0~20℃差異顯著；當溫度達到20℃之后，EGCG消耗率不再增加，其原因可能是，EGCG隨溫度升高持續(xù)消耗，在溫度達到20℃時EGCG當量不再發(fā)生變化。

2.1.4 催化時間對TSA化學(xué)合成的影響

由圖4可知，TSA得率隨催化時間的增加而逐漸提高，且在6~24?h時差異顯著，但當催化時間達到24?h后，TSA得率雖然略有增加，但無顯著差異。因此，確定催化時間為24?h。

注：字母a—d表示差異顯著性，顯著水平P<0.05

注：字母a—f表示差異顯著性，顯著水平P<0.05

注：字母a—d表示差異顯著性，顯著水平P<0.05

比較催化時間對EGCG消耗率影響可以看出，EGCG消耗率隨催化時間增加而逐漸提高，差異顯著；當催化時間達到28?h后，EGCG消耗率雖略有增加，但無顯著差異。

2.2 PBD確定TSA化學(xué)合成關(guān)鍵影響因子

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇氯化銅用量、甲醇體積分數(shù)、溫度、催化時間為考察因素，每個因素設(shè)置2個水平，試驗次數(shù)為12次，每個試驗號重復(fù)3次，以TSA得率為評價指標，因素水平編碼及響應(yīng)值見表1，采用MINITAB 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，比較各因素的T值和重要性。

顯著性及方差分析結(jié)果見表2，影響TSA得率的因素重要性排序為：甲醇體積分數(shù)>氯化銅用量>溫度>催化時間。值小于0.05表示考察因素有顯著影響，值小于0.01表示考察因素有極顯著影響。由表2方差分析結(jié)果可知，甲醇體積分數(shù)、氯化銅用量和溫度對TSA得率的影響達到極顯著水平，催化時間則影響不顯著。采用MINITAB 19.0軟件對各因素標準化主效應(yīng)分析，結(jié)果見圖5，對TSA得率影響強弱的順序為：甲醇體積分數(shù)>氯化銅用量>溫度>催化時間，催化時間對TSA得率的影響強弱差異不顯著，可以根據(jù)效應(yīng)正負和節(jié)本增效原則，將其控制在較好水平。綜上，選擇甲醇體積分數(shù)、氯化銅用量、溫度作為TSA化學(xué)合成的關(guān)鍵影響因子，進行后續(xù)的RSM分析。

注：字母a—e表示差異顯著性，顯著水平P<0.05

表1 基于TSA化學(xué)合成技術(shù)參數(shù)的PBD因素設(shè)置及結(jié)果

表2 基于TSA化學(xué)合成技術(shù)參數(shù)的PBD因素效應(yīng)分析

2.3 RSM優(yōu)化TSA化學(xué)合成技術(shù)參數(shù)

2.3.1 化學(xué)合成技術(shù)參數(shù)模型的建立與統(tǒng)計分析

在PBD篩選試驗的基礎(chǔ)上，選擇氯化銅用量（）、甲醇體積分數(shù)（）、溫度（）進行優(yōu)化試驗。采用MINITAB 19.0軟件進行Box-Behnken設(shè)計，因素水平編碼見表3，試驗設(shè)計及TSA得率響應(yīng)值見表4。建立TSA得率（）與甲醇體積分數(shù)（）、氯化銅用量（）、溫度（）的數(shù)學(xué)模型，回歸方程為：

＝58.250＋2.998－1.291－3.311－4.7342－1.7912－6.0062＋0.485×＋0.895×－0.077B×

模型方差分析結(jié)果見表5，模型的總回歸值<0.000?1（<0.01）達極顯著水平，失擬項值=0.199?0（>0.05）呈不顯著水平，說明該回歸模型效應(yīng)極顯著且失擬度好，試驗設(shè)計合理可靠。未調(diào)整前的相關(guān)系數(shù)2=0.994?4，經(jīng)過試驗優(yōu)化，調(diào)整后的相關(guān)系數(shù)2adj=0.984?4，說明該回歸模型可解釋98.44%的可變性，預(yù)測值與真實值相關(guān)性好，試驗誤差小。另外，該回歸模型的變異系數(shù)CV為4.19%，小于5%，說明該模型方程能較好反映真實的實驗值，因此可以用該模型分析和預(yù)測不同化學(xué)合成條件下TSA得率的變化。

回歸方程是經(jīng)無量綱線性代碼處理后所得，各回歸系數(shù)已經(jīng)標準化處理，因此可以通過直接比較其絕對值的大小來判斷各因子的重要性[36-37]。比較回歸方程的線性項>>，說明溫度對TSA得率的影響最大，其次為氯化銅用量、甲醇體積分數(shù)。

圖5 PBD標準化效應(yīng)帕累托圖

表3 基于TSA化學(xué)合成技術(shù)參數(shù)的RSM因素水平表

表4 基于TSA化學(xué)合成技術(shù)參數(shù)的RSM設(shè)計方案與結(jié)果

表5 TSA得率回歸方程的方差分析表

注：*代表顯著水平<0.05；**代表極顯著水平<0.01

Note: * represents significant level<0.05. ** represents extremely significant level<0.01

2.3.2化學(xué)合成技術(shù)參數(shù)交互作用響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖是TSA得率對化學(xué)合成技術(shù)因素的三維空間曲面圖，根據(jù)TSA得率回歸模型，采用MINITAB 19.0軟件繪制響應(yīng)面分析圖，結(jié)果見圖6。甲醇體積分數(shù)和溫度的交互作用對TSA得率的影響最顯著，響應(yīng)面圖中表現(xiàn)為響應(yīng)面曲面較陡（圖6-C）；而氯化銅用量和溫度的交互作用（圖6-B）、氯化銅用量和甲醇體積分數(shù)（圖6-A）的交互作用次之，響應(yīng)面圖中表現(xiàn)為響應(yīng)面曲面較平滑。

2.3.3 化學(xué)合成技術(shù)參數(shù)單因素效應(yīng)分析

對TSA得率回歸模型進行降維分析，考察其中一個因素時，將其他因素固定在0水平，得到單因素效應(yīng)方程如下：

1＝58.250＋2.998－4.7342，對稱軸=0.273；

2＝58.250－1.291－1.7912，對稱軸=–0.313；

3＝58.250－3.311－6.0062，對稱軸=–0.253

單因素效應(yīng)方程可以描述各因素變化對值的影響。從圖7單因素效應(yīng)曲線圖可以看出，TSA得率隨著氯化銅用量的增加，呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，在編碼值=0.286（對應(yīng)氯化銅用量為41.23%）時，TSA得率達到最大值56.85%；聚酯型兒茶素的浸出率隨著甲醇體積分數(shù)增大，呈先增加后減少的趨勢，在編碼值=–0.313（對應(yīng)的甲醇體積分數(shù)為28.56%）時，達到最大值57.56%；聚酯型兒茶素的浸出率隨著溫度的升高，呈先增加后減少的趨勢，在編碼值=–0.253（對應(yīng)的溫度為14.12℃）時，達到最大值57.56%。單因素效應(yīng)分析結(jié)果與單因素試驗結(jié)果一致。

圖6 兩因素交互作用對TSA得率影響的響應(yīng)面圖

圖7 單因素效應(yīng)曲線

2.3.4 TSA化學(xué)合成技術(shù)參數(shù)模擬優(yōu)化與驗證

通過Minitab 19.0軟件對回歸模型進行優(yōu)化，得到TSA化學(xué)合成最佳技術(shù)參數(shù)為：氯化銅用量42.92%，甲醇體積分數(shù)26.46%，溫度14.94℃，聚酯型兒茶素得率理論最大值為59.34%?？紤]到實際操作，將上述優(yōu)化得到的最佳技術(shù)參數(shù)調(diào)整為氯化銅用量43%，甲醇體積分數(shù)26%，溫度15℃，催化時間24?h。

為檢驗PBD和RSM聯(lián)用法優(yōu)化聚酯型兒茶素的可靠性，試驗采用上述最優(yōu)技術(shù)參數(shù)化學(xué)合成TSA，TSA得率為59.12%，與模型理論預(yù)測值接近，相對偏差為0.37%，說明該回歸模型能夠準確描述TSA得率與各技術(shù)參數(shù)之間的關(guān)系，符合統(tǒng)計學(xué)規(guī)律，得到的優(yōu)化合成技術(shù)參數(shù)準確可靠，具有應(yīng)用價值。

3 討論與結(jié)論

Plackett-Burman Design（PBD）是以一種針對較多因子的篩選試驗設(shè)計方法，首先在單因素試驗基礎(chǔ)上確定每個因子兩水平，然后比較各因子兩水平的差異與整體的差異來確定因子的顯著性，從而達到篩選重要因子的目的[36]。響應(yīng)面分析法，即響應(yīng)曲面設(shè)計方法，是利用合理的試驗設(shè)計方法并通過試驗得到一定數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法，可以有效解決傳統(tǒng)數(shù)理統(tǒng)計方法無法考慮各因素綜合作用、無法給出響應(yīng)值最優(yōu)值的問題[37-38]。本研究首先采用單因素試驗和Plackett-Burman Design（PBD），優(yōu)選出氯化銅用量、甲醇體積分數(shù)、溫度等TSA化學(xué)合成關(guān)鍵因子和合理水平，避免了非重要因子帶來的時間和試驗資源的浪費，然后采用RSM對聚酯型兒茶素化學(xué)合成技術(shù)參數(shù)進行優(yōu)化，獲得聚酯型兒茶素化學(xué)合成最佳條件，即氯化銅用量43%，甲醇體積分數(shù)26%，溫度15℃，聚酯型兒茶素得率為59.12%，與模型預(yù)測值59.34%接近，可為其他種類兒茶素氧化聚合物的高效化學(xué)合成制備提供借鑒和理論依據(jù)。

酪氨酸酶、兒茶酚酶催化合成兒茶素氧化聚合物的共同特點是酶結(jié)構(gòu)域包含銅離子活性中心，該活性中心催化兒茶素的O-雙酚分子結(jié)構(gòu)形成相應(yīng)的O-鄰醌分子結(jié)構(gòu)，鄰醌進一步縮合，形成不同聚合度的兒茶素氧化聚合物，包括聚酯型兒茶素、茶黃素等。由此可見，銅離子在聚酯型兒茶素、茶黃素等合成過程中起著重要的催化作用。Takuya等[35]比較了不同種類銅鹽對聚酯型兒茶素化學(xué)合成的影響，發(fā)現(xiàn)氯化銅較其他銅鹽具有更高的催化效率，但未對不同氯化銅用量、甲醇體積分數(shù)、溫度、催化時間等對TSA得率的影響進行系統(tǒng)研究。本研究驗證了氯化銅化學(xué)合成聚酯型兒茶素得率高于酶促合成法的結(jié)論，并在此基礎(chǔ)上，系統(tǒng)分析了化學(xué)合成關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)對TSA形成和底物消耗量的影響，得出了優(yōu)化工藝技術(shù)參數(shù)。通過與經(jīng)典多酚氧化酶酶促合成工藝的TSA得率相比，本研究優(yōu)化后的化學(xué)合成工藝TSA得率提高了23%。酪氨酸酶、兒茶酚酶和氯化銅都含有銅，但是二者的催化效率卻存在如此大的差異，這可能與大分子酶蛋白和小分子銅鹽的銅離子靶向催化位點、不同分子結(jié)構(gòu)域銅離子與底物結(jié)合能力、底物選擇性合成等因素有關(guān)，深入的催化差異機理有待進一步研究。

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Optimization of Technical Parameters for Chemical Synthesis of Theasinensin A by PBD and RSM

ZHANG Jianyong1,2, CHEN Lin2, CUI Hongchun3, WANG Weiwei2, XUE Jinjin2, XIONG Chunhua1*, JIANG Heyuan2*

1. School of Food Science and biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310018, China; 2. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 3. Tea Research Institute, Hangzhou Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310024, China

The effect of chemical synthesis conditions on the yield of theasinensin A was studied. Key factors for chemical synthesis of theasinensin A (TSA) were determined by single factor test and Plackett-Burman Design (PBD). The response surface methodology (RSM) wasemployed to optimize the technical parameters for the chemical synthesis. The experiment results indicate that the effects of copper oxide content, methanol content and temperature on the yield were extremely significant. The main factors were methanol content, next copper oxide content, and then temperature. The optimal conditions were as follows: copper chloride content 43%, methanol content 26%, and temperature 15℃. Under these conditions, the yield of TSA was 59.12%, which was close to the predicted value of 59.34%. The combination of PBD and RSM to optimize the chemical synthesis of TSA achieved ideal result, which could provide reference and theoretical basis for the efficient chemical synthesis of other catechin oxidation polymers.

theasinensin A (TSA), EGCG, chemical synthesis, PBD, RSM, optimization

Q946.84+1

A

1000-369X(2020)01-051-12

2019-11-04

2019-12-22

國家自然科學(xué)基金（31670692）、浙江省自然科學(xué)基金（LY18C160004）、公益性行業(yè)專項（201503142-11）、國家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-23-03A）

張建勇，男，助理研究員，博士在讀，主要從事茶葉化學(xué)與加工方面的研究。

xiongch@163.com，jianghy@tricaas.com