王樹梅 韓金美 烏日罕 薩礎拉

中圖分類號R927，2

文獻標志碼A

文章編號1001-0408（2020）02-0144-05

DOI

10.603 9/j .issn.1001-0408.2020.02.04

摘要 目的：建立測定蒙藥蘇格木勒一3湯水提物中芹菜素、胡椒堿及其揮發(fā)油中按油精、枯茗醛含量的方法。方法：采用高效液相色譜法（HPIC）測定芹菜素、胡椒堿的含量;采用氣相色譜法（GC）測定桉油精、枯茗醛的含量。HPLC法采用色譜柱為AgilentEclipse XDB-C18，流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液，流速為1.0 mL/min，檢測波長為225（芹菜素）、342 nm（胡椒堿），柱溫為30℃，選樣量為10 μL。GC法采用色譜柱為Dimensions SH-Rtx-I毛細管柱，載氣為高純氫氣，進樣口溫度為270℃，載氣流量為1mL/min，程序升溫，進樣量為10 μL，進樣分流比為1：10。結果：芹菜素、胡椒堿、桉油精、枯茗醛檢測質量濃度的線性范圍分別為12.5-200 μg/mL（r=0.999 6）、87.3-139.7μg/mL（r= 0.999 9）.136-2 187 μg/mL（r=0.999 9）、39-635 μg/mL（r=0.999 9）;定量限分別為0.02、0.06、0.06、0.12 μg/mL;檢測限分別為0.01、0.02、0.03、0.04 μg/mL;精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD均小于4%;加樣回收率分別為89.26% -97.26%（RSD= 2.69%，n=6）、94.20% - 104.01%（RSD= 3.64%，n=6）、98.51% - 110.11 qo（ RSD= 3.87%，n=6）、95.76% -107.82%（RSD=4.12%，n=6）;含量分別為0.769-0.828、7.741-7.981、5.284 7-5.846 6、1.038 6-1.101 2 mg/g（n=3）。結論：所建方法簡單、可行，可用于蒙藥蘇格木勒-3湯不同部位的質量控制。

關鍵詞 高效液相色譜法;氣相色譜法;蘇格木勒-3湯;水提物;揮發(fā)油;芹菜素;胡椒堿;按油精;枯茗醛;含量測定

蒙藥蘇格木勒一3湯始載于《四部醫(yī)典》[1]，其味辛，性溫，具有抑“赫依”（蒙醫(yī)指具有調節(jié)人體機制平衡的物質）作用[2]，在治療失眠方面具有顯著療效[3-5]。蘇格木勒一3湯主要由白豆蔻、香旱芹、蓽茇等3味藥材組成。方中白豆蔻（蒙文名為蘇格木勒）為主藥，可祛腎寒、抑赫依、溫中消食，主治腎赫依病、失眠、消化不良等[6]，主要含有揮發(fā)油類成分，以桉油精含量最高[7]，具有降血糖、保護腎臟嘲、鎮(zhèn)靜、催眠[9-11]等作用;香旱芹為輔藥，具有清肺熱、提升胃火、消食的功效[6]，主要含有黃酮及揮發(fā)油類成分，具有抗氧化[12]、降糖[13]、鎮(zhèn)靜、催眠[9-11]等作用;蓽茇為佐藥，具有抑赫依、調理體素、化痰、止痛等功效[6]，主要含有生物堿及酰胺類、揮發(fā)油類、木脂素類、萜類、甾醇類等成分[14]，具有保護胃黏膜[16]、鎮(zhèn)靜、催眠[9-11]等作用。

目前關于蘇格木勒一3湯的研究主要為臨床觀察，對于其質量控制及有效物質基礎等方面的研究較少。本課題組前期對蘇格木勒一3湯的揮發(fā)油部位與水提物部位分別進行了藥效學研究，結果發(fā)現(xiàn)兩者均具有治療失眠的作用。雖然有研究對蘇格木勒一3水提物或揮發(fā)油的藥效組分進行了測定[16-18]，但這些研究多以單一成分作為評價指標，難以全面評估其質量?；诖?，本研究采用高效液相色譜法（HPIC）同時測定蘇格木勒一3湯水提物芹菜素、胡椒堿（分別來自組方藥材香旱芹、蓽茇）的含量;采用氣相色譜法（GC）同時測定其揮發(fā)油中桉油精、枯茗醛的含量，旨在為該方劑質量標準的提高和后續(xù)二次開發(fā)及體內藥效物質基礎研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

U3000型HPLC儀，包括二極管陣列檢測器、四元梯度泵（美國Thermo Fisher公司）;AL204型電子分析天平（美國Mettler-Toledo公司）;KQ-250型超聲波清洗機（鞏義予華儀器有限責任公司）;GC-2014AFSC型GC儀，包括自動進樣器、氫火焰離子化檢測器[島津企業(yè)管理（中國）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

芹菜素對照品（批號：111901-201603，純度：99.2%）、胡椒堿對照品（批號：110775-201405，純度：98.9%）、桉油精對照品（批號：110788-201707，純度：100%）均由中國食品藥品檢定研究院提供;枯茗醛對照品[安倍爾實驗室技術（上海）有限公司，批號：R4030004，純度：95%];正己烷為分析純，甲醇及其余試劑均為色譜純，水為蒸餾水。

1.3 藥材

白豆蔻（批號：冀20100139）、香旱芹（批號：冀20100139）、蓽茇（批號：冀20100139）均購于內蒙古田里藥材公司，經(jīng)內蒙古醫(yī)科大學蒙醫(yī)藥學院圖門巴雅爾教授鑒定分別為姜科植物白豆蔻（Amomum， kravanhPierre ex Gagnep）和爪哇白豆蔻（A.compactum Soland.ex Maton）的果實、傘形科植物孜然芹（Cuminum cvrmi-num L.）的成熟果實、胡椒科植物蓽茇（Piper longum L）的干燥未成熟或成熟果穗。

2 方法與結果

2.1 HPLC法測定蘇格木勒.3湯水提物中芹菜素和胡椒堿的含量

2.1.1 蘇格木勒一3湯水提物的制備 取蘇格木勒一3湯[白豆蔻一香旱芹一蓽茇（3：2：1，m/m/m）]50 g，加1 000mL水，煎煮30 min后，濾過，濾液蒸干，得到蘇格木勒一3湯水提物（9 g，得率為18%）。共制備9批樣品。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（250 mmx4.6 mm，5μm）;流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液;流速：1.O mL/min;進樣量：10 μL;柱溫：30℃;檢測波長：225 nm（芹菜素）、342 nm（胡椒堿）。

2.1.3 混合對照品溶液的制備取芹菜素、胡椒堿對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成含芹菜素、胡椒堿質量濃度分別為0.200、1.397 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.4 供試品溶液的制備精密稱取“2.1.1”項下蘇格木勒一3湯水提物約1g，加25%鹽酸溶液2 mL、甲醇10mL，稱定質量，超聲（功率：100 W，頻率：40 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.5 空白對照溶液以甲醇為空白對照溶液。

2.1.6 系統(tǒng)適用性試驗取上述混合對照品溶液、供試品溶液、空白對照溶液各10 μL，按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在混合對照品溶液和供試品溶液色譜圖上有相同保留時間的色譜峰，理論板數(shù)按芹菜素、胡椒堿計均不低于3 000，各成分分離度均大于1.5，空白對照對測定無干擾。

2.1.7 線性關系考察取“2.1.3”項下混合對照品溶液適量，用甲醇依次稀釋1、2、4、8、16倍后分別精密吸取10 μL，按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得芹菜素回歸方程為y=673.24x+1.212 1（r=0.999 6），胡椒堿回歸方程為y=1 145.2x+9.370 5（r=0.999 9）。結果表明，芹菜素、胡椒堿分別在12.5～200、87.3～139.7 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.8 定量限與檢測限考察取“2.1.3”項下混合對照品溶液適量，用甲醇倍比稀釋，按“2.1.2”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積。分別以信噪比10：1、3：1計算定量限、檢測限。結果，芹菜素、胡椒堿的定量限分別為0.02、0.06 μg/mL，檢測限分別為0.01、0.02 μg/mL。

2.1.9 精密度試驗取“2.1.3”項下混合對照品溶液適量，按“2.1.2”項下色譜條件連續(xù)進樣測定5次，記錄峰面積。結果，芹菜素、胡椒堿峰面積的RSD分別為1.29%、0.85%（n=5），表明儀器精密度良好。

2.1.10 穩(wěn)定性試驗取“2.1.4”項下供試品溶液適量，分別在制備后于室溫下放置2、4、8、10、12 h時，按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，芹菜素、胡椒堿峰面積的RSD分別為3.27%、1.84%（n=5），表明供試品溶液制備后12h內基本穩(wěn)定。

2.1.11 重復性試驗取“2.1.1”項下蘇格木勒一3湯水提物約1 g，共6份，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品含量。結果，芹菜素、胡椒堿含量的RSD分別為1.93%、1.2%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.1.12 加樣回收率試驗取已知含量的“2.1.1”項下蘇格木勒一3湯水提物，共6份，每份約1 g，精密稱定，加入“2.1.3”項下混合對照品溶液適量，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表1。

2.1.13 樣品含量測定精密稱取9批“2.1.1”項下蘇格木勒一3湯水提物適量，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，平行操作3次，記錄峰面積并按外標法計算樣品含量，結果見表2。

2.2 GC法測定蘇格木勒.3湯揮發(fā)油中桉油精和枯茗醛的含量

2.2.1 蘇格木勒一3湯揮發(fā)油的制備 取蘇格木勒-3湯[白豆蔻一香旱芹一蓽茇（3：2：1，m /m/m ）]50 g，置于圓底燒瓶中，加500 mL水振搖混勻，適當浸泡，緩慢加熱至沸后保持微沸1h，再放冷至室溫，收集揮發(fā)油，過無水硫酸鈉，得蘇格木勒一3湯揮發(fā)油（1.9 g，得率為3.8%）。共制備9批樣品。

2.2.2 色譜條件 色譜柱：Dimensions SH-Rtx-1毛細管柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm）;載氣：高純氫氣;進樣口溫度：270℃;載氣流量：1 mL/min;程序升溫（初始溫度為80℃，保持1 min，以30 ℃/min升溫至200℃保持5min）;進樣量：10 μL;進樣分流比：1： 10。

2.2.3 混合對照品溶液的制備取桉油精、枯茗醛對照品各適量，精密稱定，加正己烷制成含桉油精、枯茗醛質量濃度分別為2.187、0.635 mg/mL的混合對照品溶液，即得。

2.2.4 供試品溶液的制備精密稱取“2.2.1”項下蘇格木勒一3湯揮發(fā)油約10 mg，加正己烷定容至10 mL，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.5 空白對照溶液以正己烷為空白對照溶液。

2.2.6 系統(tǒng)適用性試驗取上述混合對照品溶液、供試品溶液、空白對照溶液各適量，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖2。由圖2可知，在混合對照品溶液和供試品溶液色譜有相同保留時間的色譜峰，理論板數(shù)按桉油精、胡椒堿計均不低于3 000，各成分分離度均大于1.5，空白對照對測定無干擾。

2.2.7 線性關系考察取“2.2.3”項下混合對照品溶液，用正己烷依次稀釋1、2、4、8、16倍后分別精密吸取10μL，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得桉油精回歸方程為y=869 874x- 10 366（r=0.999 9），枯茗醛回歸方程為y=821 87lx-4 001.8（r=0.999 9）。結果表明，桉油精、枯茗醛分別在136～2 187、39～635 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.8定量限與檢測限考察精密量取“2.2.3”項下混合對照品溶液適量，用正己烷倍比稀釋，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。分別以信噪比10：1、3：1計算定量限、檢測限。結果，桉油精、枯茗醛的定量限分別為0.06、0.12 μg/mL，檢測限分別為0.03、0.04μg/mL。

2.2.9 精密度試驗取“2.2.3”項下混合對照品溶液1mL，置于10 mL量瓶中，加正己烷稀釋并定容，搖勻，按“2.2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果，桉油精、枯茗醛峰面積的RSD分別為0.69%、0.94%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.10 穩(wěn)定性試驗取“2.2.4”項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置2、4、8、10、12 h時，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，桉油精、枯茗醛峰面積的RSD分別為1.53%、1.21%（n=5），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內基本穩(wěn)定。

2.2.11 重復性試驗取“2.2.1”項下蘇格木勒一3湯揮發(fā)油約50 mg，共6份，精密稱定，按“2.2.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品含量。結果，桉油精、枯茗醛含量的RSD分別為0.40%、0.71%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.2.12 加樣回收率試驗稱取已知含量的“2.2.1”項下蘇格木勒一3湯揮發(fā)油，共6份，每份約10 mg，精密稱定，加入“2.2.3”項下混合對照品溶液適量，按“2.2.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表3。

2.2.13 樣品含量測定精密稱取9批“2.2.1”項下蘇格木勒一3湯揮發(fā)油適量，按“2.2.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，平行操作3次，記錄峰面積并按外標法計算樣品含量，結果見表4。

3 討論

在前期預試驗中，筆者對芹菜素、胡椒堿在200～400 nm波長范圍內進行二極管陣列檢測，結果顯示，芹菜素、胡椒堿分別在225、342 nm波長處有最大吸收峰，故選擇225、342 nm分別進行檢測。本課題組前期分別以甲醇、乙醇、甲醇-25%鹽酸溶液為溶劑制備蘇格木勒一3湯水提物供試品溶液，結果顯示，以甲醇-25%鹽酸溶液為溶劑時能很好地保護醛基，故選擇其作為溶劑;同時又考察了超聲提取和回流提取對提取效果的影響，結果發(fā)現(xiàn)，超聲提取時提取率高、時間短、溫度低，有效成分易于分離、純化;此外，還比較了甲醇一水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈一水等不同流動相系統(tǒng)的分離效果，結果顯示，以甲醇-0.1%磷酸水為流動相時，各待測成分與其他成分可達到基線分離，且出峰快、保留時間短、色譜峰峰形理想、分離度好，故選擇其作為流動相。

蒙藥復方制劑的功效是藥品內含成分整體作用的體現(xiàn)，是多種成分、多種機制綜合作用的結果，因此單個活性成分含量不能反映其整體療效[19]。隨著分析技術的發(fā)展，同時測定復方制劑中多個有效成分已成為控制其質量的發(fā)展趨勢[20]。例如，裴貴珍等[21]采用HPLC法測定維藥艾米斯丸中芹菜素、胡椒堿、木香烴內酯、去氫木香烴內酯的含量;涂明珠等[22]采用GC法測定復方薄樟桉油溶液中桉油精、樟腦、薄荷腦的含量。在本研究中，筆者參考上述文獻，以芹菜素、胡椒堿、桉油精和枯茗醛為指標進行含量測定，所建方法操作簡單、重復性好，可為蘇格木勒一3湯的質量控制提供技術支持。

參考文獻

[1]宇妥·元旦貢布.四部醫(yī)典[M].赤峰：內蒙古科技出版社，1993：1015.

[2]巴根那，蒙醫(yī)方劑學[M].呼和浩特：內蒙古人民出版社，2007：89.

[3]薩仁圖雅.蒙藥蘇格木勒一3味湯治療失眠癥96例臨床觀察[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2007，13（4）：12-13.

[4]董文泉，王莉，石瑞平.蒙藥蘇格木勒一3治療失眠的臨床體會[J].中國民族民間醫(yī)藥，2009（24）：6.

[5]鄧斯琴，春娜，山丹，等.純牛奶煎煮蒙藥蘇格木勒一3味湯治療赫依型失眠癥臨床觀察[J]中國民族醫(yī)藥雜志，2019，25（3）：26-27.

[6]羅布桑.蒙藥學[M].呼和浩特：內蒙古人民出版社，2006：87、125、314.

[7]國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會，中華本草：蒙藥卷[M].上海：上?？茖W技術出版社，2004： 2035、7754.

[8]陳紅梅，蘇都那布其，長春，等，白豆蔻揮發(fā)油對糖尿病腎病大鼠腎臟保護作用[J]中華中醫(yī)藥雜志，2017，32（9）：4227、4229.

[9]烏蘭圖雅，韓金美，蓮花，等.蘇格木勒-3湯水提物治療失眠的藥效學研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2018，14（12）：14-16.

[10]薩礎拉，朝木日麗格，韓金美，等，蘇格木勒一3湯水提物中鎮(zhèn)靜催眠成分的篩選[J]山東醫(yī)藥，2018，58（43）：18-21.

[11]韓金美，王樹梅，薩礎拉，等，蘇格木勒一3湯水提物對小鼠鎮(zhèn)靜、催眠及失眠模型大鼠催眠的作用機制研究[J].中國藥房，2018，29（23）：3232-3235.

[12]盧帥，索菲婭，龔健，等.新疆孜然黃酮超聲提取及其抗氧化作用研究[J].中國農(nóng)學通報，2013，29（27）：215-220.

[13] TALPUR N，ECHARD B，INGRAM C，et al.Effects ofanovel formulation of essential oils on glucose-insulin me-tabolism in diabetic and hypertensive rats：a pilot study[J].Diabetes Obes Metab，2005，7（2）：193-199.

[14]劉春蕾，張少華，劉勇旭，等.蓽茇的化學成分和藥理作用研究進展[J].山東中醫(yī)雜志，2011，30（7）：524-525.

[15]趙小原，其其格，白音夫.蓽茇對大鼠寒冷型應激性胃黏膜損傷保護作用及病理改變的觀察[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2004（3）：28.

[16]敖道夫，呼日樂巴根，阿拉坦敖日格樂，等，蘇格木勒一3湯中白豆蔻-白苣勝揮發(fā)油部位體外GC-MS分析[J].中醫(yī)藥導報，2016，22（24）：41-46.

[17]賽日道瑪，那生桑，紅梅，等.HPLC法測定蒙藥查干-賽日阿中枯茗醛的含量[J].中醫(yī)藥導報，2018，24 （19）：100-102.

[18]閆鳳杰，關金鳳.RP-HPLC法測定蘇格木勒-3湯中胡椒堿的含量[J].中國民族民間醫(yī)藥，2012（13）：35-36.

[19]薩礎拉.蒙藥復方有效物質基礎研究與創(chuàng)新藥物研究新思路[J]，中國民族醫(yī)藥雜志，2015，21（10）：41-43.

[20] THEUNIS M， NAESSENS T，VERHOEVEN V，et al.De-yelopment and validation of a robust high-performanceliquid chromatographic method for the analysis of mona-colins in red yeast rice[J]. Food Chem， 2017. DOI： 10.1016/j.foodchem.2017.04.136.

[21]裴貴珍，陳文，李曉娟，等，高效液相色譜雙波長法測定維藥艾米斯丸中芹菜素、胡椒堿、木香烴內酯、去氫木香烴內酯的含量[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2013，33 （20）：1731-1732.

[22]涂明珠，易巧，鐘振華，等.GC法測定復方薄樟桉油溶液中桉油精、樟腦、薄荷腦的含量[J].中國藥師，2017，20（8）：1492-1494.

（收稿日期：2019-07-30修回日期：2019-11-06）

（編輯：陳宏）

△基金項目：國家自然科學基金資助項目（No.81560705）;內蒙古醫(yī)科大學蒙醫(yī)學“一流學科”科學研究重點項目（ No.myx-ylxk2019-01）;內蒙古醫(yī)科大學蒙醫(yī)學“一流學科”科學研究研究生創(chuàng)新項目（No.myxylxk201928）;內蒙古醫(yī)科大學蒙藥學“一流學科”蒙藥專業(yè)研究生科研能力提升項目（No.myxylxkky2019-04）

* 碩士研究生。研究方向：蒙（中）藥藥效物質基礎及質量控制。E-mail： 897894126@qq.com

# 通信作者：副教授，碩士生導師，博士。研究方向：蒙（中）藥藥效物質基礎及質量控制。電話：0471-6657613。E-mail： haisachula@126.com