張進兵 沈春修 王舸泓 廖建平 卻志群

關鍵詞：東鄉(xiāng)野生稻;耐冷;數(shù)量性狀座位（Quantitative trait locus，QTL）;轉錄組分析;半定量RT-PCR

中圖分類號：S511.01文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2020）06-1612-05

Key words：Dongxiang wild rice;cold tolerance;quantitative trait locus （QTL）;transcriptome analysis;semi-quantitative RT-PCR

低溫寒害是影響水稻生產(chǎn)的主要不利因素之一，特別是苗期對低溫脅迫尤為敏感，早春時期的水稻秧苗暴露于低溫脅迫下，幼苗發(fā)育變緩、變黃、枯萎，最終導致水稻產(chǎn)量下降[1]。受低溫逆境脅迫的影響，東南亞和南亞共約有7.00×106 hm2土地無法種植水稻[2]。在中國，除了緯度較高的東北水稻耕作區(qū)易受低溫影響外，長江中下游地區(qū)早春時期的“倒春寒”常導致水稻爛根、爛秧，對水稻產(chǎn)量產(chǎn)生了嚴重影響。據(jù)統(tǒng)計，每年中國稻作區(qū)均有低溫冷害發(fā)生，平均4～5年發(fā)生1次嚴重冷害，造成水稻災年年均減產(chǎn)5.0×109～1.0×1010 kg[3]。挖掘水稻自身的耐冷相關基因，培育強耐冷性水稻品種是解決當前生產(chǎn)上這一突出問題的重要途徑。

據(jù)國家水稻數(shù)據(jù)中心（http：//www.ricedata.cn/）統(tǒng)計，截至2020年2月1日，水稻中已被克隆的耐冷相關基因共計81個，其中占比最大的一類是轉錄因子基因，約占50%，當遭遇冷脅迫時，植物轉錄因子的表達被啟動，然后激活下游一系列抗寒功能性基因的表達，從而提高了植物的抗寒性[4-5]。由此可見，耐冷相關轉錄因子基因在未來水稻抗寒育種中有著廣闊的應用前景。MYB（V-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）轉錄因子基因家族是目前植物中已知基因數(shù)最為龐大的轉錄因子基因家族之一。MYB轉錄因子由其N端保守的DNA結合結構域而得名，根據(jù)結構域中不完全重復的R結構的數(shù)量，可將MYB轉錄因子分為4個亞類：單一R結構的MYB、R2R3型MYB、3R-MYB及4R-MYB。此外，有較多研究發(fā)現(xiàn)MYB轉錄因子廣泛參與了植株耐低溫脅迫的基因轉錄調控網(wǎng)絡[6-8]。自東鄉(xiāng)野生稻被發(fā)現(xiàn)以來，一直以耐冷性強而著稱，然而目前在東鄉(xiāng)野生稻中還未見關于MYB轉錄因子在低溫逆境脅迫中發(fā)揮作用的報道。

筆者所在課題組前期通過對耐冷東鄉(xiāng)野生稻、茶陵野生稻、東鄉(xiāng)野生稻與冷敏感水稻93-11雜交所得F2代越冬群體（OOP，由20個典型的可越冬存活的F2代個體組成）及冷敏感水稻93-11苗期冷處理（4 ℃ 3 d）前后的轉錄組數(shù)據(jù)進行比較分析，獲得了462個與水稻苗期耐冷性相關的差異表達基因（Different expressed genes， DEG）[9]，結合Mao等公布的13個東鄉(xiāng)野生稻苗期耐冷數(shù)量性狀QTL信息[10]，發(fā)現(xiàn)有1個差異表達基因LOC_Os11g35390剛好落于QTL的qCTS11.2位點區(qū)域。本研究將東鄉(xiāng)野生稻中該差異表達的基因暫命名為LOC_Os11g35390-DX，并將該基因視為耐冷QTL的qCTS11.2基因的候選基因，擬通過半定量RT-PCR技術驗證該基因在東鄉(xiāng)野生稻冷脅迫前后表達量的變化，克隆以該基因為中心的上下游各延伸約1.2 kb的基因片段，并預測分析該基因的上游潛在功能順式元件，最后借助農桿菌介導的方法轉化冷敏感水稻受體品種明恢86。本研究結果可為后續(xù)東鄉(xiāng)野生稻耐冷基因在耐低溫脅迫功能中的研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

供試植物材料為東鄉(xiāng)野生稻，受體材料為冷敏感水稻品種明恢86，2種水稻材料均由筆者所在實驗室保存。大腸桿菌菌株DH5α、農桿菌菌株EHA105均購自北京全式金生物技術有限公司。植物表達載體pCAMBIA1300由筆者所在實驗室保存。

RNA抽提試劑盒，購自成都福際生物技術有限公司;高保真DNA聚合酶、Fast Pfu DNA聚合酶、RT-PCR試劑盒，均購自TransGen公司;質粒抽提試劑盒，購自OMEGA公司;限制性內切酶BamHⅠ、Kpn Ⅰ，購自Thermo公司;rTaq DNA聚合酶，購自TaKaRa公司。其余試劑均為國產(chǎn)或進口分析純級別。

1.2方法

1.2.1引物的設計根據(jù)Rice Genome Annotation Project（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）中公布的水稻LOC_Os11g35390基因及其上游序列信息，使用Primer 5.0軟件設計基因擴增引物35390-DX-F、35390-DX-R，參照外顯子序列設計半定量RT-PCR引物SQU-35390-F、SQU-35390-R，Tubulin-F、Tubulin-R為內參基因Tubulin的擴增引物，Hpt-F、Hpt-R為潮霉素抗性標記基因的擴增引物。

1.2.2熒光定量表達分析參照TIANGEN公司的Super Real PerMix Plus（SYBR Green）試劑盒操作方法說明，以SQU-35390-F、SQU-35390-R為引物，在StepOne PlusTM熒光定量PCR儀中進行實時熒光定量PCR擴增，用△△Ct分析方法評估基因的表達水平。將東鄉(xiāng)野生稻幼苗在常溫條件（28 ℃左右）下培養(yǎng)至4周左右后置于4 ℃冷藏柜中進行冷處理，以處理前的東鄉(xiāng)野生稻葉片樣本作為對照組，將東鄉(xiāng)野生稻于4 ℃冷處理1 d、2 d、3 d后的葉片樣本作為試驗組，以微管蛋白（Tublin）編碼基因作為內參基因，設置3次生物學重復和3次技術重復。

1.2.3遺傳轉化用農桿菌介導的轉化方法將構建好的植物表達載體pCAMBIA1300-35390-DX導入轉基因受體水稻品種明恢86中，在轉基因過程中，培養(yǎng)基的配制參照魏林艷[11]的方法。

1.2.4耐冷性的鑒定待來源于T0代轉基因株系的T1代水稻種子發(fā)芽后，將其置于盛有50 mg/L潮霉素溶液的培養(yǎng)皿（直徑為90 mm）中，進行約10 d的篩選培養(yǎng)，選擇生長不受抑制的T1代轉基因植株與同時進行發(fā)芽處理的受體明恢86植株（在盛有滅菌水的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)）移栽到同1個盛有泥土的塑料培養(yǎng)容器中（19 cm×13 cm×12 cm）。采用自然光照射，平均晝夜溫度為28 ℃至22 ℃，每天對幼苗澆水直至3～4葉期，而后將幼苗移栽至4 ℃的環(huán)境中，進行2～3 d的冷處理。復活10 d后分別統(tǒng)計野生型植株、轉基因植株的復活率（復活率=處理后復活幼苗數(shù)/幼苗總數(shù)×100%），試驗設3次重復。

1.2.5生物信息學分析用生物信息學軟件PlantCARE分析啟動子序列，預測其中存在的順式元件;用在線分析軟件SMART對基因編碼蛋白質的結構域進行預測分析;用DNAMAN進行氨基酸序列的多重比對和系統(tǒng)進化樹的構建。

2結果與分析

2.1QTL qCTS11.2位點候選基因LOC_Os11g35390-DX的確定

根據(jù)Mao等[10]公開的東鄉(xiāng)野生稻苗期耐冷QTL qCTS11.2位點最鄰近側翼標記的序列信息，在公共數(shù)據(jù)網(wǎng)站gramene（http：//ensembl.gramene.org/Tools/Blast）上對兩端側翼標記序列進行BLAST，以確認其在水稻染色體上的確切位置。隨后在Rice Genome Annotation Project網(wǎng)站（http：//rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice）上輸入這2個側翼標記序列的物理位置信息，并查閱該區(qū)段中的所有基因，與筆者所在課題組前期通過RNA-seq測序統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)的462個東鄉(xiāng)野生稻和OOP共有的與耐冷相關的差異表達基因進行比對，最終發(fā)現(xiàn)在462個低溫誘導的差異表達基因中有2個基因（LOC_Os11g31190-DX、LOC_Os11g35390-DX）位于qCTS11.2位點所處的染色體區(qū)段中，本研究選取的候選基因LOC_Os11g35390-DX正是其中之一。

2.2低溫脅迫下東鄉(xiāng)野生稻LOC_Os11g35390-DX基因的表達

在前期的研究中，筆者用RNA-seq技術對耐冷東鄉(xiāng)野生稻苗期冷處理前后的轉錄組進行分析發(fā)現(xiàn)，東鄉(xiāng)野生稻LOC_Os11g35390-DX基因的表達量在冷處理后顯著下調，僅為冷處理前表達量的13.4%。這一結果顯示，在東鄉(xiāng)野生稻中，低溫脅迫會誘導LOC_Os11g35390-DX基因表達量的下調。為了驗證這一結論，用實時熒光定量PCR對東鄉(xiāng)野生稻中的LOC_Os11g35390-DX基因在冷脅迫處理條件下的相對表達量進行分析。結果顯示，在連續(xù)冷脅迫處理3 d的過程中，東鄉(xiāng)野生稻中LOC_Os11g35390-DX基因的表達量表現(xiàn)出逐漸下調的趨勢;冷處理3 d后，該基因的表達量下降至冷處理前表達量的7.8%。

2.3東鄉(xiāng)野生稻LOC_Os11g35390-DX基因的克隆

對包含LOC_Os11g35390-DX基因及其上游、下游序列在內的共計4.5 kb的DNA片段進行PCR擴增。PCR擴增結果顯示，擴增出的特異性條帶與目的片段大小相符，約為4.5 kb。隨后用BamH I、Kpn I限制性內切酶雙酶切PCR擴增產(chǎn)物，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶，與同樣用BamH I、Kpn I限制性內切酶雙酶切后的表達載體pCAMBIA1300進行連接。通過Bam H I、Kpn I雙酶切鑒定重組克隆pCAMBIA1300-35390-DX，結果顯示，本研究獲得了1個陽性克隆，電泳所得大小約為9.0 kb的條帶是pCAMBIA1300載體片段，大小約為4.5 kb的條帶是目的基因片段。

2.4LOC_Os11g35390-DX蛋白結構域的分析及多重比對

通過對陽性克隆測序結果與公共數(shù)據(jù)庫中水稻品種日本晴測序結果對應位點的全長cDNA序列進行比對，推測該基因全長cDNA大小為993 bp，編碼330個氨基酸，使用生物信息學工具SMART對LOC_Os11g35390-DX蛋白氨基酸序列的保守結構域進行分析。結果顯示，東鄉(xiāng)野生稻LOC_Os11g35390-DX蛋白的N端有2個保守結構域SANT （SWI3， ADA2， N-CoR and TFIIIB DNA-binding domains），分別位于氨基酸序列第14～64號位點及第67～155號位點之間的區(qū)段，這一結構域是MYB轉錄因子典型的R2R3型保守結構域，表明東鄉(xiāng)野生稻的LOC_Os11g35390-DX基因屬于R2R3型MYB轉錄因子基因。從國家水稻數(shù)據(jù)中心網(wǎng)站（www.ricedata.com）上獲取其他已克隆的水稻R2R3型MYB轉錄因子的氨基酸序列，使用DNAMAN將東鄉(xiāng)野生稻LOC_Os11g35390-DX基因編碼的蛋白質氨基酸序列與其進行多重比較，結果顯示，東鄉(xiāng)野生稻LOC_Os11g35390-DX基因編碼的蛋白質氨基酸序列與OsJAMyb[12]、OsMYB2P-1[13]、OsMYB91[14]、OsMYB2[15]及OsMYB103[16]等R2R3型MYB轉錄因子基因編碼的蛋白質氨基酸序列存在30.98%的一致性。

2.5水稻MYB轉錄因子基因分子進化樹的構建

為了對東鄉(xiāng)野生稻LOC_Os11g35390-DX基因的功能進行初步預測，用DNAMAN軟件將該基因與19個已克隆的水稻MYB轉錄因子基因進行系統(tǒng)發(fā)育分析并構建進化樹。結果表明，LOC_Os11g35390-DX基因與Osmyb4基因[17]、OsMYB30基因[18]同源性最高，親緣關系最近;與水稻MYB1基因[19]、OsMYB6基因[20]的同源性最低，親緣關系最遠。

2.6重組質粒 pCAMBIA1300-35390-DX的遺傳轉化及T1代轉基因植株耐冷表型的鑒定

將轉入植物表達載體pCAMBIA1300-35390-DX的農桿菌菌株接種在含有50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平的LB固體平板上，培養(yǎng)2～3 d后侵染預備好的冷敏感水稻明恢86的愈傷組織，愈傷組織經(jīng)與農桿菌克隆共培養(yǎng)，潮霉素篩選培養(yǎng)，分化培養(yǎng)基上的光照分化培養(yǎng)及幼苗生根壯苗后，最終獲得24株轉入重組載體pCAMBIA1300-35390-DX的轉基因植株（圖1）。用潮霉素抗性標記基因部分序列的特異性引物Hpt-F、Hpt-R對經(jīng)潮霉素抗性篩選獲得的T0代轉基因水稻幼苗進行PCR擴增檢測。結果顯示，24個被檢測植株中都檢測到了目標條帶，陽性率為100%，說明本研究已經(jīng)獲得轉LOC_Os11g35390-DX基因的陽性株系。部分潮霉素抗性標記基因特異性引物的PCR檢測結果顯示，陽性樣本在900 bp左右有目標條帶，而野生型陰性對照無條帶。本研究同時對來源于T0代轉基因株系的T1代轉基因植株與野生型水稻植株進行了耐冷表型的比較鑒定，然而未發(fā)現(xiàn)T1代轉基因植株的耐冷性與野生型植株之間的耐冷性有明顯差異。

2.7LOC_Os11g35390-DX基因上游啟動子主要順式作用元件的分析預測

本研究用啟動子分析工具PlantCARE預測了LOC_Os11g3539-DX基因起始密碼子上游約1.2 kb啟動子序列中的主要順式作用功能元件。結果表明，該順式作用元件包含一些啟動子的基本元件，包括3個轉錄起始核心順式作用元件TATA-box位點、3個啟動子結構以及增強子結構中常見的順式作用元件CAAT-box位點。除了這些啟動子的基本元件外，上游啟動子序列還包含與非生物逆境脅迫有關的4個MYC轉錄因子結合順式作用元件和1個MYB轉錄因子結合順式作用元件，另外還攜帶一些與激素調控相關的作用元件，包括與茉莉酸信號通路相關的順式作用元件GGTCA-motif、TGACG-motif，與脫落酸響應信號通路相關的順式作用元件ABRE以及與生長素響應相關的順式作用元件TGA-element。

3討論

植物在生長發(fā)育過程中常受到各種逆境脅迫的影響，經(jīng)過漫長的進化過程，植物受到逆境脅迫后，通過自身基因轉錄、轉錄水平的調控，形成了完整的抗逆境脅迫體系[21]。由此可見，與植物抗逆境脅迫相關的基因常為脅迫誘導表達基因，通過自身轉錄或翻譯的變化，參與到植物抗逆境脅迫響應的機制中。通過QTL定位方法獲得的QTL在染色體上的長度范圍動輒達kb級，其中包含的基因數(shù)量巨大，無法實現(xiàn)基因的單獨克隆鑒定、表型分析等工作，而縮小QTL定位范圍又面臨找尋分子標記難度逐步加大、工作量繁雜等問題。本研究結合Mao等[10]公開的東鄉(xiāng)野生稻苗期耐冷QTL染色體位置信息，將低溫處理（4 ℃處理3 d）后在東鄉(xiāng)野生稻和OOP中都出現(xiàn)下調表達且同時落在QTL qCTS11.2位點所在區(qū)段的差異表達基因LOC_Os11g35390-DX作為東鄉(xiāng)野生稻qCTS11.2位點中的1個候選基因，由于水稻耐冷相關基因往往是冷誘導表達基因，這種將水稻耐冷基因QTL定位與冷脅迫處理前后轉錄組分析獲得的差異表達基因結合的基因克隆研究思路在很大程度上為耐冷QTL所在染色體區(qū)段候選基因的篩選提供了便利，有助于加快水稻耐冷基因的挖掘進程。

SMART在線分析軟件預測結果表明，東鄉(xiāng)野生稻LOC_Os11g35390-DX基因屬于典型的R2R3型MYB轉錄因子基因，MYB轉錄因子是植物中一類重要的轉錄因子，因其結構中存在高度保守的DNA結合區(qū)域（myb結構域）而得名。MYB轉錄因子家族具有廣譜作用，廣泛參與植物組織的形態(tài)建成、次生代謝、激素調控及信號轉導過程[22]。此外，在植物遭受非生物逆境脅迫時，MYB轉錄因子也通過調控下游基因的表達而參與生物應答。Liao等[23]將大豆GmMYB177基因轉入擬南芥，提高了擬南芥的耐旱性;Zhai等[24]報道，MYBC1轉錄因子可獨立于CBF通路負調控擬南芥的耐寒性。LOC_Os11g35390-DX基因編碼的氨基酸序列與其他已克隆的水稻R2R3型MYB轉錄因子氨基酸序列的比對結果表明，它們之間的氨基酸序列同源性較低，表明水稻R2R3型MYB轉錄因子之間差異較大，推測存在多個進化分支。通過構建分子進化樹發(fā)現(xiàn)，LOC_Os11g35390-DX基因與水稻R2R3型MYB基因Osmyb4、OsMYB30的親緣關系最近。有研究發(fā)現(xiàn)，過表達水稻Osmyb4基因顯著增強了擬南芥植株的抗寒性，同時，轉基因植株中部分參與低溫脅迫響應的基因表達量也發(fā)生了變化，表明水稻Osmyb4基因在植物響應低溫脅迫的信號傳導通路中起著開關作用[17]，而過表達OsMYB30基因的轉基因水稻植株卻呈現(xiàn)低溫脅迫敏感的表型[18]。以上結果表明，與LOC_Os11g35390-DX基因親緣關系較近的R2R3型MYB轉錄因子基因Osmyb4、OsMYB30在水稻應答低溫脅迫的正負調控中發(fā)揮了重要的調節(jié)作用。結合LOC_Os11g35390-DX基因受低溫誘導后表達量降低這一特性，推測LOC_Os11g35390-DX基因可能參與東鄉(xiāng)野生稻低溫脅迫應答的負調控過程。

通過在線分析軟件PlantCARE分析東鄉(xiāng)野生稻轉錄因子基因LOC_Os11g35390-DX的上游啟動子序列，結果顯示，在LOC_Os11g35390-DX基因的啟動子序列中，除了包含一些常見功能順式作用元件外，還存在MYB、MYC等兩類被廣泛報道參與植物非生物脅迫響應的基因表達調控網(wǎng)絡的轉錄因子結合位點。由此推測，在東鄉(xiāng)野生稻中，LOC_Os11g35390-DX基因作為1種MYB轉錄因子基因調節(jié)下游基因表達的同時，自身的表達也可能被上游MYB或MYC轉錄因子調控，推測其在東鄉(xiāng)野生稻低溫脅迫響應的基因表達調控網(wǎng)絡中起到中間信號傳遞的作用。另外，預測分析結果表明，在LOC_Os11g35390-DX基因啟動子上還分布著與脫落酸、茉莉酸及生長素等在植物響應逆境脅迫時發(fā)揮重要作用的植物激素信號通路相關聯(lián)的順式作用元件，表明該基因可能也參與了植物激素響應逆境脅迫的信號轉導途徑的基因表達調控。

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（責任編輯：徐艷）