裴徐梨 荊贊革 徐境 唐征 宋波

摘要：從青花菜中克隆得到一個(gè)Dof基因，命名為BoDof5.3。序列分析結(jié)果表明：該基因ORF全長(zhǎng)774 bp，編碼257個(gè)氨基酸，編碼的蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)。青花菜BoDof5.3蛋白具有典型的Zf-Dof結(jié)構(gòu)域，其二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲為主。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，青花菜BoDof5.3蛋白與甘藍(lán)、花椰菜Dof蛋白親緣關(guān)系最近，在進(jìn)化樹上聚為一組， 同屬植物的Dof蛋白具有較近的親緣關(guān)系。qRT-PCR分析結(jié)果顯示，在漬水脅迫0 d到2 d時(shí)，BoDof5.3基因表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，6 d時(shí)表達(dá)量升高為對(duì)照的1.3倍，推測(cè)該基因可能參與青花菜漬水脅迫的響應(yīng)。

關(guān)鍵詞：青花菜;Dof基因;基因克隆;漬水脅迫;表達(dá)特征

中圖分類號(hào)：S635.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2020）06-1498-05

Abstract：In this study， a Dof gene named BoDof5.3 was cloned from broccoli. Sequence analysis results showed that this gene was 774 bp in length， which encoded 257 amino acids. Furthermore， the protein encoded by this gene was a hydrophilic protein. The BoDof5.3 contained a typical Zf-Dof domain， and its main secondary structure was the random coil. Results of phylogenetic analysis indicated that the BoDof5.3 protein of broccoli had the highest homology with the Dof protein of cabbage and cauliflower， and they were clustered into a group on phylogenetic tree. Furthermore， the Dof protein in the same genus had close relationship. The results of qRT-PCR showed that the expression level of BoDof5.3 decreased from 0 d to 2 d under waterlogging stress， and the expression level at six days of waterlogging stress was 1.3 times as much as that of control. It is speculated that BoDof5.3 gene may be involved in the response of broccoli to waterlogging stress.

Key words：Brassica oleracea var. italica;Dof gene;gene clone;waterlogging stress;expression feature

Dof（DNA binding with one finger）是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，其在N-末端具有長(zhǎng)度為52 aa的Dof結(jié)構(gòu)域，可與DNA結(jié)合，同時(shí)還可進(jìn)行蛋白-蛋白互作。C-末端的可變結(jié)構(gòu)域可在不同的代謝途徑中產(chǎn)生多樣的調(diào)控功能[1-2]。目前Dof基因已在擬南芥、水稻、大豆、大麥、紅花、玉米等多種植物中成功克隆[3-8]。

前人研究發(fā)現(xiàn)，Dof基因廣泛參與碳氮代謝、開花、花和花粉發(fā)育、保衛(wèi)細(xì)胞特異基因的調(diào)控、防御反應(yīng)等多種生物學(xué)過(guò)程。在檉柳中，20個(gè)ThDof基因參與了脅迫應(yīng)答。過(guò)表達(dá)ThDof16基因可明顯提高植株抗干旱和高鹽脅迫 [9]。在鹽脅迫條件下，過(guò)表達(dá)紅花CtDof1基因可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)鹽脅迫的抗性[7]。Hennig等在研究擬南芥Dof蛋白OBP1時(shí)發(fā)現(xiàn)，該蛋白可通過(guò)調(diào)控谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶6的表達(dá)來(lái)對(duì)植物激素和脅迫信號(hào)作出響應(yīng)[10]。

青花菜（Brassica oleracea var.italica）與花椰菜、甘藍(lán)同屬甘藍(lán)類蔬菜，以小花蕾和嫩花莖為產(chǎn)品，營(yíng)養(yǎng)豐富。其喜溫暖濕潤(rùn)，但不耐澇。浙江省地處東部沿海，每年8-9月常受臺(tái)風(fēng)和特大暴雨影響，青花菜育苗和定植期間易遭淹水而大面積死苗，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。前期試驗(yàn)結(jié)果顯示BoDof5.3基因在高溫和鹽脅迫條件下表達(dá)量可發(fā)生較大變化。因此，本試驗(yàn)通過(guò)克隆青花菜BoDof5.3基因，并對(duì)其特性、同源進(jìn)化樹以及在漬水脅迫下的表達(dá)特征進(jìn)行分析，以期為研究該基因的功能及其參與漬水脅迫的應(yīng)答機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

以青花菜WN12-95為材料，種植于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)條件為25 ℃/16 h（白天）～18 ℃/8 h（晚上）。待植株長(zhǎng)至5葉期時(shí)開始對(duì)其進(jìn)行漬水脅迫處理，處理時(shí)間為0 d、2 d和6 d，每個(gè)處理設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2RNA的提取和cDNA的合成

葉片經(jīng)液氮冷凍后迅速研磨成粉末，用于RNA的提取?？俁NA提取使用TaKaRa Mini BEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒（TaKaRa公司產(chǎn)品），cDNA的合成采用Prime Script 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒（TaKaRa公司產(chǎn)品）。產(chǎn)物置于-80 ℃的超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

參考文獻(xiàn)：

[1]NOGUEROM， ATIF R M， OCHATT S， et al. The role of the DNA-binding one zinc finger （DOF） transcription factor family in plants [J]. Plant Science， 2013， 209（2）： 32-45.

[2]WU Z M， CHENG J W， CUI J J， et al. Genome-wide identification and expression profile of Dof transcription factor gene family in pepper （Capsicum annuum L.） [J]. Frontiers in Plant Science， 2016， 7： 164.

[3]YANAGISAWA S. The Dof family of plant transcription factors [J]. Trends in Plant Science， 2002， 7（12）： 555-560.

[4]LIJAVETZKY D， CARBONERO P， VICENTE-CARBAJOSA J. Genome-wide comparative phylogenetic analysis of the rice and Arabidopsis Dof gene families[J]. BMC Evolutionary Biology， 2003， 3（1）： 17.

[5]GUO Y， QIU L J. Genome-Wide analysis of the Dof transcription factor gene family reveals soybean-specific duplicable and functional characteristics[J]. PLoS One， 2013， 8（9）： e76809.

[6]MORENO-RISUENO M， MARTNEZ M， VICENTE-CARBAJOSA J. The family of DOF transcription factors： from green unicellular algae to vascular plants[J]. Molecular Genetics and Genomics， 2007， 277（4）： 379-390.

[7]陳笑. 紅花CtDof基因的克隆、表達(dá)分析及功能驗(yàn)證[D].長(zhǎng)春： 長(zhǎng)春師范大學(xué)， 2017.

[8]CHEN Y， CAO J. Comparative analysis of Dof transcription factor family in maize[J]. Plant Molecular Biology Reporter， 2015， 33（5）： 1245-1258.

[9]張凱敏. 檉柳Dof轉(zhuǎn)錄因子基因克隆及耐鹽功能分析[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)， 2014.

[10]HENNIG L， GRUISSEM W， GROSSNIKLAUS U. Transcriptional programs of early reproductive stages in Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2004， 135（3）：1765.

[11]裴徐梨，荊贊革，唐征，等. 青花菜花粉外壁蛋白基因的克隆與表達(dá)特征分析[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 2014， 33（5）： 1046-1052.

[12]劉俊，黃容，程占超，等. 毛竹PheDof4-1基因克隆及表達(dá)分析[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2017， 44（3）： 398-403.

[13]李小艷，裴徐梨，荊贊革，等. 青花菜肉桂酰輔酶A還原酶基因的克隆與表達(dá)特征分析[J].熱帶作物學(xué)報(bào)， 2016， 37（11）： 2199-2203.

[14]王旭明，趙夏夏，陳景陽(yáng)，等. 鹽脅迫下水稻孕穗期SS和SPS活性與糖積累的響應(yīng)及其相關(guān)性分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，34（3）：481-486.

[15]李愛，孫汪亮，李林，等. 外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下紫蘇幼苗生長(zhǎng)的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（2）：70-73.

[16]關(guān)曉溪，隋常玲，胡海軍，等. 弱光脅迫對(duì)煙草幼苗抗氧化系統(tǒng)及相關(guān)基因表達(dá)的影響[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2019， 50（5）：957-963.

[17]李暢，蘇家樂(lè)，劉曉青，等. 旱澇交替脅迫對(duì)杜鵑花生理特性的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2019，35（2）：412-419.

[18]孫永娣，巢建國(guó)，谷巍，等. 汞脅迫對(duì)茅蒼術(shù)光合特性及生理指標(biāo)的影響[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，49（3）：448-453.

[19]王霞霞，徐智明，朱德建，等. 5種抗生素對(duì)空心蓮子草根系發(fā)育的影響[J].雜草學(xué)報(bào)，2018，36（1）：8-13.

[20]曹睿哲，高世凱. 不同生育期旱澇交替脅迫對(duì)水稻產(chǎn)量及構(gòu)成的影響[J].排灌機(jī)械工程學(xué)報(bào)，2019，37（7）：639-644.

[21]李輝，黃蔚，劉志薇，等. 茶樹兩個(gè)Dof轉(zhuǎn)錄因子的分離及其在溫度脅迫中的響應(yīng)分析[J].茶葉科學(xué)， 2016， 36（3）： 312-322.

[22]CHEN Y， CAO J. Comparative analysis of Dof transcription factor family in maize[J]. Plant Molecular Biology Report， 2015， 33（5）： 1245-1258.

[23]CORRALES A R， NEBAUER S G， CARRILLO L， et al. Characterization of tomato cycling Dof factors reveals conserved and new functions in the control of flowering time and abiotic stress responses[J]. Journal of Experimental Botany， 2014， 65（4）： 995-1012.

[24]CAI X F， ZHANG Y Y， ZHANG C J， et al. Genome-wide analysis of plant-specific Dof transcription factor family in tomato[J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2013， 55（6）： 552-566.

[25]江海洋，駱晨，江騰，等. 玉米Dof轉(zhuǎn)錄因子家族基因的全基因組分析[J]. 生物信息學(xué)， 2010， 8（3）; 198-201.

[26]SHAW L M， MCINTYRE C L， GRESSHOFF P M， et al. Members of the Dof transcription factor family in Triticum aestivum are associated with light-mediated gene regulation[J]. Functional & Integrative Genomics， 2009（9）： 485-498.

[27]MA J， LI M Y， WANG F， et al. Genome-wide analysis of Dof family transcription factors and their responses to abiotic stresses in Chinese cabbage[J]. BMC Genomics， 2015， 16： 33.

[28]HUANG W， HUANG Y， LI M. Dof transcription factors in carrot： genome-wide analysis and their response to abiotic stress [J]. Biotechnology Letters， 2016， 38： 145.

（責(zé)任編輯：張震林）