郝文文 楊倩倩 張貝 張健 張傳生 耿立英 李祥龍

摘? 要：旨在篩選雞BCO2基因中具有潛在生物學(xué)功能的同義單核苷酸多態(tài)性（non-synonymous single nucleotide polymorphisms，nsSNPs）。從SNP數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索出8個(gè)BCO2 基因nsSNPs，利用SIFT、PolyPhen-2、PANTHER和PROVEAN方法分析引起的氨基酸替換是否可能影響B(tài)CO2 的功能預(yù)測(cè)。進(jìn)一步對(duì)雞BCO2基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行翻譯后修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)以及進(jìn)化位點(diǎn)保守性預(yù)測(cè);使用SWISS-MODEL構(gòu)建了BCO2野生型以及突變型蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：3個(gè)nsSNPs（rs739117331、rs735703078和rs736211538）可能嚴(yán)重影響B(tài)CO2蛋白功能。

關(guān)鍵詞：雞;BCO2基因;非同義SNP;SNP功能預(yù)測(cè);蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)建中圖分類號(hào)：S831? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B? ? ?文章編號(hào)：1673-1085（2019）04-0017-05

非同義單核苷酸多態(tài)性（nsSNPs）是指處于編碼區(qū)可引起氨基酸序列變化的單核苷酸突變，因其可能會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)功能造成影響，多被認(rèn)為是導(dǎo)致畜禽表型變異的重要原因[1，2]。利用生物信息學(xué)方法對(duì)未知表型的nsSNP進(jìn)行功能性預(yù)測(cè)，是一種篩選候選功能位點(diǎn)的理想策略，目前已有諸多成功的研究報(bào)道[3-6]。BCO2基因（Beta-carotene 9′，10′-monooxygenase，BCO2）編碼的β-胡蘿卜素加氧酶2在動(dòng)物體內(nèi)類胡蘿卜素的代謝過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[7]。雞皮膚表現(xiàn)出黃色主要是由于表皮層類胡蘿卜素沉積的結(jié)果，類胡蘿卜素被降解，雞皮膚呈現(xiàn)白色。研究發(fā)現(xiàn)，雞BCO2基因的一個(gè)G/A突變位點(diǎn)（chr24：6268434bp）與黃皮膚性狀存在著連鎖關(guān)系，且該基因在黃色皮膚組織中的表達(dá)量顯著低于白色皮膚組織[8]。還發(fā)現(xiàn)，在綿羊、家兔等動(dòng)物的黃脂肪性狀也與BCO2基因編碼區(qū)的突變有關(guān)[9-11]，這提示BCO2基因突變可以造成它介導(dǎo)類胡蘿卜素降解的功能發(fā)生改變。本研究對(duì)利用生物信息技術(shù)對(duì)雞BCO2基因編碼區(qū)nsSNPs進(jìn)行分析，篩選其中候選功能性錯(cuò)義突變位點(diǎn)，為后續(xù)的表型關(guān)聯(lián)分析和雞皮膚顏色的分子遺傳育種提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? BCO2基因nsSNPs的搜集? 以BCO2基因的序列號(hào)（ENSGALG00000007868）從Ensembl genome browser（http：//asia.ensembl.org）中進(jìn)行檢索，確定各SNPs在基因中的位置（外顯子區(qū)、內(nèi)含子區(qū)、啟動(dòng)子區(qū)域等），篩選出位于編碼區(qū)的nsSNPs。

1.2? NsSNPs對(duì)BCO2基因功能的影響? 應(yīng)用4種預(yù)測(cè)方法SIFT（http：//blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html）[12]、PolyPhen-2（http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2）[13]、PANTHER（http：//pantherdb.org/tools/csnpScoreForm.jsp）[14]和PROVEN（http：//provean.jcvi.org/seq_submit.php）[15]軟件分析各nsSNP對(duì)進(jìn)行BCO2蛋白功能的影響。

1.3? 進(jìn)化保守位點(diǎn)分析? 利用在線服務(wù)器ConSurf（http：//consurftest.tau.ac.il）[16]分析BCO2蛋白氨基酸位點(diǎn)的進(jìn)化保守水平。越保守位點(diǎn)發(fā)生變異越可能造成功能或結(jié)構(gòu)上的影響。

1.4? 翻譯后修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)? 分別利用BDM-PUB（http：//bdmpub.biocuckoo.org/）和NetPhos 2.0（http：//gps.biocuckoo.org/）[17]在線軟件預(yù)測(cè)BCO2蛋白質(zhì)氨基酸泛素化修飾位點(diǎn)和預(yù)測(cè)磷酸化修飾位點(diǎn)。

1.5? 蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析? 利用I-Mutant 2.0（http：//gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/I-Mutant2.0/I-Mutant2.0.cgi）[18]在線軟件評(píng)估nsSNP引起的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的改變。在評(píng)估結(jié)果中，DDG為自由能變化值，DDG<0表示此nsSNP降低了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，DDG>0表示此nsSNP增加了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，-0.05≤DDG≤0.05表示蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性變化為中性。RI（Reliability Index）為可靠性指數(shù)，范圍在0～10。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 雞BCO2基因nsSNPs的篩選結(jié)果? 從SNP數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢索到BCO2基因兩個(gè)轉(zhuǎn)錄子：

BCO2-201（ENSGALT00000043097）;

BCO2-202（ENSGALT00000012775）。

8個(gè)nsSNPs，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2? 雞BCO2基因有害nsSNPs預(yù)測(cè)結(jié)果? 采用SIFT、PolyPhen-2、PANTHER和PROVEN四種方法在BCO2-201分別預(yù)測(cè)到4個(gè)、5個(gè)、3個(gè)和3個(gè)有害突變，在BCO2-202分別預(yù)測(cè)到4個(gè)、4個(gè)、3個(gè)和3個(gè)有害突變。其中rs736211538、rs735703078在兩個(gè)轉(zhuǎn)錄子、BCO2-201的rs739117331和BCO2-201的rs736989374均至少三種方法預(yù)測(cè)為有害位點(diǎn)。

2.3? 進(jìn)化保守位點(diǎn)分析? 利用在線服務(wù)器ConSurf預(yù)測(cè)BCO2基因的進(jìn)化保守位點(diǎn)，分?jǐn)?shù)在7～9之間的位點(diǎn)為進(jìn)化保守性位點(diǎn)。如表2所示，在BCO2編碼的多肽鏈氨基酸序列中，與多態(tài)位點(diǎn)一致的保守性位點(diǎn)共有3個(gè)，分別為rs739117331、rs735703078和rs736211538，這3個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性更容易對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能造成影響。

2.4? 翻譯后修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)? 本研究利用BDM-PUB在線軟件預(yù)測(cè)泛素化修飾位點(diǎn)，利用NetPhos 2.0預(yù)測(cè)磷酸化修飾位點(diǎn)（表3）。結(jié)果，與BCO2蛋白多態(tài)位點(diǎn)一致的泛素化修飾位點(diǎn)為K416，磷酸化修飾位點(diǎn)為S535。

2.5? 蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析? 利用I-Mutant2.0評(píng)估nsSNP引起的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響（見(jiàn)表4），可見(jiàn)BCO2-202中除D510E和K416N使蛋白質(zhì)穩(wěn)定性升高，其他位點(diǎn)多態(tài)性均使得蛋白質(zhì)穩(wěn)定性下降;BCO2-201中除D354A和K260N使蛋白質(zhì)穩(wěn)定性升高，其他位點(diǎn)多態(tài)性均使得蛋白質(zhì)穩(wěn)定性下降。

2.6? 蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)建模? 利用在線建模服務(wù)器SWISS-MODEL為雞BCO2-201和BCO2-202兩個(gè)轉(zhuǎn)錄子蛋白質(zhì)突變體建模，并利用軟件PyMOL將功能性錯(cuò)義突變分別定位到BCO2-201（圖1A）和BCO2-202（圖1B）蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)。

3? 討論與結(jié)論

本研究通過(guò)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能特性這個(gè)角度驗(yàn)證雞的BCO2基因編碼區(qū)中的nsSNPs是否有害。首先，從Ensembl檢索到BCO2基因編碼區(qū)8個(gè)nsSNPs，并用四款軟件對(duì)其進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，初步篩選出候選的有害nsSNPs;同時(shí)，本研究又從蛋白質(zhì)翻譯后修飾以及氨基酸位點(diǎn)進(jìn)化保守水平的角度對(duì)候選nsSNPs潛在生物學(xué)功能進(jìn)行評(píng)估。在發(fā)現(xiàn)的8個(gè)nsSNPs中，其中D371A被4個(gè)方法均預(yù)測(cè)為有害突變;進(jìn)化保守性預(yù)測(cè)結(jié)果也顯示D371屬于高度保守，這意味著該位點(diǎn)對(duì)BCO2功能正常發(fā)揮十分重要。因此D371A在BCO2所有的nsSNPs中危害最大，相應(yīng)的多態(tài)位點(diǎn)為功能性位點(diǎn)。另外，位點(diǎn)S535A為磷酸化修飾位點(diǎn)，它可破壞影響蛋白質(zhì)之間的信號(hào)傳導(dǎo)致使蛋白質(zhì)功能不能正常發(fā)揮，加之有3個(gè)方法均預(yù)測(cè)S535A為有害突變，同時(shí)S535還是保守性位點(diǎn)，所以S535A為第2個(gè)功能位點(diǎn)。第3個(gè)候選功能位點(diǎn)為T331P，該位點(diǎn)也被3個(gè)nsSNPs功能預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)為有害突變，且該位點(diǎn)也是進(jìn)化保守性位點(diǎn)，因此不可忽視該突變對(duì)BCO2蛋白質(zhì)功能的影響;最后，雖然K416為泛素化修飾位點(diǎn)，該位點(diǎn)突變可能通過(guò)影響蛋白質(zhì)合成后的泛素化過(guò)程，破致使蛋白質(zhì)功能不能正常發(fā)揮，但4種軟件對(duì)K416N的預(yù)測(cè)結(jié)果均為中性，因此該突變有待進(jìn)一步研究。

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基金項(xiàng)目：河北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：ZD2018225），河北科技師范學(xué)院博士啟動(dòng)基金（項(xiàng)目編號(hào)：2018YB002），河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系蛋雞產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)崗位項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：HBCT2013090206）。

作者簡(jiǎn)介：郝文文（1996-），女，研究生在讀，研究方向?yàn)榧仪葸z傳育種，E-mail：794911295@qq.com。

通訊作者：張傳生（1976-），男，寧陽(yáng)縣人，教授，主要從事動(dòng)物遺傳育種的研究。E-mail：cszhang1976@126.com。